Questo protocollo consente lo studio del cancro al pancreas nel sito del tessuto nativo, riducendo al minimo l'infiammazione durante l'iniezione di cellule tumorali e fornisce un metodo ad alta produttività per generare grandi coorti di topi. Utilizzando la guida ad ultrasuoni, la necessità di chirurgia addominale viene eliminata. Nelle nostre mani, UG-OTIM ha un tasso molto più basso di semina della parete peritoneale rispetto all'impianto ortotopico tradizionale.
UG-OTIM produce tumori che ricapitolano caratteristiche istologiche e immunobiologiche caratteristiche del micro ambiente tumorale pancreatico e possono quindi essere utilizzati per indagare nuove combinazioni terapeutiche in un ambiente clinicamente rilevante. Abbiamo sviluppato questo protocollo per l'immuno-oncologia e le terapie di biologia del cancro, ma potrebbe essere utilizzato in altre aree di ricerca, comprese le indagini sulla normale funzione pancreatica o sugli stati di malattia come il diabete. L'imaging ecografico in tempo reale dell'inserimento e dell'iniezione dell'ago è parte integrante di questo metodo.
Quindi la dimostrazione visiva del passo è fondamentale per la tecnica corretta. Prima di iniziare la procedura, sospendiamo la linea cellulare di adenocarcinoma duttile pancreatico di interesse in un volume appropriato di PBS sterile e freddo sul ghiaccio. Posizionare le gabbie su una piastra riscaldante di 37 gradi Celsius e pulire accuratamente l'armadio di sicurezza biologico, la camera di induzione e lo stadio ad ultrasuoni con uno sterilant appropriato.
Impostare la funzione di riscaldamento dello stadio ad ultrasuoni a 37 gradi Celsius e, dopo l'induzione dell'anestesia, applicare un unguento agli occhi del primo animale. Posizionare il mouse in recumbency dorsale sullo stadio ad ultrasuoni e fissare delicatamente gli arti superiori e inferiori al palco con del nastro adesivo. Utilizzare un applicatore sterile per punta di cotone per applicare un generoso strato di crema depilatoria al quadrante in alto a sinistra dell'addome sulla regione della milza sulla linea mediana.
Dopo un minuto, utilizzare un tampone di garza asciutto per rimuovere delicatamente i capelli prima di rimuovere la crema depilatoria in eccesso con una garza bagnata salina. Quindi posizionare il mouse in una delle nuove gabbie pulite sul più caldo. Per l'impianto di cellule tumorali guidate da ultrasuoni, regolare la piattaforma ad ultrasuoni in modo che la superficie sia parallela al pavimento e stare sul lato sinistro dell'animale con la testa del mouse rivolta a destra.
Regolare la posizione del trasduttore in modo da ottenere un'immagine addominale trasversale e fissare gli arti del mouse alla piattaforma con del nastro adesivo. Abbassare delicatamente il trasduttore per contattare l'addome del topo e regolare il trasduttore fino a quando il pancreas non è chiaramente visibile. Individuare il rene sinistro e la milza per fornire un orientamento accurato nella cavità addominale.
Una volta individuato il sito di iniezione, caricare una siringa per insulina da 29 gage da 1/2 pollice con 25 micro litri della sospensione della cellula tumorale e pulire la punta dell'ago con un tampone sterile per la preparazione dell'alcol. Utilizzare forcep smussate per afferrare la pelle del mouse e la parete peritoneale per aumentare la tensione nel sito di iniezione. Tenendo la siringa con un angolo di circa 25-45 gradi rispetto alla superficie della piattaforma ad ultrasuoni, far avanzare lentamente l'ago attraverso la pelle e la parete peritoneale.
Confermare che l'ago ha perforato attraverso la parete peritoneale prima di utilizzare la visualizzazione ad ultrasuoni per guidare l'ago direttamente nel pancreas. Quando l'ago è in posizione, iniettare lentamente le cellule tumorali. La formazione di un bolo liquido all'interno del pancreas sarà evidente in un pancreas correttamente iniettato tramite ultrasuoni.
Una volta iniettato l'intero volume di sospensione e il bolo liquido può essere osservato tramite ultrasuoni, tenere la siringa molto ferma per diversi secondi prima di ritrarre lentamente l'ago dall'addome del topo, facendo attenzione a non disturbare le cellule iniettate. Quindi posizionare il mouse in una nuova gabbia pulita sullo scaldante con monitoraggio fino al completo recupero. Un corretto posizionamento dell'ago nel pancreas, inclusa la profondità e l'angolo dell'ago, è un passo critico in questo protocollo.
La visualizzazione del bolo liquido aiuta a confermare un'iniezione tumorale riuscita. Controllare la profondità di iniezione è l'aspetto più difficile. Il mio consiglio è di esercitarmi con iniezioni di tripamboo e confermare il bolo liquido sia con ultrasuoni che con necroscopia.
Il monitoraggio dell'impianto tumorale e del tasso di crescita mediante imaging ecografico settimanale rivela tumori contenuti all'interno dei confini del pancreas durante l'intero periodo sperimentale. Le iniezioni di tumore a formicolio elevato si traducono in una percentuale più elevata di animali portanti di tumore tre settimane dopo l'iniezione rispetto alla coorte a basso formicolio. Nonostante il ritardo nell'insorgenza del tumore, il tasso di crescita complessivo del tumore non è significativamente diverso tra le due dosi.
Allo stesso modo, mentre il tasso di sopravvivenza tra le due coorti non è significativamente diverso, tendono a tendere verso una sopravvivenza leggermente migliorata nella coorte di titer basso. La coorte ad alto titer produce anche una maggiore percentuale di topi con tumori che sono inrollabili negli studi preclitici, di quattro settimane dopo l'iniezione. Al sacrificio, l'anatomia grossolana dei tumori del modello di impianto tumorale ortotopico guidato da ultrasuoni è simile a quella dei tumori spontanei KPC e l'analisi istologica dimostra un modello di strutture duttali anomale che è simile in entrambi i modelli e che riassume la morfologia della malattia umana.
In entrambi i modelli, i tumori sono scarsamente infiltrati dalle cellule T, ma altamente infiltrati dai macrofagi. Ricordarsi di tenere la siringa all'angolo appropriato per consentire un ingresso regolare nel pancreas e di confermare che l'ago è nel pancreas prima di procedere con l'iniezione. La crescita tumorale può essere monitorata e i tumori possono essere raccolti per l'analisi mediante fo citometria o immunoistochimica per determinare l'impatto di un intervento.
