Maria Baumgarten (piattaforma biotecnologia IQ, infezione medicina, Università di Lund) è riconosciuto per eseguire e fornire scansione micrografi elettronici. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da The Swedish Research Consiglio Formas (2017-00100) come parte dell'europeo terza programmazione iniziativa congiunta su chiamata resistenza antimicrobica (JPIAMR) "Dinamica di trasmissione". I finanziatori non avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, interpretazione, scrittura, preparazione del manoscritto, decisione di inviare, o la decisione di pubblicare il lavoro.

1. modifica del coprioggetto in vetro (modello francobolli)
<ol><li>Per pulire il vetro vetrini coprioggetto, immergerli in sequenza in 10 mL di HCl 1,0 M, acqua deionizzata e 1,0 M di NaOH, rispettivamente, per 10 min in ogni passaggio in un pulitore ad ultrasuoni a temperatura ambiente.<ol>
<li>Asciugare il vetro vetrini coprioggetto con gas azoto. Nota: I vetrini coprioggetto sono asciugati da evaporazione sotto un flusso di azoto gassoso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Immergere i vetrini puliti e asciugati in 10% (v/v), 10 mL di soluzione di 3-ammino-propil-trietossisilano (APTES) in etanolo per 1 h per introdurre gruppi amminici sulla superficie del vetro di copertura, a temperatura ambiente.<ol>
<li>Sciacquare i vetrini con acqua deionizzata.</li>
		<li>Asciugare i vetrini con gas azoto.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Immergere i vetrini APTES-modificato nel 5% (v/v), 10 mL di soluzione di glutaraldeide in tampone fosfato 10 mM (pH 7.4) per 2 h per attivare i gruppi amminici sulla superficie, a temperatura ambiente6,15.<ol>
<li>Sciacquare i vetrini con 10 mM di tampone fosfato (pH 7,4) al fine di rimuovere glutaraldeide in eccesso dalla superficie.</li>
		<li>Asciugare i vetrini con gas azoto.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare 1,0 mL di soluzione di modello (proteina/del batteriofago) in tampone fosfato 10 mM (pH 7.4) in concentrazione di 0,1 mg/mL. Nota: Sciogliere 0,1 mg di proteina in 1,0 mL di tampone fosfato (10 mM, pH 7.4). Se necessario, uno spettrofotometro (280 nm) può essere utilizzato per determinare la concentrazione di proteina.<ol>
<li>Goccia di 200 µ l di questa soluzione di modello sul coprioggetto modificate e incubare a 4 ° C durante la notte. Nota: La soluzione del modello in eccesso possa essere utilizzata per preparare 1-2 Altri Stamp di modello a essere utilizzata negli studi di caratterizzazione.</li>
		<li>Sciacquare i vetrini con 10 mM di tampone fosfato (pH 7,4) al fine di rimuovere il modello non associato dalla superficie. Nota: Per sciacquare gli elettrodi, lavarli con tampone fosfato (10 mM, pH 7.4) per 30 s.</li>
		<li>Asciugare i vetrini con gas azoto. Nota: Le polizze di copertura deve essere conservate a 4 ° C fino a quando non vengono utilizzati in fase di polimerizzazione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. modifica delle sonde capacitive di oro
<ol><li>Per pulire gli elettrodi, immergere gli elettrodi in un becher da piccolo, in sequenza, contenente 5 mL di etanolo (70%), deionizzata acqua, acetone, acqua deionizzata, soluzione piranha acide (3:1, H2SO4: H2O2, v/v) e deionizzata acqua, rispettivamente per 10 min in ogni passo, in un pulitore ad ultrasuoni a temperatura ambiente.<ol>
<li>Asciugare gli elettrodi con gas azoto.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per poter eseguire l'elettropolimerizzazione di tiramina, preparare 8 mL di soluzione di tiramina di 10 mM in 10 mM fosfato tampone (pH 7,4) contenente etanolo (2 mL)15. Nota: Il volume totale della soluzione tiramina deve essere 8 mL in totale di cui 2 mL di etanolo.<ol>
<li>Eseguire analisi voltammetriche ciclici (15 cicli) in questa soluzione utilizzando un potenziostato coprendo un potenziale gamma di 0 - 1.5 V (Ag/AgCl) e una velocità di scansione di 50 mV/s30.</li>
		<li>Sciacquare gli elettrodi con acqua deionizzata.</li>
		<li>Asciugare gli elettrodi con gas azoto.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Immergere gli elettrodi in una soluzione contenente cloruro di acriloil di 30 mM e 30 mM trimetilammina in toluene (Vtotale = 5 mL) a temperatura ambiente durante la notte6,15,30.<ol>
<li>Sciacquare gli elettrodi con acqua deionizzata. Nota: Per garantire una migliore rimozione delle non reagito acriloil residui di cloruro e trimetilammina, inoltre è possibile lavare la superficie con NaOH dopo acqua deionizzata.</li>
		<li>Asciugare gli elettrodi con gas azoto.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. preparazione del modello impresso capacitive di oro
<ol><li>
Preparazione del batteriofago impresso capacitive di oro
	<ol>
<li>Prima della polimerizzazione, preparare una soluzione di monomero contenente monomero (N-idrossimetil acrilammide) e cross-linker (polietilene glicole-400-dimetacrilato) in un rapporto di 1:5 (mol/mol) in 1 mL di tampone fosfato 10 mM (pH 7.4). Nota: La soluzione di monomero contenente monomero e cross-linker può essere utilizzata in diversi rapporti, o i tipi del monomero e cross-linker possono essere cambiati secondo il modello per l'ottimizzazione dell'interazione specifico.</li>
		<li>Aggiungere 1 mg di foto-iniziatore in questa soluzione. Nota: Se la polimerizzazione avviene sotto luce UV, l'iniziatore di foto deve essere utilizzato per avviare la polimerizzazione. Se la polimerizzazione avviene mediante polimerizzazione radicalica, il tipo dell'iniziatore deve essere modificato.</li>
		<li>Pipettare 1,5 µ l di questa soluzione sulla superficie dell'oro dell'elettrodo d'oro modificata. Nota: La superficie dell'oro dell'elettrodo è rappresentata schematicamente nella Figura 1.</li>
		<li>Portare il timbro di modello a contatto con la soluzione di monomero nella parte superiore la superficie dell'elettrodo d'oro.</li>
		<li>Avviare la polimerizzazione UV (365 nm, 400 W) e proseguire per 15 min31. Nota: Polimerizzazione UV viene eseguita all'interno di un armadietto di raffreddamento che è impostato a-25 ° C prima dell'inizio della polimerizzazione. Quindi, il sistema di polimerizzazione UV è acceso e la polimerizzazione è continuata per 15 min prima di spegnere il sistema di polimerizzazione UV.</li>
		<li>Rimuovere il timbro modello dalla superficie usando il forcipe. Nota: Durante la rimozione del timbro modello dalla superficie, il film polimerico sulla superficie potrebbe essere danneggiato. Pertanto, il timbro deve essere rimosso dalla superficie molto attentamente e lentamente senza usare la forza.</li>
		<li>Sciacquare la superficie dell'elettrodo con acqua deionizzata e asciugare con gas azoto.</li>
		<li>Immergere gli elettrodi in 1 mL di 10 mM 1-dodecanethiol preparato in etanolo per 20 min al fine di coprire i fori sulla superficie dell'elettrodo.</li>
		<li>Sciacquare gli elettrodi con acqua deionizzata e asciugare gli elettrodi con gas azoto.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione della proteina impresso capacitive di oro
	<ol>
<li>Prima della polimerizzazione, preparare una soluzione di monomero contenente monomeri (acrilammide: 54 mg; N-hydroxymethylacrylamide: 140 µ l; N-isopropylacrylamide: 85,6 mg) e cross-linker (methylenebisacrylamide: 9,5 mg) in 820 µ l di acqua ultra-pura30,32.</li>
		<li>Preparare 5% (v/v) N, N, N', N'-tetramethylethyldiamine (TEMED) in acqua ultra-pura.</li>
		<li>Aggiungere 20 µ l della soluzione TEMED nella soluzione di monomero e spurgo con azoto gassoso per 5 min.</li>
		<li>Preparare 10% (p/v) ammonio persolfato (APS) in acqua ultra-pura.</li>
		<li>Aggiungere 20 µ l della soluzione APS nella soluzione di monomero.</li>
		<li>Pipettare 1,5 µ l di soluzione di monomero sulla superficie dell'elettrodo d'oro modificate.</li>
		<li>Portare il timbro di modello a contatto con la superficie trattata monomero.</li>
		<li>Avviare la polimerizzazione a temperatura ambiente e continuare per 5 h. Nota: Per la preparazione di elettrodi d'oro impresso proteina, invece di UV-polimerizzazione, polimerizzazione radicalica a temperatura ambiente (25 ° C) viene eseguita utilizzando APS-TEMED come il catalizzatore di iniziatore.</li>
		<li>Rimuovere con attenzione il timbro modello dalla superficie usando il forcipe.</li>
		<li>Sciacquare l'elettrodo con acqua deionizzata e asciugare con gas azoto.</li>
		<li>Immergere gli elettrodi in 1 mL di 10 mM 1-dodecanethiol preparato in etanolo per 20 min al fine di coprire i fori sulla superficie dell'elettrodo.</li>
		<li>Sciacquare gli elettrodi con acqua deionizzata e asciugare gli elettrodi con gas azoto.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. caratterizzazione della superficie dell'elettrodo con microscopia elettronica (SEM)
<ol><li>Montare gli esemplari su supporti in alluminio con nastro adesivo carbonio.</li>
	<li>Rivestire gli elettrodi con 10 nm palladium/oro.</li>
	<li>Esaminare gli elettrodi con SEM</li>
</ol>5. in tempo reale misurazioni capacitivi con modello impresso capacitive di oro
<ol><li>Inserire gli elettrodi d'oro capacitivi impressi nella cella elettrochimica flusso integrata di un biosensore capacitivo.</li>
	<li>Preparare 100 mL di buffer di rigenerazione (25 mM glicina-HCl, pH 2.5, includendo 50mm Tween-20) e 1 L in esecuzione buffer (per batteriofago impresso sistema: fosfato 10 mM, pH 7.4; per sistema impresso proteina: 50 mM Tris-HCl, pH 7.4).</li>
	<li>Avviare l'analisi con l'iniezione del buffer di rigenerazione per rigenerare il sistema e in esecuzione buffer per riequilibrare il sistema per 25 min.</li>
	<li>Preparare soluzioni modello standard nella gamma di concentrazione desiderata in tampone di corsa. Nota: in primo luogo preparare un brodo della soluzione del modello sciogliendo 0,1 mg di proteina, o circa 108 pfu batteriofagi, in 1,0 mL di tampone fosfato (fosfato 10 mM, pH 7.4). Quindi, preparare soluzioni standard per la curva di taratura facendo dieci diluizioni sequenziale 10 volte dalla soluzione di riserva. Queste soluzioni saranno analizzate con il biosensore capacitivo al punto 5.5. Concentrazione di proteine può essere misurata mediante uno spettrofotometro (280 nm). Al fine di misurare la concentrazione di batteriofago, può essere utilizzato un metodo di agar di doppio strato, che è descritto in precedenza Dettagli19.</li>
	<li>Iniettare 250 µ l di queste soluzioni standard in sequenza per il sistema in condizioni ottimali (portata: 100 µ l/min, temperatura: 25 ° C). Nota: In questa applicazione, le soluzioni standard della proteina sono state preparate nella gamma di concentrazione di 1,0 x 10-4 - 1,0 x 10-14, mentre le concentrazioni di batteriofago erano nella gamma 1.0 x 101 - 1.0 x 105 pfu/mL. Le soluzioni erano collocate nella valvola di iniezione e in modo sequenziale iniettate nel sistema, iniettando i campioni in triplici copie attraverso la pompa a siringa singola e la valvola multivie. La diminuzione della capacità dopo l'iniezione di soluzioni standard derivanti da un'associazione del modello per le cavità impresse è controllata automaticamente dal software dello strumento.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lin, T. Y., Hu, C. H., Chou, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+albumin+concentration+by+MIP-QCM+sensor.">Determination of albumin concentration by MIP-QCM sensor.</a> Biosensors and Bioelectronics. 20 (1), 75-81 (2004).</li><li>Berggren, C., Bjarnason, B., Johansson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacitive+Biosensors.">Capacitive Biosensors.</a> Electroanalysis. 13 (3), 173-180 (2001).</li><li>Zhang, S., Garcia-D'Angeli, A., Brennan, J. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+small+quantities+of+specific+bacteria+using+phage-based+wireless+biosensors.">Rapid detection of small quantities of specific bacteria using phage-based wireless biosensors.</a> 2016 10th International Conference on Sensing Technology (ICST). , 1-5 (2016).</li><li>Park, M. -. K., Chin, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Approach+of+a+Phage-Based+Magnetoelastic+Biosensor+for+the+Detection+of+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+in+Soil.">Novel Approach of a Phage-Based Magnetoelastic Biosensor for the Detection of Salmonella enterica serovar Typhimurium in Soil.</a> Journal of Microbiology and Biotechnology. 26 (12), 2051-2059 (2016).</li><li>Mack, J. D., Yehualaeshet, T., Park, M. -. K., Tameru, B., Samuel, T., Chin, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage-Based+Biosensor+and+Optimization+of+Surface+Blocking+Agents+to+Detect+Salmonella+typhimurium+on+Romaine+Lettuce.">Phage-Based Biosensor and Optimization of Surface Blocking Agents to Detect Salmonella typhimurium on Romaine Lettuce.</a> Journal of food safety. 37 (2), 12299 (2017).</li><li>Colomer-Lluch, M., Jofre, J., Muniesa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+resistance+genes+in+the+bacteriophage+DNA+fraction+of+environmental+samples.">Antibiotic resistance genes in the bacteriophage DNA fraction of environmental samples.</a> Plos One. 6 (3), 17549 (2011).</li><li>Lood, R., Ert&#252;rk, G., Mattiasson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+antibiotic+resistance+spreading+in+wastewater+treatment+plants+-+bacteriophages+as+a+much+neglected+potential+transmission+vehicle.">Revisiting antibiotic resistance spreading in wastewater treatment plants - bacteriophages as a much neglected potential transmission vehicle.</a> Frontiers in microbiology. 8, (2017).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Quando questo metodo viene eseguito, ci sono alcuni passaggi critici che devono essere considerati mentre seguendo il protocollo. Un passaggio fondamentale è la fase di pulizia con soluzione acida piranha. Fase 2.1 non deve essere più di 10 min. La soluzione del modello per passo 1.4 non deve superare 0,1 mg/mL, dato che questi valori sono stati ottimizzati in precedenza. Voltametric ciclico scansioni non devono superare 15 cicli al fine di ottenere lo spessore ottimale. Per passo 3.1.3, 1,5 µ l è un valore ottimizzato. Questo valore non deve essere più alto per questo specifico tipo di elettrodo. Se il sistema di polimerizzazione UV ha una potenza di 400 W, la polimerizzazione deve essere eseguita per un massimo di 10-15 min. Non appena l'APS (iniziatore) viene aggiunto alla soluzione dopo TEMED, il passo successivo deve essere eseguito molto rapidamente per evitare immediata polimerizzazione (punto 3.2.5).
Una delle fasi più critiche è la rimozione del timbro modello dalla superficie dopo polimerizzazione UV. Se questo passaggio non viene eseguito correttamente, c'è il rischio che il film polimerico sulla superficie dell'elettrodo può essere rimosso con il timbro. Pertanto, si consiglia di immergere l'elettrodo e il timbro della proteina sulla parte superiore in una soluzione di acqua dopo la polimerizzazione, quindi rimuovere il timbro molto lentamente e con attenzione dalla superficie (punto 3.1.6).
In base al modello utilizzato, modifiche nel tipo e nel rapporto di monomeri usati (monomero funzionale e cross-linker) possono essere valutate in termini di generazione di sensibilità. Questo deve essere determinato empiricamente. Ulteriormente, il legame di affinità della molecola stampo solitamente coinvolge numerose interazioni differenti contemporaneamente. Di conseguenza, questo può portare a problemi durante la procedura di rigenerazione. Se il modello associato non viene rilasciato correttamente dalla superficie, questo può influenzare la possibilità di riutilizzo dell'elettrodo per ulteriori analisi. Queste affinità multipunto può anche derivare da associazione tramite interazioni più deboli. In tali sistemi, il legame non specifico può aver luogo, che possa influenzare negativamente la selettività del sistema16. Si tratta di comune e generale, limiti del metodo.
Oltre a queste limitazioni specifiche, ci sono molti vantaggi significativi del metodo discusso rispetto ai metodi esistenti. Mentre RIAs, Elisa e fluorometriche misurazioni sono molto sensibili, richiedono l'utilizzo di materiale con etichettato (modello o rivelatore), mentre il biosensore è completamente privo di etichetta. Questi metodi sono anche più costosi e che richiede tempo. Un approccio di biosensore consente sintesi rapida, parallela di MIPs in diverse composizioni al tempo stesso16. Poiché solo pochi microlitri di soluzione di monomero è necessaria per la preparazione, il metodo è conveniente quando si utilizza costosi o altrimenti limitati monomeri. Elettrodi di MIP più ulteriormente, singoli possono essere utilizzati per circa 80 analisi senza una significativa diminuzione delle prestazioni, che è significativamente superiore a altri metodi esistenti30. I metodi esistenti anche soffrono, in vari gradi, di bassa sensibilità e selettività, mentre il metodo descritto consente una rilevazione e quantificazione delle molecole nella gamma pM con elevata selettività.
A causa del rapporto costo-efficacia, la facilità di funzionamento dello strumento e la rilevazione in tempo reale e sensibile in tempi brevi rispetto ai metodi esistenti, i biosensori sono molto promettente punto di sistemi di rilevazione di cura in condizioni di campo; ad esempio, per il monitoraggio ambientale e per applicazioni nei paesi in via di sviluppo. In molte applicazioni all'interno di diagnosi della malattia, in tempo reale, sensibile, selettivo e rapido rilevamento di un biomarcatore in una miscela complessa come siero è richiesto15,25. Qui, i biosensori sono superiori a metodi esistenti, in particolare, grazie alla loro robustezza e sensibilità. In particolare per la rilevazione di agenti infettivi, batteriofagi recentemente sono considerati come elemento alternativo presta per biosensori a causa del loro ospite batteri specificità33,34,35. Sostituzione degli anticorpi con batteriofagi è molto promettente al fine di ridurre i costi e aumentare la stabilità anche altri36. Tale sistema permetterà anche per la rilevazione e la quantificazione dei fagi specifici nell'ambiente e da campioni clinici. A causa della prevalenza di batteriofagi e la loro capacità di trasdurre batteri con resistenza antibiotica geni37,38, tale metodo può essere utile studiare la diffusione di batteri resistenti.

La quantificazione delle biomolecole è utilizzata in molti campi di ricerca diversi all'interno delle scienze, che impiegano metodi come la radioimmunoanalisi (RIA) o ELISA1. Alcuni di questi metodi richiedono un etichettati reagente come un radioisotopo o enzima etichettato anticorpi e antigeni, che li rende laborioso e dispendioso con procedure complesse2. Ulteriormente, la robustezza, la selettività e la sensibilità di questi metodi non sono sufficienti per tutte le analisi; in particolare non sono sufficienti quando attogram quantitativi devono essere analizzati, piuttosto che di pittogramma quantità3. Per questo scopo, biosensori hanno guadagnato notevole interesse4,5, in particolare in combinazione con imprinting molecolare per una maggiore robustezza.
Imprinting molecolare si basa sulla creazione di cavità di polimerizzazione di monomeri funzionali intorno al modello6, creazione di siti di riconoscimento artificiale che assomigliano perfettamente il modello7. Questa tecnica è stata utilizzata per diverse applicazioni, tra cui sistemi di drug delivery e separazione analitica, ma anche come elementi di presta in biosensori8,9,10. Tuttavia, ci sono ancora alcune difficoltà nella progettazione di stampati molecolare Polimeri (MIPs) per i modelli macromolecolari come proteine e cellule11,12. A causa di questo, molti ricercatori si sono concentrati sull'imprinting la proteina modello direttamente su un substrato, creando così una superficie che verrà riconosciuta dalla proteina bersaglio12. Questa tecnica di rivestimento di superficie utilizzata per impiegare cavità di riconoscimento per assembly tra cui proteine e molecole di grandi dimensioni viene chiamata microcontatto imprinting13,14. La procedura generale del metodo dipende la polimerizzazione tra due superfici - un timbro di modello e un supporto di polimero - su cui il modello è adsorbito su una superficie di15,16e portato in contatto con il superficie trattata monomero. In questo modo, un film polimerico sottile è formato sul supporto tramite polimerizzazione UV. Infine, il modello viene rimosso, lasciando dietro di sé il cavità specifiche modello sulla superficie dell'elettrodo impresso. Questo metodo presenta alcuni vantaggi, tra cui una perdita ridotta attività della molecola impressa, anche come che richiedono piccole quantità di molecole di modello per l'imprinting elaborare16,17. Così, queste superfici conveniente, stabile, sensibile e selettive possono essere create sulle superfici sensore, targeting per qualsiasi modello di scelta dell'utente.
Il biosensore può essere utilizzato per la rilevazione di singole proteine e biomacromolecole molto più grandi, compresi i virus. Un gruppo specifico di virus guadagnando interesse recente è il batteriofago, che è un virus che infetta i batteri. Rilevamento rapido e sensibile dei batteriofagi è importante durante biotecnologiche e biofarmaceutica processi al fine di determinare le infezioni di colture batteriche con batteriofagi18. Il saggio biologico più comunemente utilizzato per il rilevamento del batteriofago è il doppio strato agar metodo19, che è laboriosa e richiede tempo. Parecchi tentativi sono stati fatti per sviluppare nuovi strumenti diagnostici per virus (compresi i batteriofagi) come forza atomica (AFM) la microscopia20, interferometria21, elettrochimica22e sensore sistema23, 24. un sacco di lavoro è stato incentrato su biosensori a causa di loro vantaggi come essendo facile da usare, altamente sensibile e capace di misurazione in tempo reale15,25. Un tipo specifico di biosensore è basato su variazioni di capacità. Questi biosensori capacitivi sono i sensori elettrochimici che misurano i cambiamenti nelle proprietà del dielettrica quando un analita interagisce con un elemento inoltre sulla superficie del sensore, causando una diminuzione nella capacità2,4 . Capacitivi biosensori sono stati utilizzati per la rilevazione di vari analiti come antigeni, anticorpi, proteine e metalli pesanti ioni6,26,27,28. Questi tipi di biosensori hanno molti vantaggi come intrinseca rapidità, alta sensibilità, semplicità, basso costo, facile manipolazione e misura in tempo reale senza etichettatura29.
Il metodo descritto nel presente documento mira a consentire l'individuazione e la quantificazione di basso-abbondanti biomolecole in campioni altamente complessi, senza la necessità dell'utilizzo di qualsiasi etichettatura. In particolare, la tecnica è più utile nella gamma atto-picogrammo di biomolecole, dove altri strumenti commercialmente esistenti non riescono a quantificare con precisione la loro destinazione.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:753px;" width="754">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glass Cover slips</td>
			<td style="width:147px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:224px;">102222</td>
			<td style="width:167px;">protein stamp</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HCl</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1758-500ML</td>
			<td>cleaning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaOH</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>72068-100ML</td>
			<td>cleaning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ultrasonic cleaner</td>
			<td style="width:147px;">Branson Ultrasonic</td>
			<td>BRANSONIC M1800- E</td>
			<td>cleaning</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">3-amino-propyl-triethoxysilane (APTES)</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3648-100ML</td>
			<td>modification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EtOH</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>1009836010</td>
			<td>rinsing/cleaning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">glutaraldehyde</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5882-100ML</td>
			<td>cross-linker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">acetone</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>34850-1L-M</td>
			<td>cleaning</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">H2SO4</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>339741-100ML</td>
			<td>piranha solution</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">H2O2</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1009-500ML</td>
			<td>piranha solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">tyramine</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T90344-5G</td>
			<td>modification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CompactStat</td>
			<td style="width:147px;">Ivium Technologies</td>
			<td>CompactStat.h: 30mA@10V/3MHz</td>
			<td>potentiostat</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Platinum Counter Electrode Kit</td>
			<td style="width:147px;">Equilabrium</td>
			<td>AFCTR5</td>
			<td>potentiostat</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Reference Electrode</td>
			<td style="width:147px;">Equilabrium</td>
			<td>RREF0021</td>
			<td>potentiostat</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">acryloyl chloride</td>
			<td style="width:147px;">EMD Millipore</td>
			<td>8.00826.0100</td>
			<td>modification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">triethylamine</td>
			<td style="width:147px;">EMD Millipore</td>
			<td>8.08352.0100</td>
			<td>modification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">toluene</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>244511-100ML</td>
			<td>modification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N-hydroxymethyl acrylamide</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>245801-100G</td>
			<td>functional monomer</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">poly ethylene glycol-400-dimethacrylate</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>409510-250ML</td>
			<td>cross-linker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-Hydroxy-4&#8242;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>410896-50G</td>
			<td>functional monomer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UV polymerizator</td>
			<td style="width:147px;">Dymax</td>
			<td style="width:224px;">Dymax 5000ECE</td>
			<td>UV-polymerization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">forceps</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z168777-1EA</td>
			<td>consumable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1-dodecanethiol</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>471364-100ML</td>
			<td>blocking agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">acrylamide</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3553-100G</td>
			<td>functional monomer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N-hydroxymethylacrylamide</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>245801-100G</td>
			<td>functional monomer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N-isopropylacrylamide</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>415324-50G</td>
			<td>functional monomer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">methylenebisacrylamide</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>146072-500G</td>
			<td>cross-linking monomer</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:216px;">N,N,N&#39;,N&#39;-tetrametyhlethyldiamine (TEMED)</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281-25ML</td>
			<td>catalyst</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ammonium persulphate</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678-25G</td>
			<td>initiator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Capacitive biosensor</td>
			<td style="width:147px;">CapSenze</td>
			<td style="width:224px;"></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycine</td>
			<td style="width:147px;">Merck</td>
			<td>1042011000</td>
			<td>regeneration buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tween-20</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416-50ML</td>
			<td>regeneration buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trizma base</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>93352-1KG</td>
			<td>running buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2HPO4&#160;&#8226; 2H2O</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>567547-1KG</td>
			<td>running buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaH2PO4&#160;&#8226; 2H2O</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>567549-1KG</td>
			<td>running buffer</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">DELPHI correlative light and electron microscope</td>
			<td style="width:147px;">Phenom-World</td>
			<td style="width:224px;"></td>
			<td>equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Capacitive gold electrodes</td>
			<td>CapSenze Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>consumables</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2,2&#39;-azobis(2-methypropionitrile)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>441090-25G</td>
			<td>photo-initiator</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">CapSenze Smart Software</td>
			<td style="width:147px;">CapSenze Biosystems</td>
			<td style="width:224px;"></td>
			<td style="width:167px;">software program</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ultrasensitive detection of biomarkers by using a molecular imprinting based capacitive biosensor

La capacità di rilevare e quantificare biomolecole in soluzioni complesse è sempre stato molto ricercata all'interno delle scienze naturali; utilizzato per l'individuazione di biomarcatori, contaminanti e altre molecole di interesse. Una tecnica comunemente utilizzata per questo scopo è l'enzima-collegata dell'immunosorbente Assay (ELISA), dove spesso un anticorpo è diretto verso una molecola specifica dell'obiettivo, e un secondo anticorpo marcato viene utilizzato per la rilevazione dell'anticorpo primario, consentendo la Quantificazione assoluta di biomolecole in fase di studio. Tuttavia, l'utilizzo di anticorpi come elementi di riconoscimento limita la robustezza del metodo; così come l'esigenza di usare molecole con etichettate. Per superare queste limitazioni, imprinting molecolare è stata implementata, creazione di siti di riconoscimento artificiale complementari alla molecola del modello e alla necessità dell'uso di anticorpi per l'associazione iniziale. Ulteriormente, per ancora più elevata sensibilità, l'anticorpo secondario marcato può essere sostituita da biosensori affidarsi la capacità per la quantificazione della molecola target. In questo protocollo, descriviamo un metodo per rapidamente e privo di etichetta rilevare e quantificare basso-abbondanti biomolecole (proteine e virus) in campioni complessi, con una sensibilità che è significativamente migliore rispetto ai sistemi di rilevamento comunemente usati come l'ELISA. Tutto questo è mediato dall'imprinting molecolare in combinazione con un biosensore di capacitanza.

Seguendo il protocollo, seguendo lo schema in Figura 1, nudo elettrodo d'oro sarà improntato con un modello, che rappresentano la struttura di un biomacromolecule. Questo elettrodo può essere applicato in un biosensore capacitivo (Figura 2), consentendo l'applicazione stabile di un modello sull'elettrodo e la misurazione delle variazioni della capacità all'associazione del modello.
Una rappresentazione schematica del biosensore capacitivo è illustrata nella Figura 2. La pompa centris, che è responsabile per iniezione continua del buffer in esecuzione (fosfato 10 mM, pH 7.4) e il buffer di rigenerazione (25 mM glicina-HCl, pH 2.5) durante la rigenerazione in cella di flusso, può essere visto chiaramente nella figura. La cella di flusso è costituito da lavoro, riferimento ed elettrodi contatore. La valvola di iniezione è composta da soluzioni standard della proteina/del batteriofago, che passano attraverso il degassificatore prima e poi iniettato in sequenza nel sistema. Appena le soluzioni raggiungono l'elettrodo di lavoro inserito nella cella di flusso, il risultato è monitorato in tempo reale. I valori di capacità possono essere registrati seguendo la sensorgrams sullo schermo del computer.
Figura 3 e Figura 4 raffigurano le differenze tra la superficie del nudo e impressi elettrodi d'oro. Questo passaggio di caratterizzazione è importante assicurare che ci sono cavità polimerici, visto come rugosità sulla superficie dell'elettrodo dopo imprinting. Oltre a SEM, ci sono anche altri metodi di caratterizzazione tra cui AFM, misure di angolo di contatto, ellissometria ecc., che può essere usato per caratterizzare la superficie dopo imprinting. In questo modo, è possibile garantire che il processo di imprinting è successo e che modello nelle cavità si formata sulla superficie. All'interno di queste cavità, il modello possibile associare con affinità e alta specificità.
Dopo l'iniezione delle soluzioni standard nel sistema capacitivo, una media delle ultime cinque letture è stata calcolata automaticamente dal software, e i grafici di calibrazione sono stati ottenuti tracciando il cambiamento nella capacità contro la concentrazione dei analita. La diminuzione della capacità registrati è sorto da un'associazione del modello. Le altre molecole che si legano all'elettrodo d'oro in superficie, maggiore la riduzione di capacità totale, secondo il principio generale di misurazione capacitivi. Figura 5 e Figura 6 indicano che con l'aumento della concentrazione dell'analita, la ΔC aumenta come previsto. La gamma dinamica (fra cui è l'intervallo di concentrazione dove il sistema è utile per l'individuazione di un target specifico) e il limite di rilevabilità (LOD) può essere valutate analizzando questi grafici. Secondo Figura 6, il biosensore capacitivo batteriofago improntato in grado di rilevare i batteriofagi nella gamma di concentrazione di 101 - 105 pfu/mL, con un valore LOD di pfu/mL 10 in questo studio. Si suppone che sia Figura 5 e Figura 6 anche evidenziare la necessità di misurare la curva di taratura nello stesso intervallo richiesto per la concentrazione di modello, poichè la linearità della regressione può variare sopra le concentrazioni ( Figura 5), o hanno diverse piste (Figura 6). Si deve inoltre osservare che, a causa delle basse concentrazioni utilizzate, il sistema è abbastanza sensibile alle fluttuazioni (torbidezza nel campione, progetto di aria, ecc.) e di conseguenza, si consiglia di eseguire almeno triplici copie per ridurre il potenziale di valori anomali, tra cui . Per lo stesso motivo, la deviazione standard può essere abbastanza significativa per campioni altamente diluiti, come si vede nella Figura 6.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57208/57208fig1.jpg"> Figura 1 . Rappresentazione schematica di microcontatto imprinting metodo. (A) preparazione dei vetro vetrini (francobolli di modello), (B) preparazione degli elettrodi d'oro capacitivi, (C) microcontatto imprinting del modello sulla superficie dell'elettrodo d'oro tramite polimerizzazione UV e (D) rimozione del modello dalla superficie dell'elettrodo (riprodotto da Ertürk et al., biotecnologia rapporti 2014 (3): 65-72 con il permesso). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57208/57208fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57208/57208fig2.jpg"> Nella figura 2. Rappresentazione schematica del biosensore capacitivo. Il layout generale del biosensore capacitivo utilizzato in questo studio (riprodotto da Ertürk et al., biotecnologia rapporti 2014 (3): 65-72 con il permesso). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57208/57208fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57208/57208fig3.jpg"> Nella figura 3. Scansione microscopia elettronica della proteina impresso elettrodi. Immagini di SEM di (A) nudo elettrodo d'oro (barra della scala = 20 µm), e (B), una proteina impresso capacitiva di oro (barra della scala = 10 µm). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57208/57208fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57208/57208fig4.jpg"> Nella figura 4. Scansione microscopia elettronica del batteriofago impresso elettrodi. Immagini di SEM di un elettrodo d'oro nudo (barra della scala = 20 µm) (A), e un batteriofago impresso capacitiva di oro in diversi livelli di ingrandimento (6600 x, barra della scala = 10 µm) (B) e 11, 500 X, scala bar = 5 µm) (C); le frecce indicano aderiti batteriofagi). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57208/57208fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57208/57208fig5.jpg"> Nella figura 5. Effetto della composizione di buffer per grafici di taratura. Grafico di taratura mostrando il cambiamento nella capacità vs una concentrazione nella proteina in condizioni ottimali (Buffer di esecuzione: 50 mM Tris-HCl, pH 7.4; Buffer di rigenerazione: 25 mM glicina-HCl, pH 2.5 includendo 50mm Tween-20; Portata: 100 µ l/min, volume del campione: 250 µ l; T: 25 ° C). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57208/57208fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57208/57208fig6.jpg"> Nella figura 6. Curva di calibrazione rappresentativo per grandi biomacromolecules. Grafico di taratura che mostra la variazione della capacità vs concentrazione batteriofago in condizioni ottimali (Running Buffer: 10 mM fosfato, pH 7.4; Buffer di rigenerazione: 25 mM glicina-HCl, pH 2.5 includendo 50mm Tween-20; Portata: 100 µ l/min, volume del campione: 250 µ l; T: 25 ° C) <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57208/57208fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Ultrasensitive Detection of Biomarkers by Using a Molecular Imprinting Based Capacitive Biosensor

Qui, presentiamo un protocollo per la rilevazione e la quantificazione delle molecole abbondanti bassi in soluzioni complesse utilizzando molecolare imprinting in combinazione con un biosensore di capacitanza.

Ultrasensibile rilevazione di biomarcatori utilizzando un Imprinting molecolare basato biosensore capacitivo

The ability to detect and quantitate biomolecules in complex solutions has always been highly sought-after within natural science; being used for the ...

ultrasensitive-detection-biomarkers-using-molecular-imprinting-based

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.9K Views.  Lund University. Qui, presentiamo un protocollo per la rilevazione e la quantificazione delle molecole abbondanti bassi in soluzioni complesse utilizzando molecolare imprinting in combinazione con un biosensore di capacitanza.

Video: Ultrasensitive Detection of Biomarkers by Using a Molecular Imprinting Based Capacitive Biosensor

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

Combinazione di nastro adesivo a base di campionamento e di fluorescenza In situ</emIbridazione> per il rilevamento rapido di Salmonella Su prodotti freschi

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

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Immunologia e infezioni

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. Although the natural occurrence of both diseases&#39; is now relatively rare, the possibility of terrorist groups using these pathogens as a bioweapon is real. Because of the disease&#39;s inherent communicability, rapid clinical course, and high mortality rate, it is critical that an outbreak be detected quickly. Therefore methodologies that provide rapid detection and diagnosis are essential to ensure immediate implementation of public health measures and activation of crisis management.
Recombinant reporter phage may provide a rapid and specific approach for the detection of Y. pestis and B. anthracis. The Centers for Disease Control and Prevention currently use the classical phage lysis assays for the confirmed identification of these bacterial pathogens 2-4. These assays take advantage of naturally occurring phage which are specific and lytic for their bacterial hosts. After overnight growth of the cultivated bacterium in the presence of the specific phage, the formation of plaques (bacterial lysis) provides a positive identification of the bacterial target. Although these assays are robust, they suffer from three shortcomings: 1) they are laboratory based; 2) they require bacterial isolation and cultivation from the suspected sample, and 3) they take 24-36 h to complete. To address these issues, recombinant &#34;light-tagged&#34; reporter phage were genetically engineered by integrating the Vibrio harveyi luxAB genes into the genome of Y. pestis and B. anthracis specific phage 5-8. The resulting luxAB reporter phage were able to detect their specific target by rapidly (within minutes) and sensitively conferring a bioluminescent phenotype to recipient cells. Importantly, detection was obtained either with cultivated recipient cells or with mock-infected clinical specimens 7.
For demonstration purposes, here we describe the method for the phage-mediated detection of a known Y. pestis isolate using a luxAB reporter phage constructed from the CDC plague diagnostic phage &#934;A1122 6,7 (Figure 1). A similar method, with minor modifications (e.g. change in growth temperature and media), may be used for the detection of B. anthracis isolates using the B. anthracis reporter phage W&#946;::luxAB 8. The method describes the phage-mediated transduction of a biolumescent phenotype to cultivated Y. pestis cells which are subsequently measured using a microplate luminometer. The major advantages of this method over the traditional phage lysis assays is the ease of use, the rapid results, and the ability to test multiple samples simultaneously in a 96-well microtiter plate format.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/2740/2740fig1.jpg" /> 
Figure 1. Detection schematic. The phage are mixed with the sample, the phage infects the cell, luxAB are expressed, and the cell bioluminesces. Sample processing is not necessary; the phage and cells are mixed and subsequently measured for light.

A simple method for the identification of priority bacterial pathogens is to use genetically engineered reporter phage. These reporter phage, which are specific to their particular host species, are capable of rapidly transducing a bioluminescent signal response to host cells. Herein, we describe the use of reporter phage for the detection of Yersinia pestis.

Phage &#39;Bioluminescent&#39; Reporter per il rilevamento di batteri patogeni di categoria A

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance

AB toxins consist of an enzymatic A subunit and a cell-binding B subunit1. These toxins are secreted into the extracellular milieu, but they act upon targets within the eukaryotic cytosol. Some AB toxins travel by vesicle carriers from the cell surface to the endoplasmic reticulum (ER) before entering the cytosol2-4. In the ER, the catalytic A chain dissociates from the rest of the toxin and moves through a protein-conducting channel to reach its cytosolic target5. The translocated, cytosolic A chain is difficult to detect because toxin trafficking to the ER is an extremely inefficient process: most internalized toxin is routed to the lysosomes for degradation, so only a small fraction of surface-bound toxin reaches the Golgi apparatus and ER6-12.

To monitor toxin translocation from the ER to the cytosol in cultured cells, we combined a subcellular fractionation protocol with the highly sensitive detection method of surface plasmon resonance (SPR)13-15. The plasma membrane of toxin-treated cells is selectively permeabilized with digitonin, allowing collection of a cytosolic fraction which is subsequently perfused over an SPR sensor coated with an anti-toxin A chain antibody. The antibody-coated sensor can capture and detect pg/mL quantities of cytosolic toxin. With this protocol, it is possible to follow the kinetics of toxin entry into the cytosol and to characterize inhibitory effects on the translocation event. The concentration of cytosolic toxin can also be calculated from a standard curve generated with known quantities of A chain standards that have been perfused over the sensor. Our method represents a rapid, sensitive, and quantitative detection system that does not require radiolabeling or other modifications to the target toxin.

In this report, we describe how surface plasmon resonance is used to detect toxin entry into the host cytosol. This highly sensitive method can provide quantitative data on the amount of cytosolic toxin, and it can be applied to a range of toxins.

Rilevamento di Traslocazione tossina nel citosol Host Surface Plasmon Resonance

AB toxins consist of an enzymatic A subunit and a cell-binding B subunit1.  These toxins are secreted into the extracellular milieu, but they act upon ...

Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology

According to the American Cancer Society, more than 200,000 women will be diagnosed with invasive breast cancer each year and approximately 40,000 will die from the disease. The human leukocyte antigen (HLA) class I samples peptides derived from proteasomal degradation of cellular proteins and presents these fragments on the cell surface for interrogation by circulating cytotoxic T lymphocytes (CTL). Generation of T-cell receptor mimic (TCRm) monoclonal antibodies (mAbs) which recognize breast cancer specific peptide/HLA-A*02:01 complexes such as those derived from macrophage migration inhibitory factor (MIF19-27) and NY-ESO-1157-165 enable detection and destruction of breast cancer cells in the absence of an effective anti-tumor CTL response. Intact class I HLA/peptide complexes are shed by breast cancer cells and represent potentially relevant cancer biomarkers. In this work, a breakthrough biomarker screening system for cancer diagnostics incorporating T-cell receptor mimic monoclonal antibodies combined with a novel, label-free biosensor utilizing guided-mode resonance (GMR) sensor technology is presented. Detection of shed MIF/HLA-A*02:01 complexes in MDA-MB-231 cell supernatants, spiked human serum, and patient plasma is demonstrated. The impact of this work could revolutionize personalized medicine through development of companion disease diagnostics for targeted immunotherapies.

Intact class I HLA/peptide complexes are shed by cancer cells, representing a potential relevant cancer biomarker. Utilizing label-free sensor technology and T-cell receptor mimicking monoclonal antibodies, detection of shed MIF/HLA-A*02:01 complexes in MDA-MB-231 cell supernatants, spiked human serum, and patient plasma is demonstrated, enabling development of a novel cancer diagnostic platform.

Rilevamento dei leucociti umani Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizzando libero-Label Biosensor Tecnologia

According to the American Cancer Society, more than 200,000 women will be diagnosed with invasive breast cancer each year and approximately 40,000 will ...

Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality every year. The Influenza A and B assay was the first CLIA-waived molecular rapid flu test available. The Influenza A and B test works by employing isothermal amplification with influenza-specific primers followed by target detection with molecular beacon probes. Here, the performance of the Influenza A and B assay on frozen, archived nasopharyngeal swab (NPS) specimens stored in viral transport medium (VTM) were compared to a respiratory panel assay.
The performance of the Influenza A and B assay was evaluated by comparing the results to the respiratory panel reference method. The sensitivity for total influenza virus A was 67.5% (95% CI (CI), 56.6-78.5) and the specificity was 86.9% (CI, 71.0-100). For influenza virus B testing, the sensitivity and specificity were 90.2% (CI, 68.5-100) and 98.8% (CI, 68.5-100), respectively.
This system has the advantage of a significantly shorter test time than any other currently available molecular assay and the simple, pipette-free procedure runs on a fully integrated, closed, small-footprint system. Overall, the Influenza A and B assay evaluated in this study has the potential to serve as a point-of-care rapid influenza diagnostic test.

We describe a rapid, molecular-based Influenza A and B assay. The Influenza assay detects each target within 15 min by employing isothermal amplification with influenza-specific primers followed by target detection with molecular beacon probes. The Influenza A and B assay is user-friendly and required minimal hands-on time to perform.

Rilevazione rapida molecolare e la differenziazione dei virus influenzali A e B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of combining reactions together. We designed and evaluated a panel based on this principle to rapidly identify the presence of common disease agents in dogs and horses with acute respiratory illness. This manuscript describes a nanoscale diagnostic PCR workflow for sample preparation, amplification, and analysis of target pathogen sequences, focusing on procedures that are different from microliter scale reactions. In the respiratory panel presented, 18 assays were each set up in triplicate, accommodating up to 48 samples per plate. A universal extraction and pre-amplification workflow was optimized for high-throughput sample preparation to accommodate multiple matrices and DNA and RNA based pathogens. Representative data are presented for one RNA target (influenza A matrix) and one DNA target (equine herpesvirus 1). The ability to quickly and accurately test for a comprehensive, syndrome-based group of pathogens is a valuable tool for improving efficiency and ergonomics of diagnostic testing and for acute respiratory disease diagnosis and management.

High-throughput testing of DNA and RNA based pathogens by nanoscale PCR is described using a syndromic canine and equine respiratory PCR panel.

Detection High-throughput respiratorie patogeni nei campioni animali da Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Una piattaforma di High-throughput per lo Screening della Salmonella spp /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally replicates through an episomal DNA intermediate; however, integration of HBV DNA fragments into the host genome has been observed, even though this form is not necessary for viral replication. The exact purpose, timing, and mechanism(s) by which HBV DNA integration occurs is not yet clear, but recent data show that it occurs very early after infection. Here, the in vitro generation and detection of HBV DNA integrations are described in detail. Our protocol specifically amplifies single copies of virus-cell DNA integrations and allows both absolute quantification and single-base pair resolution of the junction sequence. This technique has been applied to various HBV-susceptible cell types (including primary human hepatocytes), to various HBV mutants, and in conjunction with various drug exposures. We foresee this technique becoming a key assay to determine the underlying molecular mechanisms of this clinically relevant phenomenon.

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

We describe here the in vitro generation of HBV DNA via a Hepatitis B virus infection system and the highly sensitive detection of its (1&#8211;2 copies) integration using inverse nested PCR.

Rilevamento di copia basso numero di DNA virale integrato formato da In Vitro l'infezione di epatite B

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally ...

Human Serum Anti-aquaporin-4 Immunoglobulin G Detection by Cell-based Assay

Anti-aquaporin-4 (AQP4) immunoglobulin G (IgG) is the core diagnostic biomarker for neuromyelitis optica spectrum disorders (NMOSD). The cell-based assay (CBA) is a widely used method to detect anti-AQP4 IgG in human serum with high sensitivity and specificity. Briefly, serum anti-AQP4 IgG is captured by AQP4-transfected cell that is fixed on the biochip then detected by a fluorescein-labelled secondary antibody. Fluorescence microscopy is utilized to visualize the fluorescence, and the intensity of fluorescence is evaluated by at least two experienced clinicians. A final diagnosis of NMOSD can be made based on the combination of anti-AQP4 IgG detection results, clinical manifestations, and neuroradiological findings. According to previous studies, CBA is more sensitive and specific than other anti-AQP4 IgG detection methods, and it can be applied to both clinical diagnosis and studies of NMOSD. The method has limitations; for example, an international scale to evaluate serum anti-AQP4 IgG titers is still lacking. Here, a detailed protocol for human serum anti-AQP4 IgG detection using CBA is described.

Cell-based assay is a widely used method to detect serum anti-aquaporin-4 immunoglobulin G. This method could be applied to clinical diagnosis and scientific researches of neuromyelitis optical spectrum disorders.

Rilevamento di immunoglobulina Anti-acquaporina-4 G di siero umano dall'analisi Cell-based

Anti-aquaporin-4 (AQP4) immunoglobulin G (IgG) is the core diagnostic biomarker for neuromyelitis optica spectrum disorders (NMOSD). The cell-based assay ...

Detection of Extravascular Trypanosoma Parasites by Fine Needle Aspiration

Fine Needle Aspiration (FNA) is a routine diagnostic procedure essential to both medical and veterinary practices. It consists of the percutaneous aspiration of cells and/or microorganisms from palpable masses, organs or effusions (fluid accumulation in a body cavity) using a thin needle similar to the regular needle used for the venous puncture. The material collected by FNA is in general highly cellular, and the retrieved aspirate is then smeared, air dried, wet-fixed, stained and observed under a microscope. In the clinical context, FNA is an important diagnostic tool that serves as a guide to the appropriate therapeutic management. Because it is simple, fast, minimally invasive and requires limited investment in the laboratory and human resources, it is extensively used by veterinary practitioners, mostly in domestic, but also in farm animals. In studies using animal models, FNA has the advantage that it can be performed repeatedly in the same animal, enabling longitudinal studies through the collection of cells from tumors and organs/tissues over the course of the disease. In addition to routine microscopy, retrieved material can also be used for immunocytochemistry, electron microscopy, biochemical analysis, flow cytometry, molecular biology or in vitro assays. FNA has been used to identify the protozoan parasite Trypanosoma brucei in the gonads of infected mice, opening the possibility for a future diagnosis in cattle.

Detection of Extravascular Trypanosoma Parasites by Fine Needle Aspiration

Fine Needle Aspiration is a technique, whereby cells are obtained from a lesion or organ using a thin needle. Aspirated material is smeared, stained and examined under a microscope for diagnosis or used for molecular biology, cytometry or in vitro analysis. It is cheap, simple, quick and causes minimal trauma.