Utilizzando il saggio del punto luce, il comportamento per le larve può essere monitorato prima, durante e dopo essere entrato nell'area luminosa consentendo di analizzare il dettaglio del movimento larvale. Questo test è semplice e facile da eseguire. La risposta alla luce viene testata una sola volta, in modo da escludere qualsiasi possibile effetto dell'adattamento alla luce.
Per preparare le piastre di agar, coprire lentamente e uniformemente il fondo di una piastra di Petri di 15 centimetri con uno strato di circa quattro millimetri di agar caldo dell'1%. Lasciare raffreddare la piastra a temperatura ambiente fino a quando l'agar non si è solidificato. Per configurare il sistema di stimolazione visiva, agganciare una sorgente luminosa LED preparata su un telaio in ferro, facendo attenzione che la luce si progetti verso il desktop.
Inclinare leggermente il cilindro fino a quando l'angolo tra il piano del cilindro e il piano verticale è di circa 10 gradi. Collegare la luce LED blu 470 nanometri al LED una spina del driver LED ad alta potenza e accendere il driver. Ruotare la manopola nell'angolo superiore destro del driver per selezionare il canale 470 nanometri e fare clic su LED.
Quando lo schermo visualizza un controllo, sul desktop apparirà una macchia di luce blu. Fare clic su OK e ruotare la manopola per regolare l'intensità della luce. Spostare la posizione della sorgente luminosa su e giù per regolare il diametro del punto luce a due centimetri.
Ruotare la manopola per selezionare l'intensità della luce in base ai requisiti sperimentali. Utilizza una console del misuratore di potenza compatta con un sensore di potenza del diodo fotografico standard per misurare la massima e minima potenza della luce nel punto. La potenza della luce deve essere misurata al buio nell'esperimento reale.
Quindi registrare la potenza della luce, misurarla tre volte e utilizzare il valore medio. Per impostare il sistema di immaginazione, bloccare una webcam ad alta risoluzione con una clip di ferro di circa 10 centimetri sopra il punto luce sul desktop e regolare l'orientamento dell'obiettivo della fotocamera verso il desktop. Collegare la fotocamera a un computer che esegue Windows 7 tramite un'interfaccia USB e posizionare la piastra agar sul desktop proprio sotto la fotocamera.
Aprire il software AMCap 9.22, il punto luce verrà visualizzato automaticamente nella finestra AMCap. Spostare la fotocamera leggermente a sinistra o a destra per assicurarsi che il punto luce si trova vicino al centro della finestra. Utilizzare una clip per fissare un filtro passa banda di 850 più o meno tre nanometri a cinque-sette millimetri immediatamente sotto la fotocamera.
Posizionare tre LED generatori di luce infrarossa con una lunghezza d'onda centrale di 850 nanometri uniformemente intorno alla piastra di agar a circa cinque centimetri di distanza dal bordo della piastra e con lenti a LED con un angolo di 70 gradi rivolto verso la piastra. Quindi collegare i LED a una fonte di alimentazione attraverso i convertitori CA-DC. Nel menu del software AMCap, selezionare le opzioni, il dispositivo video e il formato di acquisizione e impostare la dimensione in pixel del video acquisito su 800 per 600 e la frequenza fotogrammi su 60 fotogrammi al secondo.
Rimuovere il filtro e posizionare un righello sotto la fotocamera. Regolare lo stato attivo della fotocamera fino a quando la linea di scala non è chiara e parallela alla larghezza del campo visivo video e fare clic su acquisizione, configurazione e acquisizione video per selezionare il percorso di salvataggio. Quindi fare clic su Avvia registrazione per registrare la distanza effettiva corrispondente a 600 pixel e calcolare il rapporto tra ogni pixel e la distanza effettiva.
Prima di introdurre la larva nella configurazione di imaging, acquisire un breve video della posizione della luce e denominare l'area della luce video di sfondo del controllo non filtrata. Riposizionare il filtro sull'obiettivo della fotocamera e accendere una luce lontana dal dispositivo sperimentale a un'impostazione il più bassa possibile, consentendo comunque di osservare chiaramente le larve. Usa un cucchiaio per rimuovere alcune larve dal mezzo di coltura e selezionare delicatamente una terza larva instar.
Lavare la larva in acqua distillata e posizionare la larva al centro del piatto di agar. Rimuovere delicatamente l'acqua in eccesso dalla larva e spegnere la luce della stanza. Lasciare che la larva si acclimati per due minuti nell'ambiente buio prima di accendere la luce LED infrarossa.
Il seguente esperimento di comportamento di elusione della luce deve essere effettuato al buio. Per comodità di dimostrazione abbiamo girato alla luce intensa. Spazzolare delicatamente la larva al centro del piatto.
Quando la larva inizia a strisciare dritta, ruota la piastra per far testare la larva verso il punto luce. Fare clic su acquisizione, configurazione e acquisizione video per selezionare il percorso di salvataggio e fare clic su Avvia registrazione per registrare. Consentire alla larva di strisciare verso, entrare e lasciare il punto luce fino a quando non è quasi fuori dal campo visivo e fare clic su Interrompi registrazione.
Allontanare il filtro dalla fotocamera e acquisire un breve video della posizione del punto luce. Quindi denominare l'area della luce video non filtrata del post due e confrontare questo video con l'area luminosa di un video per assicurarsi che la posizione del punto luce non sia cambiata. Qui, si possono osservare curve del tempo della velocità della coda, angolo di piegatura del corpo e velocità angolare di piegatura del corpo di una larva rappresentativa.
La dimensione della testa larvale fusa e, quindi, l'angolo massimo di flessione del corpo è significativamente ridotto in terze larve instar con neuroni octopaminergici inibiti dall'espressione tossica del tetano rispetto al controllo parentale che indica che i neuroni Tdc2-Gal4 sono necessari per una normale risposta della luce larvale. Per un'elaborazione corretta delle immagini, assicurarsi che la fotocamera non blocchi la luce e che il punto luce sia rotondo e vicino al centro della finestra. Seguendo questa procedura, l'optogenetica può essere eseguita per osservare come reagiscono le larve quando vengono attivati neuroni specifici.
Usando questo saggio, i dettagli del movimento larvale possono essere analizzati consentendo di studiare l'impatto lontano dei fattori ambientali e interni sul comportamento di elusione della luce larvale.
