Questo protocollo fornisce modelli PDAC in vivo riproducibili e immunocompetenti adatti per studi di genotipo, fenotipo e risposta ai farmaci. Il vantaggio principale di questa tecnica è la sua capacità di aiutare a studiare la progressione del tumore con un microambiente tumorale biologico singeneico mantenendo la riproducibilità dell'esperimento. A dimostrare la procedura saranno Stefanie Barthel e Chiara Falcomata, entrambe del nostro laboratorio.
Iniziare la preparazione delle cellule tumorali lavando l'adenocarcinoma duttale pancreatico, o cellule PDAC, coltivate in un pallone di coltura T75 con soluzione salina tamponata fosfato o PBS. Quindi aggiungere 0,5 millilitri di tripsina per cinque a 10 minuti per staccare dal pallone. Risospendere le cellule distaccate in 10 millilitri di DMEM con siero bovino fetale al 10% o FBS e streptomicina alla penicillina allo 0,1% prima di trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 15 millilitri.
Centrifugare la sospensione cellulare a 200G per cinque minuti e aspirare il surnatante. Risospendere il pellet cellulare in DMEM senza additivi, in base alla concentrazione finale richiesta delle cellule per l'iniezione. Contare le cellule in 10 microlitri di sospensione cellulare, utilizzando la camera Neubauer e calcolare il numero di celle disponibili.
Trasferire un millilitro della sospensione diluita, secondo la concentrazione finale richiesta, in un tubo da 1,5 millilitri. Posizionare il tubo su un rotatore fino all'impianto per prevenire l'aggregazione cellulare. Per l'impianto ortotopico di cellule PDAC, applicare la crema per gli occhi al topo analgosedato mentre il topo dorme.
Controllare la sufficiente analgosedazione prima di radere il fianco addominale laterale sinistro del topo analgosedato. Posizionare il mouse, sdraiato sul lato destro, su un tappetino riscaldante sterile e fissare le gambe alla superficie. Indossare guanti nuovi e disinfettarli.
Usando le forbici chirurgiche, tagliare longitudinalmente circa un centimetro della pelle e del tessuto adiposo sottocutaneo sul fianco sinistro dove viene proiettata la milza. Usando forbici e pinze, separare la pelle dal peritoneo per ottenere un accesso più facile al peritoneo. Cambiare il paio di forbici prima di aprire il peritoneo nella posizione della milza con un taglio longitudinale di un centimetro.
Durante la mobilizzazione della milza e del pancreas attaccato utilizzando una pinza smussata e a punta fine, assicurarsi che gli organi non siano attaccati ad altri tessuti. Controllare anche i vasi sanguigni di alimentazione per evitare di ferire i vasi o il tessuto circostante quando si maneggia il pancreas. Estrarre con attenzione il pancreas dall'incisione per consentire un accesso più facile alla coda dell'organo e osservare la milza che segue il pancreas.
Assicurarsi che l'organo non sia piegato durante l'iniezione e che la capsula dell'organo sia tenuta sotto tensione nel sito di penetrazione dell'ago per evitare fuoriuscite. Mirare a un pezzo di tessuto pancreatico tra i vasi sanguigni visibili per ridurre al minimo il rischio di perforare o iniettare il vaso. Usando la mano dominante, penetrare con attenzione la capsula dell'organo con una cannula calibro 27 e una siringa da 50 microlitri seguendo l'asse longitudinale dell'organo.
Dopo aver iniettato i 20 microlitri di sospensione contenenti 2.500 cellule nella zona della coda del pancreas, tenere fermo il pancreas e inserire la siringa per circa un minuto per evitare di versare le cellule tumorali. Quindi, rimuovere l'ago dal sito di iniezione. Quindi, riorganizzare attentamente gli organi all'interno dell'addome senza ferire il tessuto per evitare di versare le cellule.
Evitare l'adesione degli organi versando un millilitro di cloruro di sodio allo 0,9% sugli organi. Dopo aver suturato il peritoneo con la semplice tecnica di sutura interrotta, chiudere la pelle utilizzando due o tre clip avvolte in acciaio inossidabile da nove millimetri. Quindi antagonizzare l'analgosedazione con midazolam, medetomadina e fentanil, o MMF, con un'iniezione sottocutanea di AFN in base al peso corporeo del topo.
Una volta fatto, posizionare il mouse in una camera riscaldata a 37 gradi Celsius fino a quando non è sveglio e completamente attivo. Rimetti il mouse attivo nella sua gabbia originale e monitora lo stato di salute del topo controllando il pelo, il colore della pelle e l'attività e ripetilo tre o quattro ore dopo l'intervento. Nella risonanza magnetica del topo impiantato, l'attecchimento delle cellule PDAC è stato palpato addominale prima a circa sette giorni dopo l'intervento, a seconda del numero di cellule iniettate e delle caratteristiche di aggressività e crescita della linea cellulare inoculata.
La sopravvivenza dei topi impiantati risultanti variava a seconda delle caratteristiche intrinseche delle cellule tumorali delle linee cellulari. Le iniezioni intra-pancreatiche di successo hanno portato a tumori conclamati nel pancreas del topo. Al contrario, gli impianti non riusciti hanno provocato l'assenza di tumori pancreatici a causa dell'iniezione di cellule non vitali, del rigetto delle cellule impiantate o dell'iniezione di un numero insufficiente di cellule.
Ricordarsi di prestare attenzione a non versare alcuna cellula durante le iniezioni e di non danneggiare il tessuto circostante per evitare che le cellule si diffondano all'interno dell'addome. Seguendo questa procedura, gli studi in vivo, come gli studi preclinici di risposta ai farmaci, possono essere eseguiti in topi immunocompetenti, seguiti, ad esempio, da fatti, sequenziamento o analisi istologica per indagare le interazioni dell'ospite tumorale.
