Il nostro protocollo dimostra un flusso di lavoro preclinico completo per testare l'efficacia terapeutica delle cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo dopo una lesione cerebrale. Questo modello di lesione cerebrale traumatica fornisce un alto grado di versatilità e riproducibilità controllando strettamente i parametri della forza meccanica e fornendo quindi una lesione ben definita. Queste procedure possono essere utilizzate per studiare i processi di lesione e recupero in altre regioni cerebrali e il metodo di trapianto è suscettibile di utilizzo con molti tipi di cellule.
La perforazione craniciale è impegnativa in quanto la tecnica richiede destrezza manuale per padroneggiare la pressione, la velocità, la profondità e i movimenti fluidi appropriati. Documenta tutti gli eventi e pratica ampiamente. Per eseguire una craniectomia unilaterale, confermare la mancanza di risposta al dito del piedi nel mouse anestetizzato e fissare il mouse in un telaio stereotassico.
Applicare un unguento oftalmico antibiotico agli occhi con un batuffolo di cotone sterile e una soluzione a base di iodio sulla zona del cuoio capelluto rasato. Rimuovere lo iodio con il 70% di etanolo e coprire l'animale con un drappo chirurgico fenestrato. Fare un'incisione della linea mediana da 1,5 a due centimetri sul cuoio capelluto e utilizzare tamponi di cotone sterili per pulire la ferita e cancellare la fascia sinistra della linea mediana al bregma.
Utilizzate una sonda di impatto per identificare il sito di craniectomia e impostate la x uguale a zero, y è uguale a zero punto di riferimento stereotassico a bregma. Regolare la sonda lateralmente a due millimetri a sinistra della linea mediana. Utilizzare un pennarello finemente sicuro chirurgicamente per indire un cerchio di diametro di cinque millimetri intorno all'area di impatto presuntiva.
Sollevare e ruotare il riflettore fuori posizione e completare il cerchio di cinque millimetri. Riportare brevemente il riflettore in posizione per verificare la precisione del cerchio di cinque millimetri. Quindi sollevare e ruotare il riflettore fuori posizione e utilizzare uno strumento a mano a micromotore rotante ad alta velocità dotato di una punta rotonda da 0,6 o 0,8 millimetri per fare un foro aperto nel cranio a una velocità massima dal 70 all'80%.
Applicare una leggera pressione sul cranio durante la perforazione lungo il contorno circonferenziale di cinque millimetri all'interno di questo bordo e utilizzare le forcep per sollevare il lembo osseo risultante. La perforazione attraverso le linee di sutura può presentare ulteriori difficoltà in quanto l'osso viene interrotto e richiede ulteriore pressione. I vasi sanguigni possono essere in stretta associazione e quindi sono probabili eventi sanguinanti.
Per indurre una lieve lesione da impatto corticale controllato, pulire la sonda del dispositivo di impatto con un tampone sterile per la preparazione dell'alcol e spostare la sonda del dispositivo di impatto in posizione sopra la corteccia esposta. Abbassare la sonda fino a tocchi la superficie dura mater e contrassegnare questa posizione come z uguale a zero. Ritirare il pistone e passare a z è uguale a meno un millimetro e scaricare il pistone per influire sulla corteccia.
Sollevare immediatamente il pistone e spostare il braccio fuori posizione e irrigare la corteccia con un generoso volume di salina e utilizzare semplici punti interrotti e sutura di seta 5-0 per chiudere l'incisione del cuoio capelluto. Quindi consegnare 10 milligrammi per chilogrammo di ciclosporina A per iniezione sottocutanea nel collotto e posizionare il mouse in una gabbia post-operatoria pulita pre-riscaldata con monitoraggio fino al pieno recupero. Circa 24 ore dopo la craniectomia, riposizionare il mouse nel telaio stereotassico.
Coprire il mouse con il drappo chirurgico fenestrato. Lavare il sito di incisione con soluzione salina sterile per pulire il sito e allentare le suture. Utilizzare un batuffolo di cotone imbevuto di etanolo al 70% per sterilizzare delicatamente il sito di incisione e utilizzare pinzette sottili e forbici oftalmiche per rimuovere le suture.
Quindi irrigare l'intervento chirurgico e il sito di craniectomia con abbondante soluzione salina sterile. In una cappa di biosicurezza in coltura cellulare, ruotare delicatamente o toccare il tubo delle cellule per garantire una sospensione cellulare omogenea. Utilizzare una micropipetta per caricare circa 7,5 microlitri di cellule in una siringa Hamilton attraverso l'estremità dello stantuffo.
Tenendo la siringa con un angolo di 120 gradi con l'estremità dello stantuffo rivolta verso il basso, inserire lo stantuffo facendo attenzione a non introdurre una bolla d'aria tra la sospensione e la punta dello stantuffo. Attaccare l'assieme della guarnizione all'ago della pipetta e attaccare l'ago alla siringa. Spingere lo stantuffo per spostare la sospensione cellulare nell'ago della pipetta e attaccare la siringa alla pompa della siringa stereotassica.
Far avanzare lo stantuffo per assicurarsi che l'assemblaggio della pompa della siringa funzioni correttamente e spostare l'ago nelle coordinate per l'iniezione. Allineare la punta dell'ago al bregma e impostare le coordinate x e y su zero. Spostare la punta dell'ago sulla craniectomia a due millimetri laterali e meno un millimetro posteriore a bregma e toccare la punta dell'ago sulla superficie dura mater.
Sollevare leggermente l'ago, quindi fare una piccola incisione nella dura mater nel punto in cui l'ago ha preso contatto. Impostare la coordinata stereotassica su z uguale a zero e spingere lo stantuffo per confermare che la sospensione cellulare scorre adeguatamente prima di introdurre l'ago nel cervello. Introdurre l'ago nel cervello a una profondità di z uguale a meno 1,4 millimetri per posizionare l'innesto al bordo della materia grigia / materia bianca della corteccia profonda.
Avviare la pompa della siringa per infondere la sospensione cellulare per un periodo di 15 minuti. Utilizzare un microscopio a lunga distanza di lavoro per monitorare il deflusso delle sospensioni cellulari che irriga il sito chirurgico con soluzione salina sterile durante l'iniezione per mantenere l'idratazione dei tessuti. Quando tutte le cellule sono state consegnate, ritirare lentamente l'ago del trapianto e irrigare il sito di intervento chirurgico con soluzione salina aggiuntiva prima di chiudere l'incisione con nuove suture.
Quindi fornire assistenza post-operatoria come dimostrato. Per un test di rimozione del nastro adesivo, utilizzare prima un piccolo coltello da barba per tagliare pezzi gialli e rossi di nastro elettrico in tre strisce di cinque millimetri su una superficie di vetro liscia. Portare i topi nella sala prove comportamentale per almeno 30 minuti prima del test e utilizzare un panno di manipolazione per trattenere il mouse per la collotta del collo e della schiena in modo che il mouse trattiene le sopracciglia lontano dal corpo e dalla testa.
Utilizzare una pinzetta per posizionare una striscia adesiva sulla superficie plantare di ogni zampa anteriore e utilizzare una pressione delicata e costante delle dita per fissare le strisce alle zampe. Posizionare rapidamente il mouse in un cilindro di plastica e iniziare due cronometri quando il mouse ha tutte e quattro le zampe sulla scatola di prova in plastica. Quindi usa i due cronometri per registrare le latenze per l'avviso della zampa sinistra, la rimozione della zampa sinistra, l'avviso della zampa destra e la rimozione della zampa destra.
In questo esperimento pilota, la funzione dell'avanzino è stata confrontata solo nella craniectomia, nella lesione da impatto corticale controllato e nei topi ingenui. I topi sottoposti a intervento chirurgico hanno mostrato latenze transitori aumentate per notare stimoli adesivi per uno o tre giorni immediatamente dopo l'intervento chirurgico e deficit post-operatori transitori nella rimozione dell'adesivo dalla forepaw ipsilaterale. I topi che hanno subito un impatto corticale controllato, tuttavia, hanno mostrato notevoli deficit nelle prestazioni motorie nel contralaterale della forepaw alla lesione rispetto ai topi ingenui del giorno post-operatorio 28.
L'immunostaining delle sezioni cerebrali del topo per l'antigene nucleare umano rivela che gli innesti cellulari umani possono essere chiaramente distinti dai tessuti ospiti nelle lesioni SHAM e nei cervelli ad impatto corticale controllato. È necessario osservare le procedure standard di sicurezza di laboratorio quando si maneggiano cellule umane coltivate e quando si maneggiano aghi per siringhe che entrano in contatto con roditori o farmaci immunosoppressivi. Le sezioni del tessuto cerebrale possono essere analizzate per l'espressione di marcatori neuroinfiammatori in quanto è prezioso sapere come l'innesto influisce sulla risposta alle lesioni del tessuto ospite e viceversa.
Siamo rimasti sorpresi di trovare sottili differenze di sesso negli esiti del comportamento post-infortunio. Ora stiamo studiando se il sesso gioca un ruolo nella risposta neuroimmune alle lesioni cerebrali. Mani ferme, pazienza e pratica sono cruciali per sviluppare una buona tecnica di craniectomia.
I danni collaterali causati da una craniectomia impropria possono compromettere l'area che si desidera prendere di mira per il trapianto di cellule.
