Questo protocollo fornisce una comprensione sfaccettata dell'attivazione dei processi di morte cellulare, che può fornire approfondimenti critici sui meccanismi della malattia e informare le strategie terapeutiche. Questo protocollo si basa sull'uso di una tecnica più semplice e per accedere all'attivazione di caspasi multiple indispensabili da una singola popolazione di cellule endogene per determinare notevolmente l'attivazione. La morte delle cellule immunitarie innate è stata implicata in tutto lo spettro della malattia, dalle infezioni alle malattie infiammatorie ai tumori.
Comprendere i meccanismi molecolari della morte cellulare attraverso l'attivazione della caspasi può fornire informazioni critiche sui processi patologici. La dott.ssa Julieann, ricercatrice post-dottorato associata da un laboratorio, dimostrerà la procedura. Dopo aver isolato il midollo osseo e differenziato i BMDM, infettare le cellule con il virus dell'influenza A.
Calcolare il volume del virus necessario a una molteplicità di infezione di 20 unità che formano la placca. Rimuovere il mezzo dai BMDM e lavare le cellule una volta con 500 microlitri di PBS. Aggiungere 450 microlitri di virus dell'influenza A in DMEM ad alto glucosio senza FBS inattivato dal calore a ciascun pozzetto e incubare le piastre a 37 gradi Celsius per un'ora in un incubatore umidificato per consentire l'assorbimento.
Al termine dell'incubazione di un'ora, aggiungere 50 microlitri di FBS inattivato dal calore e restituire le piastre all'incubatore a 37 gradi Celsius per un totale di 12 ore. Dopo 12 ore di incubazione, rimuovere la piastra dall'incubatore. Aspirare 150 microlitri di surnatante e scartarlo o salvarlo per l'analisi del surnatante
Non rimuovere il surnatante rimanente. Ora, crea la soluzione di raccolta delle proteine combinando 50 microlitri di tampone di lisi caspasi e 100 microlitri di quattro tampone XSDS per pozzetto. Quindi, aggiungere 150 microlitri di miscela a ciascun pozzetto.
Per ogni pozzetto, pipettare la miscela per raccogliere le cellule lisate e surnatanti. Durante il pipettaggio, raschiare il fondo del pozzetto con la punta della pipetta per interrompere le cellule. Dopo aver raschiato e pipettato, raccogliere il lisato proteico in tubi da 1,5 millilitri etichettati.
Utilizzando un blocco termico, riscaldare tutti i tubi a 100 gradi Celsius per 12 minuti. Rimuovere i tubi dal blocco termico e centrifugare a 14, 500 G per 30 secondi a temperatura ambiente per pellettare eventuali componenti insolubili. Preparare l'apparecchio di elettroforesi con un gel di poliacrilammide al 12% con 10 pozzetti.
Riempire l'apparecchio di elettroforesi con tampone corrente e rimuovere il pettine gel. Quindi, riscaldare i campioni a 100 gradi Celsius per cinque minuti. Centrifugare i campioni a 14.500 G per 30 secondi a temperatura ambiente prima del caricamento.
Quindi, caricare lentamente 30 microlitri del campione in ciascun pozzetto. Utilizzare tampone combinato di lisato supernatante e proteine e tampone di lisi caspasi o omogenato tissutale per caspasi 1, 3, 7 e 8 blot e utilizzare il tampone DN RIPA di lisato proteico descritto nel protocollo o l'omogenato tissutale per caspasi 11 e 9. Per valutare tutte e sei le caspasi contemporaneamente, utilizzare la stessa procedura per caricare gli stessi campioni in ciascuno dei sei gel.
Collegare l'apparecchio di elettroforesi alla fonte di alimentazione e impostare l'alimentazione su 80 volt per 20 minuti per iniziare la corsa del gel. Dopo i primi 20 minuti, regolare l'alimentazione a 100 volt per 45-60 minuti. Osservare il fronte della tintura.
Una volta che la parte anteriore del colorante raggiunge il fondo del gel, spegnere l'alimentazione. Mentre il gel funziona, preparare il buffer di trasferimento come descritto nel manoscritto. Rendi la soluzione fresca ogni volta.
Rimuovere il gel dall'apparecchio di elettroforesi utilizzando il raccoglitore di gel. Per impostare lo stack di trasferimento per il gel, attivare una membrana PVDF immergendola nel metanolo per un minuto. Pre-bagnare due pezzi di carta da filtro, il gel e la membrana PVDF e trasferire il tampone per cinque minuti.
Conservare la membrana e il gel PVDF in contenitori separati durante questa incubazione di cinque minuti. Iniziare ad assemblare la pila di trasferimento sul sistema semi-secco. Sul lato inferiore del nano di platino, posizionare un pezzo di carta da filtro, la membrana PVDF, il gel e, infine, un pezzo di carta da filtro.
Stendere delicatamente o premere le bolle d'aria tra gli strati e chiudere la parte superiore del sistema. Ora, connettiti alla fonte di alimentazione. Impostare l'alimentazione su 25 volt per 40 minuti.
Dopo il trasferimento, smontare la pila di trasferimento, raccogliere la membrana e posizionarla in una capsula di Petri quadrata. Quindi, eseguire il blocco della membrana aggiungendo 15 millilitri di una soluzione di latte scremato al 5% e incubare la membrana su uno shaker a oscillazione a 50-70 giri / min a temperatura ambiente per un'ora. Dopo l'incubazione, rimuovere la soluzione bloccante, aggiungere 10 millilitri della soluzione anticorpale diluita e incubare per due ore a temperatura ambiente o quattro gradi Celsius durante la notte su uno shaker a dondolo, come dimostrato in precedenza.
Quindi, raccogliere la soluzione anticorpale e lavare la membrana aggiungendo 15 millilitri di TBST alla membrana su uno shaker a dondolo a temperatura ambiente per 10 minuti. Eliminare il TBST. Ripetere il lavaggio con 15 millilitri di TBST tre volte.
Aggiungere 10 millilitri della soluzione anticorpale coniugata HRP secondaria diluita. Incubare su uno shaker a dondolo a temperatura ambiente per un'ora. Al termine dell'incubazione, una volta rimossa la soluzione anticorpale, lavare la membrana aggiungendo 15 millilitri di TBST su uno shaker a dondolo a temperatura ambiente per 10 minuti.
Dopo aver completato le fasi di lavaggio e rimosso il TBST, aggiungere 10 millilitri del substrato HRP ad alta sensibilità. Lasciare riposare a temperatura ambiente per un minuto. Rimuovere la membrana dal substrato.
Procedere direttamente all'imaging utilizzando una imager a chemiluminescenza con il vassoio trans bianco accessorio inserito nella posizione inferiore. Esporre la membrana utilizzando la modalità di esposizione automatica. Vengono analizzate le caspasi pro e attivate 1, 11, 3, 7, 8 e 9 nel wild type e nel mutante ZBP1 dopo infezione da virus dell'influenza A, wild type e mutante AIM2 dopo infezione da HSV1 e infezione da Francisella novicida, o BDM wild type e NLRP3 mutante dopo lipopolisaccaride e stimolazione ATP.
Le cellule prive di sensori di PANoptosi a monte non subiscono una robusta morte cellulare in risposta agli stimoli affini che inducono la PANoptosi. L'infezione da virus dell'influenza A induce la formazione del ZBP1-PANoptosoma e le cellule carenti di ZBP1 sono significativamente protette dalla morte cellulare durante l'infezione da virus dell'influenza A. Allo stesso modo, le infezioni da HSV1 e Francisella novicida inducono la formazione del PANoptosoma AIM2 e le cellule carenti di AIM2 non riescono a subire una robusta morte cellulare in risposta a queste infezioni.
Le cellule prive di sensori dell'inflammasoma a monte sono protette dalla morte cellulare in risposta ai rispettivi stimoli e le cellule carenti di NLRP3 non subiscono la morte cellulare in risposta al lipopolisaccaride e all'ATP. È importante ricordare di preparare una miscela di entrambi i lisati cellulari per determinare una caspasi specifica. Dopo aver caricato il getto, il campione luminoso deve essere conservato a meno 20 gradi per mantenere l'integrità degli obiettivi della caspasi per il follow-up In combinazione con questo protocollo, l'imaging della morte cellulare in tempo reale o i saggi LDH possono essere utilizzati per monitorare l'esecuzione della morte cellulare e gli ELIZA possono essere utilizzati per verificare il rilascio di citochine o DAMP da cellule sottoposte a diversi tipi di morte cellulare.
