Questo messaggio può aiutare a rispondere alle domande chiave nell'immunofenotipizzazione nei modelli Murine, come i marcatori utilizzati per identificare diversi lignaggi di immunità e strategie di invecchiamento. Il principale vantaggio di questa tecnica è che il marcatore e le stategie di invecchiamento, durante l'immunofenotipizzazione, possono essere applicati a una varietà di modelli murini. Monitorare il peso corporeo dei topi C57 Black 6 utilizzando un equilibrio.
Inoltre, monitorare il volume tumorale del tumore variando i topi donatori per misura del calibro. Dopo l'eutanasia dell'animale in un cappuccio a rischio biologico secondo il protocollo, sterilizzare la pelle intorno al tumore usando tamponi Iodophor. Dopo aver rimosso chirurgicamente il tumore come descritto nel protocollo di testo, posizionare il tumore in una piastra di Petri contenente 20 millilitri di PBS che è stato pre-refrigerato a 4 gradi Celsius.
Se c'è sangue contaminante, trasferire il tumore in un'altra piastra di Petri e lavare il tumore con PBS. Taglia il tumore a metà. Rimuovere la pelle, i vasi, la calcificazione e la necrosi extra.
Scegli solo pezzi intatti di tumore e mettili in un tubo di centrifuga sterile da 50 millilitri. Aggiungere 20 millilitri di PBS prima di trasportare il tubo in una stanza separata per gli studi farmacologici. Per prepararsi all'impianto ortotopico, fissare un mouse completamente anestetizzato su una scheda di esperimento nella giusta posizione laterale.
Disinfettare la pelle intorno alla milza con idodina e poi de-iodinato con alcool etilico al 75%. Trova il punto mediano della milza e fai un'incisione verticale di 1 centimetro sull'addome per esporre la milza. Delicatamente, estraggono parte del tessuto del pancreas sotto la milza usando una pinzetta a punta piatta.
E il tumore dell'omoinnesto del topo sutro dal topo C al pancreas del topo ricevente per sutura chirurgica bsorbibile 9-O. Chiudi l'addome con una sutura di seta 6-O con doppia cucitura. Ottenere l'omeostasi per compressione.
Dopo aver terminato l'impianto tumorale, tenere l'animale in una gabbia calda finché non si verifica sanguinamento o perdite di tessuto tumorale. Monitorare l'animale fino a quando non riacquistano sufficiente coscienza per mantenere la rimo clemenza sternale. Riportare l'animale nella stanza degli animali dopo il pieno recupero dall'anestesia.
Monitorare il tumore variando i topi palpando l'addome vicino alla milza e selezionare i topi che portano tumori ortotopici. Per ogni tumore, preparare un tubo C con tampone di digestione tumorale. Utilizzare 3 millilitri di tampone di digestione per frammenti tumorali inferiori a 0,8 grammi per garantire che il tumore sia completamente digerito.
Etichettare il tumore con il codice di studio, il tumore, l'ID mouse, il gruppo di trattamento e il peso del tumore. Raccogli il tumore dal topo. Lavare il tumore in PBS freddo e pulire il tessuto attaccato al tumore.
Posizionare il tumore nei mezzi di digestione in un pozzo di una piastra sterile a 6 po '. Tenere il tumore in posizione con pinzette sterili o pinze e affettare con un bisturi. Affettare il tumore abbastanza bene da rompersi in pezzi più piccoli.
Ora, riposizionare i pezzi tumorali nel tubo C e utilizzare il tampone di digestione rimanente per lavare la piastra. Trasferire il fluido nel tubo C e posizionare sul ghiaccio fino alla digestione. Quindi accendere il dissociatore con riscaldatori.
Posizionare il tubo C di dissociazione tumorale capovolto nella manica della posizione vacante. Regola lo stato della posizione del tubo da Libero a Selezionato. Scegliere un programma di dissociazione seguito dalla selezione della cartella richiesta in cui viene visualizzato l'elenco dei programmi.
Dopo la chiusura del programma, togliere il tubo C dal dissociatore e girare brevemente per pallettizzazione del campione. Ora, sospendete i campioni e metteteli in un colino cellulare sopra un tubo da 50 millilitri. Lavare la cella attraverso il filtro cellulare con 10 millilitri di tampone di lavaggio per fornire una sospensione a cella singola.
Dopo aver centrifugato il tubo a 300 G per 5 minuti, scartare il supernatante e sospendere di nuovo le celle con 5 millilitri di tampone di lavaggio. Contare le cellule vitali e regolare la concentrazione cellulare a 1 milione di cellule per tubo o per campione. Eseguire il design del pannello immunitario, l'immunostaining e la fluorescenza meno un controllo come dettaglio nel protocollo di testo.
Preparare le perline UltraComp mentre gli strumenti di flusso si stanno riscaldando in vortice prima dell'uso. Etichettare un tubo campione separato di 12 x 75 millimetri per ogni anticorpo coniugato fluorocromi. Aggiungere 100 microliter di tampone di colorazione a ciascun tubo seguito da una goccia completa delle perline.
Aggiungere anticorpi ed eseguire la procedura di colorazione come descritto nel protocollo di testo. Quindi aggiungere 0,5 millilitri di tampone di colorazione a ogni pellet di perline e sospendere completamente tramite vortice. Ora, impostare la tensione PMT della citometria di flusso per tessuto bersaglio per l'esperimento dato.
Eseguire il campione attraverso il campione attraverso la citometria Flow per l'acquisizione dei dati guadagnando sulla popolazione di perline singoletta per dispersione in avanti e letture a dispersione laterale. Impostare la portata da 200 a 300 eventi al secondo. Impostare la compensazione appropriata per un determinato anticorpo di coniugazione FITC fluoresceina utilizzando un grafico a punti FL1 contro FL1.
Posizionare un cancello del quadrante in modo che le perline negative si trovano all'interno del quadrante in basso a sinistra e le perline positive si trovano all'interno del quadrante superiore o inferiore destro. Regolare i valori di compensazione fino a quando l'intensità mediana della fluoresceina di ogni popolazione è approssimativamente uguale. Ripetere questi passaggi per tutti i tubi.
Ora, procedi all'acquisizione di campioni di macchie reali. Eseguire la Creazione guidata retribuzione e salvare l'impostazione con il formato:data, esperimento e le iniziali. L'impianto ortotopico dell'adenocarcinoma duttale pancreatico ha portato a una rapida crescita tumorale simile a quella osservata nell'impianto sottocutaneo.
Vengono mostrate immagini rappresentative di colorazione di ematossilina ed eosina e dimostrano una crescita simile di impianti sottocutanei e ortotopici. Le rese delle cellule vitali ragionevolmente elevate sono state ottenite dal campione tumorale di entrambi i tipi di impianto. La piattaforma rappresentante FACS mostra cellule vitali dal tumore separate dalle cellule morte e dai detriti cellulari.
Mostrato qui, è un tumore che si infiltra in un confronto del profilo immunitario della popolazione cellulare maggiore e numeratore di diversi sottoinsiemi chiave delle cellule immunitarie tumorali. Vengono mostrati omologhi sottocutanei contro ortotopici del cancro al pancreas. I dati mostrano chiaramente che il tumore ha aumentato significativamente l'infiltrazione delle cellule immunitarie rispetto al pancreas di topi sani.
Inoltre, diverse percentuali di sottogrumi di cellule immunitarie infiltrate nel tumore sono state trovate negli omoinnesti ortotopici rispetto a quelli sottocutanei. Ad esempio, ci sono molto più cellule B in ortotopico che sottocutanee. Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare di preparare in anticipo tutti i materiali e i reagenti associati.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire l'analisi FACS per i modelli murini.
