L&#39;impianto in imaging in vivo presso l&#39;Imperial College è stata finanziata dal MRC.

<ol>
	<li>Chang, M. H., Cirillo, S. L., Cirillo, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Luciferase+to+Image+Bacterial+Infections+in+Mice.">Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice.</a> J. Vis. Exp. (48), e2547 (2011).</li><li>Wiles, S., Pickard, K. M., Peng, K., MacDonald, T. T., Frankel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+bioluminescence+imaging+of+the+murine+pathogen+Citrobacter+rodentium.">In vivo bioluminescence imaging of the murine pathogen Citrobacter rodentium.</a> Infect Immun. 74, 5391-5396 (2006).</li><li>Wiles, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+specificity,+colonization+and+clearance+dynamics+in+vivo+following+oral+challenges+with+the+murine+pathogen+Citrobacter+rodentium.">Organ specificity, colonization and clearance dynamics in vivo following oral challenges with the murine pathogen Citrobacter rodentium.</a> Cell Microbiol. 6, 963-972 (2004).</li><li>Wiles, S., Dougan, G., Frankel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+a+'hyperinfectious'+bacterial+state+after+passage+of+Citrobacter+rodentium+through+the+host+gastrointestinal+tract.">Emergence of a 'hyperinfectious' bacterial state after passage of Citrobacter rodentium through the host gastrointestinal tract.</a> Cell Microbiol. 7, 1163-1172 (2005).</li><li>Fanning, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bifidobacterial+surface-exopolysaccharide+facilitates+commensal-host+interaction+through+immune+modulation+and+pathogen+protection.">Bifidobacterial surface-exopolysaccharide facilitates commensal-host interaction through immune modulation and pathogen protection.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 2108-2113 (2012).</li><li>Doyle, T. C., Burns, S. M., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+bioluminescence+imaging+for+integrated+studies+of+infection.">In vivo bioluminescence imaging for integrated studies of infection.</a> Cell Microbiol. 6, 303-317 (2004).</li><li>Collins, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-treatment+with+Bifidobacterium+breve+UCC2003+modulates+Citrobacter+rodentium-induced+colonic+inflammation+and+organ+specificity+of+infection.">Pre-treatment with Bifidobacterium breve UCC2003 modulates Citrobacter rodentium-induced colonic inflammation and organ specificity of infection.</a> Microbiology. , 10-1099 (2012).</li><li>Contag, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photonic+detection+of+bacterial+pathogens+in+living+hosts.">Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts.</a> Mol. Microbiol. 18, 593-603 (1995).</li><li>Hardy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+replication+of+Listeria+monocytogenes+in+the+murine+gall+bladder.">Extracellular replication of Listeria monocytogenes in the murine gall bladder.</a> Science. 303, 851-853 (2004).</li><li>Szittner, R., Meighen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+sequence,+expression,+and+properties+of+luciferase+coded+by+lux+genes+from+a+terrestrial+bacterium.">Nucleotide sequence, expression, and properties of luciferase coded by lux genes from a terrestrial bacterium.</a> J. Biol. Chem. 265, 16581-16587 (1990).</li><li>Andreu, N., Fletcher, T., Krishnan, N., Wiles, S., Robertson, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+measurement+of+antituberculosis+drug+activity+in+vitro+and+in+macrophages+using+bioluminescence.">Rapid measurement of antituberculosis drug activity in vitro and in macrophages using bioluminescence.</a> J. Antimicrob. Chemother. 67, 404-414 (2012).</li><li>Kuo, C., Coquoz, O., Troy, T. L., Xu, H., Rice, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+in+vivo+bioluminescent+sources+based+on+multispectral+imaging.">Three-dimensional reconstruction of in vivo bioluminescent sources based on multispectral imaging.</a> J. Biomed. Opt. 12, 024007 (2007).</li><li>Cronin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+in+vivo+bioluminescent+imaging+for+the+study+of+bacterial+tumour+targeting.">High resolution in vivo bioluminescent imaging for the study of bacterial tumour targeting.</a> PLoS One. 7, e30940 (2012).</li><li>Mundy, R., MacDonald, T. T., Dougan, G., Frankel, G., Wiles, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Citrobacter+rodentium+of+mice+and+man.">Citrobacter rodentium of mice and man.</a> Cell Microbiol. 7, 1697-1706 (2005).</li><li>Curtis, A., Calabro, K., Galarneau, J. R., Bigio, I. J., Krucker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+variations+of+skin+pigmentation+in+C57BL/6+mice+affect+optical+bioluminescence+quantitation.">Temporal variations of skin pigmentation in C57BL/6 mice affect optical bioluminescence quantitation.</a> Mol. Imaging Biol. 13, 1114-1123 (2011).</li><li>Wiles, S., Crepin, V. F., Childs, G., Frankel, G., Kerton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+biophotonic+imaging+as+a+training+aid+for+administration+of+substances+in+laboratory+rodents.">Use of biophotonic imaging as a training aid for administration of substances in laboratory rodents.</a> Lab Anim. 41, 321-328 (2007).</li><li>Crepin, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+role+of+the+Tir:Nck+and+Tir:IRTKS/IRSp53+signalling+pathways+in+vivo.">Dissecting the role of the Tir:Nck and Tir:IRTKS/IRSp53 signalling pathways in vivo.</a> Mol. Microbiol. 75, 308-323 (2010).</li><li>Willekens, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+radiation+dose+in+micro-CT+with+optimization+of+the+scan+protocol.">Evaluation of the radiation dose in micro-CT with optimization of the scan protocol.</a> ContrastMedia Mol. Imaging. 5, 201-207 (2010).</li><li>Boone, J. M., Velazquez, O., Cherry, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-animal+X-ray+dose+from+micro-CT.">Small-animal X-ray dose from micro-CT.</a> Mol Imaging. 3, 149-158 (2004).</li><li>Sato, F., Sasaki, S., Kawashima, N., Chino, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Late+effects+of+whole+or+partial+body+x-irradiation+on+mice:+life+shortening.">Late effects of whole or partial body x-irradiation on mice: life shortening.</a> Int. J. Radiat. Biol. Relat. Stud. Phys. Chem. Med. 39, 607-615 (1981).</li><li>Kohn, H. I., Kallman, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+strain+on+acute+x-ray+lethality+in+the+mouse.+II.+Recovery+rate+studies.">The influence of strain on acute x-ray lethality in the mouse. II. Recovery rate studies.</a> Radiat. Res. 6, 329-338 (1957).</li></ol>

Produzione e libero accesso a questo articolo è sponsorizzato da PerkinElmer. Gli autori Kevin P, Francesco, Jeff Meganck e Chaincy Kuo sono dipendenti di Pinza-A PerkinElmer Company. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le procedure scientifiche Animals Act 1986 e sono state approvate dal comitato etico locale.

Il film 4D di infezione batterica fornisce un utile strumento per visualizzare e interpretare grandi quantità di dati di immagini in multimodalità modo rapido e semplice. Questa tecnica facilita l&#39;analisi dettagliata di come una infezione diffonde attraverso un individuo mouse e può essere usato per studiare come ospite o delezione di geni batterici o particolare intervento strategie effetto carica batterica, distribuzione e localizzazione durante uno studio longitudinale 7. Questi video offrono anche strumenti didattici utili e strumento di diffusione delle informazioni al pubblico. Ci sono diversi passaggi critici in questo protocollo che potrebbero influenzare la qualità dei dati ottenuti da DLIT-μCT imaging e la possibilità di compilare un video 4D di infezione. La parte più importante di questo protocollo è l&#39;infezione di successo e omogenea di topi con C. rodentium. E &#39;essenziale che i topi utilizzati per lo studio sono tra 18-20 g, e che il bacteinoculums rial sono preparati al momento e di circa 5 x 10 9 cfu, come descritto in precedenza 2,3. Prima dell&#39;infezione dei topi, è importante controllare che l&#39;inoculo è bioluminescente usando l&#39;Spectrum TC e una volta che l&#39;inoculo è stato preparato, esso deve essere continuamente omogeneizzata prima di ogni topo è gavaged per assicurare che i topi ricevono dosi infettive simili. La formazione immagine DLIT-μCT di topi è stato ottimizzato in modo che la funzione di esposizione automatica in Living software 4.3.1 Immagine determina automaticamente i parametri di imaging ottimizzati per il segnale di essere ben al di sopra del rumore. Tuttavia, la funzione di esposizione automatica si basa su impostazioni definite dall&#39;utente ei parametri che devono essere modificati come descritto nella procedura. In caso contrario, questo si tradurrà in immagini povere, con un basso numero di fotoni raccolti che non si traduca in una progressione evidente l&#39;infezione, come sono programmate le impostazioni di fabbrica della Spectrum CT per esposizione automatica per i tumori di imaging espressionelucciola luciferasi. Ricostruzioni eseguite utilizzando 560-620 nm danno il miglior accordo tra i dati simulati e misurati e, pertanto, sono i dati più affidabili per includere nella ricostruzione. Una limitazione all&#39;uso di DLIT-μCT è che le radiazioni ionizzanti dalla scansione μCT provoca danni da radiazioni sub-letale che &#39;cumulativo in uno studio longitudinale 18. Esposizione a radiazioni sub-letale può indebolire la risposta immunitaria, causare danni al DNA e apoptosi in organi interni 19. In definitiva, i danni da radiazione sub-letali cumulativo può causare la morte se il DL 50/30 per le radiazioni ionizzanti è superato, che è tra i 5-7 Gy a seconda del ceppo del mouse e l&#39;età dei topi utilizzati 18,20,21. Anche se alcuni dei danni molecolari dalle radiazioni ionizzanti può guarire, in quanto il principio generale è quello di stimare la dose conservativamente, questo non è in genere rappresentato nella pianificazione studio. Invece, l&#39;obiettivo è quello di rimanere il più below questi limiti possibile, pur compiendo gli obiettivi di studio. Ciò è particolarmente importante in questo studio perché la normale risposta immunitaria all&#39;infezione, la frequenza delle immagini, e il fatto che transgenico, immuno-composto, o fortemente infettati animali può essere più suscettibile a radiazioni ionizzanti. Pianificare l&#39;esperimento per generare un film 4D di infezione, è importante considerare la durata dell&#39;esperimento, il numero di scansioni μCT richiesto durante questo periodo e la DL 50/30 per la radiazione ionizzante per il ceppo mouse utilizzato. Un altro limite potenziale DLIT-μCT è la forza dell&#39;espressione giornalista all&#39;interno del ceppo batterico utilizzato, come questo influirà limiti di rivelazione batteriche e tempi di imaging. E &#39;altamente raccomandato che i ricercatori utilizzano convalidati ceppi batterici che sono completamente virulento, ma ottimizzato per la massima espressione operone lux, come dimostrato in precedenza per BLI2,3. Un avvertimento per il design attuale del imaging 4D è che ogni film è composto da singole scansioni DLIT-μCT che hanno diversa scalatura fotone. Questo può rendere le immagini di difficile interpretazione se le modifiche alla localizzazione del BL focolai, o la sua intensità sono sottili, o se c&#39;è un fuoco intenso BL circondato da focolai multipli debole. Pertanto, per visualizzazioni longitudinali, è importante mantenere le barre di colore coerente di tutti i punti di tempo. Il concetto di un film 4D di infezione può essere applicato a qualsiasi agente patogeno batterico opportunamente etichettato. Il futuro sviluppo di questa tecnica avrà lo scopo di utilizzare la tomografia imaging di fluorescenza (FLIT), così come DLIT per facilitare la ricerca di risposte dell&#39;ospite alle infezioni utilizzando una combinazione di agenti patogeni batterici bioluminescenti e iniettabili fluorescenti vicino i raggi infrarossi per indagare risposta dell&#39;ospite alle infezioni. , Abbiamo solo Oltre a questo in questo protocollodescrivere l&#39;uso di batteri bioluminescenti per creare 4D film di infezione. Tuttavia, in alcuni casi, può essere necessario utilizzare fluorescenti batteri etichettati, per esempio con i tag IRFP, in modo che il reporter bioluminescenza può essere usato per studiare la genetica ospitanti durante l&#39;infezione. È importante sottolineare che l&#39;uso di immagini multi-modalità che combina DLIT / FLIT-μCT ci permetterà di studiare in modo non invasivo più parametri nel corso di una infezione batterica, che contribuirà in modo significativo alla riduzione, perfezionamento, e di sostituire l&#39;uso degli animali nella ricerca scientifica come delineato nella iniziativa del NC3R ( <a href="http://www.nc3rs.org.uk/" target="_blank">http://www.nc3rs.org.uk/</a> ).

Modelli piccoli animali, in particolare quelle che utilizzano topi, sono abitualmente utilizzati per studiare la patogenesi batterica o per testare le strategie di intervento per le infezioni, come gli antibiotici, probiotici, prebiotici e vaccini 1-7. I principali letture sperimentali da infezioni animali piccoli sono carico patogeno, la localizzazione spaziale e temporale delle infezioni, e modifica la risposta immunitaria dell&#39;organismo infetto. Nel imaging ottico in vivo è uno strumento prezioso per la ricerca della malattia infettiva e può essere utilizzato per monitorare multipla letture sperimentali attraverso l&#39;uso di geni reporter (luciferasi, proteine ​​fluorescenti, beta-lattamasi, ecc), coloranti fluorescenti, nanoparticelle o sonde chemioluminescenti mirati ad un processo biologico delle proteine, o microrganismo 6. L&#39;imaging bioluminescenza (BLI) è una modalità di imaging ottico utilizzato per monitorare la colonizzazione di piccoli animali, come topi e ratti, per batterica patogenaria 3,6,8,9. I topi sono infetti da batteri ricombinanti esprimenti una luciferasi, come l&#39;operone lux CDABE da luminescens Photorhabdus. Questi batteri possono essere rilevate mediante la loro produzione luce utilizzando un CCD sede a sistema di imaging in vivo 3,6,9. È importante sottolineare che solo metabolicamente microrganismi attivi sono bioluminescente (BL), il che significa solo le cellule batteriche vitali vengono rilevati da questa metodologia 10,11. Utilizzando 2D BLI, la posizione della sorgente BL viene dedotto dalla superficie dell&#39;animale dove il segnale viene emesso 8. L&#39;esatta localizzazione anatomica del BL focolai in vivo deve essere determinato attraverso l&#39;analisi ex vivo di organi 3,6,9 In contrasto, tomografia composito 3D diffusa luce di imaging (DLIT) può essere utilizzato per compilare una ricostruzione quantitativa 3D della BL fonte 12. DLIT viene effettuata attraverso la raccolta di immagini scattate BL utilizzando filtri ottici definiti strette passa-banda esuccessivamente averli inseriti in una tomografia ottica algoritmo di ricostruzione 3D diffusa 1,7,12,13. Attualmente, l&#39;imaging multi-modalità è l&#39;unica metodologia disponibile per ottenere vera localizzazione anatomica non invasiva di bioluminescenti focolai in vivo, senza bisogno di analisi ex vivo. Recentemente, abbiamo usato una combinazione di DLIT co-registrate con μCT imaging per valutare Citrobacter rodentium (C. rodentium) dinamiche di colonizzazione dopo il trattamento profilattico con un batterio probiotico 7. C. rodentium è un patogeno enterico specifico murino utilizzato per l&#39;infezione umana modello con enteropatogeno e enterhemorrhagic Escherichia coli 14. C. infezione rodentium provoca colite, tipicamente associati con lieve perdita di peso, diarrea, polarizzazione Th1 risposta immunitaria e alterazioni patologiche distinte, tra cui colon iperplasia delle cripte e di fissaggio e cancellando lesione formazionil 14. In aggiunta a questo, C. rodentium patogenesi è stato studiato a fondo utilizzando BLI e le sue dinamiche di colonizzazione nei topi C57BL/6J sono ben documentati, rendendo questo batterio un microrganismo modello ideale per l&#39;uso con l&#39;imaging multimodale 3,4,7. Questo protocollo è il primo a delineare una metodologia per l&#39;imaging integrato DLIT-μCT di una infezione batterica utilizzando una singola piattaforma multimodalità di imaging, il IVIS Spectrum CT, e la generazione di un film 4D mostra la vera dinamica di questa infezione non invasivo.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioluminescent C. rodentium</td>
			<td>Frankel lab</td>
			<td>ICC180</td>
			<td>Wiles et al., 2004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veet</td>
			<td>Boots</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Optimal depilation time is 7 min. Depilation works better if the cream is rubbed in well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluorane (100% v/v)</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>B506</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical Oxygen</td>
			<td>BOC Medical</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Size F Cylinder. Note: an appropriate regulator is required.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani broth</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.10285.0500</td>
			<td>25 g in 1L Demineralised water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani agar</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.10283.0500</td>
			<td>37 g in 1L Demineralised water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulphate</td>
			<td>Sigma (Fluka)</td>
			<td>60615</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Polypropylene conical Falcon tubes</td>
			<td>BD (Falcon)</td>
			<td>352070</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universals</td>
			<td>Corning (Gosselin)</td>
			<td>E5633-063</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>BD (Plastipak)</td>
			<td>300013</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oral dosing needle (16G x 75 mm) curved</td>
			<td>Vet Tech</td>
			<td>DE005</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbanks (Cryovial)</td>
			<td>Pro-Lab Diagnostics</td>
			<td>PL.170/Y</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Spectrum CT</td>
			<td>Caliper- a PerkinElmer Company</td>
			<td>133577 Rev A/ Spectrum CT</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6kVA UPS</td>
			<td>Caliper- a PerkinElmer Company</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XGI-8 anesthesia system</td>
			<td>Caliper- a PerkinElmer Company</td>
			<td>118918</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XAF-8 Anaesthesia filter charcoal</td>
			<td>Caliper- a PerkinElmer Company</td>
			<td>118999/00</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image v4.3.1 SP1</td>
			<td>Caliper- a PerkinElmer Company</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop shaking incubator</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>Innova 44</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

4d multimodality imaging of citrobacter rodentium infections in mice

Questo protocollo descrive i passaggi necessari per monitorare longitudinalmente un bioluminescente infezione batterica utilizzando la tomografia composito 3D diffusa luce di imaging con μCT integrato (DLIT-μCT) e il successivo utilizzo di questi dati per generare un film a quattro dimensioni (4D) del ciclo di infezione. Per sviluppare il cinema 4D di infezione e di convalidare la rappresentazione DLIT-μCT per gli studi di infezione batterica utilizzando una IVIS Spectrum CT, abbiamo usato l&#39;infezione con bioluminescenti C. rodentium, che causa autolimitante colite nei topi. In questo protocollo, abbiamo delineare l&#39;infezione di topi con bioluminescenti C. rodentium e monitoraggio non invasivo di colonizzazione da imaging DLIT-μCT quotidiano e la conta batterica da feci per 8 giorni. L&#39;uso della Spectrum IVIS CT ​​facilita senza soluzione co-registrazione di scansioni ottiche e μCT utilizzando una singola piattaforma di imaging. La modalità μCT basso dosaggio permette l&#39;imaging di topi, in varie occasioni durante l&#39;infezione, fornendo dettagliata localizzazione anatomica delle foci dei batteri bioluminescenti in 3D senza causare artefatti dalla radiazione cumulativa. È importante sottolineare che il cinema 4D di topi infetti forniscono un potente strumento di analisi per monitorare le dinamiche di colonizzazione batterica in vivo.

Infezione di topi C57BL/6J con 5 x 10 9 cfu C. rodentium è un modello di infezione batterica ben descritto e si traduce in una infezione gastrointestinale autolimitante che picchi compresi tra 6-8 giorni dopo l&#39;infezione e dura da 3 a 4 settimane 2,14. L&#39;infezione è confinata al lume intestinale da parte del sistema immunitario murino e di conseguenza, i batteri sono continuamente escreto nelle feci. La colonizzazione di topi di C. rodentium può essere monitorato in modo non invasivo per enumerazione batterica diretta da feci o di imaging bioluminescenza 2,3. Questo manoscritto descrive un protocollo ottimizzato per l&#39;esecuzione di 3D e 4D multimodalità di imaging di C. rodentium all&#39;interno di topi per monitorare carica batterica e la localizzazione durante l&#39;infezione. I risultati presentati in Figura 1 dimostrano i controlli necessari per il successo di imaging 4D. Prima l&#39;infezione di topi è essenziale dissuaderemia che l&#39;inoculo batterico usato è bioluminescente (Figura 1A) e che in seguito alla sonda gastrica di un topo con bioluminescente C. rodentium, che il segnale può essere osservato nello stomaco dell&#39;animale e non nei polmoni (Figura 1B) 16. Oltre al monitoraggio colonizzazione batterica utilizzando l&#39;imaging bioluminescenza, è buona norma quantificare numeri batterici nelle feci; che viene utilizzato come una misura indiretta di colonizzazione batterica della mucosa gastrointestinale Figura 2 dimostra la tipica carica batterica nelle feci tratto da 8 C57BL6 / J. i topi che sono stati infettati con ~ 5 x 10 9 cfu ICC180 e monitorati per 8 giorni PI colonizzazione aumenta dal giorno 2 PI fino a 6-7 giorni in cui i picchi di infezione a ~ 5 x 10 10 ufc / g, che è in linea con le precedenti relazioni 2,3,17. Per sottolineare l&#39;importanza della valutazioneting la diffusione dell&#39;infezione in un singolo mouse, figure 1b e 3, così come il video 1 sono state generate dallo stesso topo seguendo C. infezione rodentium, come descritto sopra. Quotidiano DLIT-μCT stato utilizzato per valutare la distribuzione spaziale dei batteri bioluminescenti all&#39;interno di questo mouse, usare lo scheletro come un riferimento anatomico. Figura 3 dimostra la ricostruzione DLIT-μCT di un mouse C57BL/6J infettati con ICC180 a 3 punti chiave di volta PI A giorno 3 PI piccolo bioluminescente foci può essere osservato nel colon, che presentano un moderato aumento dell&#39;intensità bioluminescenza di giorno 5 PI con modeste variazioni distribuzione spaziale. Al giorno 7 PI abbiamo osservato un significativo aumento della bioluminescenza e il bioluminescente focolai sparsi in tutto il colon. Video 1 è una raccolta di ricostruzioni 3D DLIT-μCT da giorni 1-8 proporzionale con ICC180 e illustra C.rodentium all&#39;interno del tratto gastrointestinale prossimale tra i giorni 1-2 PI che si estende per i due punti al giorno 3 PI Da giorni 4-6 PI il numero di batteri presenti nel colon si espandono fino ad un massimo del 7 ° giorno PI dove i fuochi batterica copre l&#39;intero colon. Al giorno 8 PI soli due fuochi distinti batteriche sono presenti nel colon prossimale e distale. La possibilità di visualizzare la ricostruzione 3D completa in ogni punto in ordine cronologico, rappresenta un potente strumento per analizzare le interazioni patogeno ospitanti ed è più facile da interpretare che un 3D ancora dello stesso insieme di dati. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50450/50450fig1.jpg" /> Figura 1. Bioluminescenza immagini 2D di A) Bioluminescent C. rodentium ICC180 inoculo e B) un mouse a seguito di sonda gastrica, con 200 ml di inoculo. Punta di freccia (&gt;) illustra bioluminescenti C. rodentium </<html> em&gt; nello stomaco. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50450/50450fig2.jpg" /> Figura 2. C. dinamiche di colonizzazione rodentium. Quantificazione di C. rodentium unità formanti colonia di feci per 8 giorni PI <img alt="Figura 3" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50450/50450fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50450/50450fig3.jpg" /> Figura 3. Diffuse luce di imaging tomografia-μCT scansione di bioluminescenti C. infezione rodentium da un topo monitorata al giorno 3, 5 e 7 PI Arrowhead (&gt;) illustra la colonizzazione del colon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50450/50450fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . Video 1.p :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/50450/LAB_MEDIA_50450_Frankel_Video1.wmv &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere il video. cinema 4D di infezione da C. rodentium da un topo monitorato da giorni 1-8 PI

Watch this Scientific Journal Video about 4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice at JoVE.com

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

Di imaging multi-modalità è un valido approccio per studiare la colonizzazione batterica in piccoli modelli animali. Questo protocollo descrive l&#39;infezione di topi con bioluminescenti<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; E il monitoraggio longitudinale della colonizzazione batterica mediante tomografia luce composito 3D diffusa con μCT di imaging per creare un filmato 4D di<em&gt; C. rodentium</em&gt; Infezione.

4D imaging multimodale di<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Infezioni in topi

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

4d-multimodality-imaging-of-citrobacter-rodentium-infections-in-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

12.9K Views.  Imperial College London. Di imaging multi-modalità è un valido approccio per studiare la colonizzazione batterica in piccoli modelli animali. Questo protocollo descrive l'infezione di topi con bioluminescenti Citrobacter rodentium E il monitoraggio longitudinale della colonizzazione batterica mediante tomografia luce composito 3D diffusa con μCT di imaging per creare un filmato 4D di C. rodentium Infezione.