Finanziamento per questo progetto è stato fornito dal programma di ricerca di scienza base attraverso la National Research Foundation di Corea (NRF) finanziato dal Ministero delle scienze e TIC (2016R1A2B2006354).

1. preparazione dei Media
<ol><li>Preparare Estratto di lievito con integratori (Sì), sì senza adenina (Sì basso Ade), Pombe Glutamate media (PMG12) e PMG senza adenina (PMG-Ade) mescolando i componenti come descritto nella tabella 1. Sì-Ade (bassa Ade) e piastre PMG-Ade hanno tutti gli stessi componenti, ma l'adenina è omesso da quest'ultimo.<ol>
<li>Utilizzare il seguente stock di sale (50x): 52,5 g/L MgCl2·6H2O, 2 g/L CaCl2·2H2O, 50g/L KCl, 2G/L Na2modo4 in acqua distillata. Filtro sterilizzare usando un filtro di dimensioni dei pori di 0.22-µm e conservare a 4 ° C.</li>
		<li>Utilizzare il seguente vitamina (1, 000 x) magazzino: pantotenato di 1 g/L, 10 g/L di acido nicotinico, inositolo 10 g/L, biotina 10 mg/L in acqua distillata. Filtro sterilizzare usando un filtro di dimensioni dei pori di 0.22-µm e conservare a 4 ° C.</li>
		<li>Utilizzare il seguente minerale (10, 000 x) stock: 5 g/L di acido borico, 4G/L MnSO4, 4G/L ZnSO4·7H2O, 2 g/L FeCl2·4H2O, 0,4 g/L MoO3, 1G/L KI, 0,4 g/L CuSO4·5H2O , 10 g/L di acido citrico in acqua distillata. Filtro sterilizzare usando un filtro di dimensioni dei pori di 0.22-µm e conservare a 4 ° C. Nota: Sì liquido può essere fatto omettendo l'agar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Il mezzo di autoclave e raffreddarlo di sotto di 60 ° C continuando a mescolare con un ancoretta, al ritmo di 200 giri/min.</li>
	<li>Per piastre sì + G418 (geneticin), è necessario aggiungere soluzione di riserva di 1 mL/L G418 al mezzo Sì.<ol>
<li>Utilizzare il seguente G418 (1, 000 x) magazzino: G418 100 mg/mL in acqua distillata. Filtro sterilizzare usando un filtro di dimensioni dei pori di 0.22-µm, aliquota per provette da 1,5 mL centrifuga e store a-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mescolare per un altro 5-10 min e aliquota media nei piatti di Petri di 90 mm (1 L di aliquote medie di circa 40 capsule di Petri. Conservare le piastre a 4 ° C.</li>
</ol>2. clonazione di rpt4 + e suo 5' / 3' UTR
<ol><li>Eseguire PCR con primer p1 e p2 (Figura 1A) mediante fissione lievito DNA genomico (gDNA) come il modello in un volume totale di 50 µ l (~ 1 µ g del DNA, enzima U 20, 1x tampone di reazione), e applicando i cicli di reazione descritti nella tabella 2 per amplificare una 3.315-base frammento di coppia (bp) composto da rpt4 + e suo 5' / 3' UTR. Purificare il prodotto PCR usando un kit di purificazione13 come indicato dal produttore (Figura 1A).</li>
	<li>Digerire il pBlueScript KS(-) vettoriale14 e il frammento di DNA amplificato contenente rpt4 + con suo 5' / 3' UTR con BamH1 e Xho1 in un volume totale di 20 µ l (~ 1 µ g di DNA, 20 U enzima, tampone digestione 1x) a 37 ° C in un bagno d'acqua per 16-18 h (Figura 1B).</li>
	<li>Gel di purificare il vettore digerito (1,2% gel di agarosio) e inserimento di DNA mediante esecuzione di elettroforesi del gel dell'agarosi basati su TAE (100 V, 1h), asportando le bande di DNA della misura desiderata e isolare il DNA con un kit di estrazione gel15.</li>
	<li>Legare il vettore e l'inserimento di DNA usando T4 DNA ligasi eseguendo una reazione di legatura 20-µ l contenente 50-100 ng di DNA, di vettore un ~ 3 volte eccesso molare del DNA dell'inserto, 400 U T4 DNA ligasi e 1x buffer di legatura. Incubare la miscela a 18 ° C per 16-18 h.</li>
	<li>Trasformare il DNA legato in 100 µ l di e. coli DH5α applicando shock termico per 70 s a 42 ° C. Aggiungere 1 mL di LB e incubare per 1h a 37 ° C per il recupero. Eseguire la centrifugazione (13.800 x g), scartare il surnatante, piastra tutti del trasformato Escherichia coli cellule su piastre LB-ampicillina (LA) e incubare a 37 ° C per 16 h.</li>
	<li>Pick 4-8 colonie con degli stuzzicadenti e crescere durante la notte a 37 ° C in media 3 mL LA.</li>
	<li>Isolare i plasmidi con un plasmide purificazione kit16 usato secondo il protocollo del produttore ed eseguire le digestioni analitiche degli enzimi di limitazione con 5 µ l del plasmide isolato, 5 U di ciascun enzima di restrizione (BamH1 e Xho1) e 1x buffer di restrizione. Incubare a 37 ° C in un bagno d'acqua per 3 h. conferma la clonazione mediante sequenziamento plasmidi candidato la miscela di reazione.</li>
</ol>3. introduzione della mutazione silenziosa (Xho1 sito di restrizione)
<ol><li>Progettare un paio degli iniettori 33-bp (p3 e p4) che contengono la mutazione desiderata nella sequenza altrimenti complementare.</li>
	<li>Eseguire PCR con alta fedeltà della polimerasi17 (Figura 1) in un volume totale di 25 µ l (10 ng di plasmide clonato, 2 µ l di 10 pmol mix di primer, 2 U enzima, tampone di reazione 1x) utilizzando i parametri ciclismo riportati nella tabella 3.</li>
	<li>Digerire il plasmide modello con Dpnio in un volume totale di 20 µ l (20 U enzima, 1x buffer di digestione) a 37 ° C in un'acqua del bagno per 1 h.</li>
	<li>Trasformare, propagare, isolare e sequenza il plasmide contenente la mutazione silenziosa, come descritto nei passaggi 2.5-2.7. Nota: La mutazione silenziosa può anche essere introdotto utilizzando un metodo di clonazione che permette per la giunzione dei frammenti di DNA multipli in una singola reazione18.</li>
</ol>4. random mutagenesi di rpt4 + di Error-prone PCR
<ol><li>Eseguire errori PCR, utilizzando il plasmide con la mutazione silenziosa (sitoXho1 ) come il modello, primer p5 e p6, un volume totale di 50 µ l (l'importo del modello definito al punto 4.1.1, 2 µ l di miscela di primer 10 pmol, 2,5 U enzima, 1 tampone di reazione di x) , e una polimerasi speciale che è progettata per generare un errore elevato tasso19 (Figura 1). Eseguire la PCR come descritto nella tabella 2.<ol>
<li>Utilizzare 4-5 µ g di plasmide modello per controllare la frequenza di mutazione a 1KB bp (kilobase). Nota: Un'alta concentrazione (> 500 ng / µ l) del plasmide, che può essere ottenuto utilizzando un mini-prep kit20, è necessario.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilizzare l'elettroforesi del gel per confermare un prodotto PCR di 2670 bp (1,2% gel di agarosio). Gel di purificare questo prodotto PCR come descritto al punto 2.5.</li>
</ol>5. preparazione di frammenti di PCR di Fusion (KAN, 3' UTR)
<ol><li>Eseguire PCR utilizzando pFA6a-KANMX621 come modello, primer p7 e p8 e le condizioni elencate in tabella 4 per ottenere il frammento di marcatore (KAN). Gel di purificare il frammento di 1.480-bp risultante come descritto al punto 2.5 (Figura 1E).<ol>
<li>Verifica se il codone di arresto del gene mirato per mutazione e la regione di codificazione del suo gene adiacenti sono separati da più di 500 bp. Il terminatore endogeno non può essere utilizzato quando questa regione è inferiore a 500 bp; piuttosto, il terminatore di ADH dovrebbe essere usato anziché il terminatore endogeno. I cambiamenti di protocollo necessari per utilizzare il terminatore di ADH sono presentati nella tabella 5. Nota: Queste modifiche si applicano solo quando il terminatore di ADH , che è disponibile nel plasmide pFA6a-3HA-KANMX6, viene utilizzato invece il terminatore endogeno.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eseguire PCR con clonato rpt4 +-contenente vettoriale come il modello e primer p9 e p10 in un volume totale di 50 µ l (20 ng di plasmide clonato, 2 µ l di 10 pmol mix di primer, 2 U enzima, 1x tampone di reazione), utilizzando le condizioni presentate nella tabella 6. Gel di purificare il frammento UTR ottenuti 506-bp 3' (Figura 1E).</li>
</ol>6. generazione del costrutto trasformazione da fusione PCR (Figura 1E)
<ol><li>Preparare i 3 frammenti (mutagenized rpt4 +, KAN e il 3' UTR) a 50 ng / µ l.</li>
	<li>Eseguire la fusione che PCR dei tre frammenti utilizzando primer p11 e p12, come descritto nella tabella 7. (Il protocollo per la fusione PCR è una modifica del protocollo originale22). Purificare il prodotto di PCR di 4.398-bp principale.<ol>
<li>Utilizzare rpt4 +: KAN:3'UTR frammenti con un rapporto di 1:3:1 per ottenere risultati ottimali. Nota: L'importo totale del DNA inserto non deve superare 500 ng. La quantità consigliata di rpt4 +: KAN:3'UTR è 50 ng:150 ng:50 ng. La regione mutagenized è di circa 1,6 kb, quindi il numero minimo delle colonie del lievito che potesse spiegare tutte le possibili combinazioni di ciascuna base essendo mutato agli altri tre è 1.600 x 3 = 4.800 colonie. Perché una reazione di trasformazione in genere produce colonie di 400-500, è necessario almeno 10 reazioni vale la pena di fusione PCR costruire. Questa necessità possa essere soddisfatte semplicemente aumentando la quantità di reazione (cioè, il numero di provette per PCR) di un fattore dieci.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. trasformazione del lievito di fissione mediante elettroporazione (Figura 1F)
<ol><li>Inoculare il lievito a 10 mL di mezzo di sì alla saturazione incubando esso per più di 16 h.</li>
	<li>Diluire le cellule a densità ottica a 600 nm (OD600) di 0,2 in 200 mL di terreno di sì e incubare a 30 ° C con agitazione per 5-6 h, a OD600 = 0.6 - 0.8.</li>
	<li>Concentrare le cellule a OD600 = 30, erogare in quattro provette coniche da 50 mL e chill sul ghiaccio per 10 min.</li>
	<li>Raccogliere le celle eseguendo centrifugazione a 1.050 x g per 3 min a 4 ° C. Posizionare i tubi e 10 electro-cuvette sul ghiaccio. Eseguire la procedura 7.3-7,8 sul ghiaccio.</li>
	<li>Scartare il surnatante e aggiungere 15 mL di sorbitolo 1,2 M. Agitare delicatamente le provette per risospendere le cellule.</li>
	<li>Centrifugare le cellule a 1050 x g per 3 min a 4 ° C.</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 7.4 e 7.5. Scartare il surnatante. Aggiungere 500 µ l di 1,2 M sorbitolo in ogni provetta, risospendere le cellule e raccogliere tutte le celle in una provetta conica da 15 ml.</li>
	<li>Aggiungere 1,2 M sorbitolo fino a 2,4 mL (OD600 = 10 / 0,2 mL). Tenere il tubo sul ghiaccio.</li>
	<li>Aggiungere 200 µ l di cellule sorbitolo-sospesa (assicurarsi che essi sono completamente sospesi) in una provetta di EP contenente la fusione PCR costruire, mescolare bene e trasferire il campione di un electro-cuvetta.</li>
	<li>Electroporate le cellule con le seguenti opzioni: funghi, ShS (2.00kV, 1 impulso).</li>
	<li>Aggiungere 600 µ l di 1,2 M sorbitolo ogni electro-cuvette per un volume totale di 800 µ l e poi diffuso le cellule su quattro piatti Sì (200 µ l/piastra). Dieci electro-cuvette erogherà a 40 sì piastre.</li>
	<li>Incubare le piastre a 30 ° C per 24 h.</li>
	<li>Eseguire piastratura delle repliche a Sì + G418 e incubare le piastre a 30 ° C per 3 giorni.</li>
</ol>8. selezione di mutanti eterocromatina-destabilizzante e la verifica di falsi positivi
<ol><li>Per ogni piastra sì + G418, eseguire piastratura delle repliche di sì-Ade (bassa Ade) e piastre PMG-Ade (No Ade). Incubare le piastre di replica per 1-2 giorni a 30 ° C, fino a quando alcune delle colonie sulle piastre sì-Ade mostrano una colorazione rossa (Figura 1).</li>
	<li>Confronta le piastre sì-Ade e PMG-Ade e selezionare le celle che mostrano rosa o bianco sulla piastra sì-Ade e anche crescono sulla piastra PMG-Ade. Non selezionare colonie senza crescita il PMG-Ade, in quanto essi sono falsi positivi (ad es., riflettendo che la cassetta di KAN è stata integrata in un sito non-bersaglio altrove nel genoma).</li>
	<li>Prendere circa 1 x 105 celle da ogni Colonia e incubare a 10 µ l di soluzione SPZ contenente 2,5 mg/mL zymolyase 100 T a 37 ° C per almeno 30 min. uso 1 µ l di questa soluzione per eseguire come il modello di partenza per la Colonia PCR (Figura 1 H).<ol>
<li>Fare SPZ (50 mL) mescolando 30 mL di sorbitolo 2m, 4,05 mL di 1 M Na2HPO4, 0,95 mL NaH2PO4 e 15 mL di acqua distillata (pH finale, 7.5). Campioni (5 mL) possono essere completati con zymolyase e memorizzati in aliquote di 500-µ l a-20 ° C fino all'utilizzo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eseguire l'elettroforesi del gel (gel di agarosio 1.2%, 180V, 20 min) per visualizzare i risultati di + la PCR della Colonia. Selezionare le reazioni che esibiscono bande PCR delle dimensioni corrette e digeriscono 5 µ l di ciascun prodotto di reazione con Xhoio (4 U enzima, tampone digestione 1x, bagno di acqua di 37 ° C, 1h) per identificare i falsi positivi (Figura 1 H).</li>
	<li>Eseguire l'elettroforesi del gel per visualizzare le raccolte di XhoI (1,2% gel di agarosio, 180 V, 20 min). Contrassegnare le colonie in cui prodotti PCR sono tagliati da XhoIe loro patch a piastre sì + G418 (Figura 1I).</li>
	<li>Isolare gDNA da cellule di lievito di fissione ed eseguire l'ordinamento dei prodotti PCR23. Confronta la sequenza ottenuta con la sequenza wild-type per identificare mutazioni (Figura 1I).</li>
	<li>Direttamente re-introdurre la mutazione di cellule wild-type trasformandoli con costrutti di fusione amplificati dalla PCR da cellule mutanti23. Utilizza individuazione per confermare il fenotipo in cellule mutanti appena effettuate (Figura 1J).<ol>
<li>Costrutto di trasformazione di fusione può essere facilmente amplificato mediante PCR con primer p1 e p10 utilizzando il DNA genomic di mutanti come il modello in un volume totale di 50 µ l (~ 1 µ g del DNA, enzima U 20, 1x tampone di reazione) e applicando i cicli di reazione descritti in tabella 2 . Trasformazione del costrutto può essere fatto seguendo i passaggi 7.1-7.13.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Mutagenesi casuale tramite PCR errori è un potente strumento per la generazione di un pool di diverso mutanti in una determinata regione. Questa tecnica è particolarmente utile per gli studi che cercano di valutare la funzione di una proteina in una circostanza specifica. Ad esempio, abbiamo utilizzato nel presente documento errori PCR per valutare la funzione della 19S proteasome subunità, Rpt4, nella manutenzione di eterocromatina. Variando la regione mirato dalla PCR errori e regolare le condizioni di selezione, si...

Genetica in avanti è un metodo classico, in cui i ricercatori cercano mutanti naturali che visualizzano un fenotipo particolare ed eseguire analisi genetiche. In genetica inversa, mutazioni vengono introdotti in un gene di interesse ed il fenotipo è esaminato. In quest'ultimo caso, mutagenesi casuale di un gene target viene spesso utilizzata per generare un pool di mutanti che sono successivamente selezionato per desiderata fenotipi, come sensibilità di temperatura o alterati di attività enzimatica. Possono essere utilizzati vari metodi per raggiungere mutagenesi casuale, tra cui errori PCR1; Di irradiazione UV2; mutageni chimici, ad esempio methanesulfonate etilico (EMS) o acido nitroso3; l'uso di ceppi di mutator temporanei, come quelli che sovraesprimono mutD5 4; e DNA shuffling5.
Qui, descriviamo una strategia inversa-genetica in cui utilizziamo errori PCR per generare mutanti piscine per un gene dell'obiettivo del lievito di fissione. Come si potrebbe intuire dal suo nome, questo metodo genera mutazioni introducendo deliberatamente errori durante la PCR. A differenza di altri metodi di mutagenesi, errori PCR permette all'utente di definire la regione a essere mutagenizzato. Questo rende particolarmente utile negli sforzi per studiare la funzione di una proteina/dominio di interesse.
Per illustrare questa procedura di mutagenesi casuale, qui usiamo rpt4 +, che codifica per la subunità del proteasoma 19S, come un esempio. Rpt4 ha dimostrato di avere funzioni di proteolisi-indipendente negli organismi diversi da fissione lievito6,7,8,9, e un difetto nella proteolisi potrebbe causare effetti indiretti alterando proteine livelli. Abbiamo, quindi, sottoposti a screening per mutanti che ha attivato la proteolisi-indipendente modifiche, con l'obiettivo di indagare la funzione del proteasoma su eterocromatina.
Errori PCR può essere applicato a qualsiasi regione del gene regolando la posizione a cui associare il primer. Mutanti che presentano la variazione fenotipica desiderata possono essere identificati con i giornalisti appropriati. Qui, abbiamo utilizzato un reporter ade6 + inserito al centromero 1 esterno ripetere (otr) regione10. Eterocromatina costitutiva è formata a questa regione11, così il ade6 + reporter viene messo a tacere nella condizione di selvaggio-tipo; Questo è indicato da colonie rosse10. Una mutazione che destabilizza l'eterocromatina costitutiva al centromero porterà all'espressione del ade6 + reporter, che è visualizzato come colonie bianchi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="825">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">1. Media</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Glucose</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8270-10KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:155px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">212720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">L-Leucine</td>
			<td style="width:155px;">JUNSEI</td>
			<td style="width:119px;">87070-0310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Adenine sulfate</td>
			<td style="width:155px;">ACR</td>
			<td style="width:119px;">16363-0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Uracil&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">U0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">L-Histidine</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H8125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">1.05108.0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">NaCl</td>
			<td style="width:155px;">JUNSEI</td>
			<td style="width:119px;">19015-0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:267px;">MgSO4&#8226;7H2O</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">63140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:267px;">CaCl2</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">12095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Potassium phthalate</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P6758-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Inositol</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I7508-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Biotin</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B4501-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Boric Acid</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B6768-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">MnSO4</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M7634-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:267px;">ZnSO4&#8226;7H2O&#160;</td>
			<td style="width:155px;">JUNSEI</td>
			<td style="width:119px;">83060-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:267px;">FeCl2&#8226;4H2O</td>
			<td style="width:155px;">KANTO</td>
			<td style="width:119px;">CB8943686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Sodium molybdate dihydrate</td>
			<td style="width:155px;">YAKURI</td>
			<td style="width:119px;">31621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">KI</td>
			<td style="width:155px;">JUNSEI</td>
			<td style="width:119px;">80090-0301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:267px;">CuSO4&#8226;5H2O</td>
			<td style="width:155px;">YAKURI</td>
			<td style="width:119px;">09605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">D-myo-inositol</td>
			<td style="width:155px;">MP biomedicals</td>
			<td style="width:119px;">102052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Pantothenate</td>
			<td style="width:155px;">YAKURI</td>
			<td style="width:119px;">26003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Nicotinic Acid</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">N4126-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:267px;">(NH4)2SO4&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A4418-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Agarose</td>
			<td style="width:155px;">Biobasic</td>
			<td>D0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">G418, geneticin</td>
			<td style="width:155px;">LPS</td>
			<td style="width:119px;">G41805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">2. Enzyme reactions</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase</td>
			<td style="width:155px;">Aglient</td>
			<td style="width:119px;">600380</td>
			<td>For site-directed mutagenesis</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">GeneMorphII Random mutagenesis Kit</td>
			<td style="width:155px;">Aglient</td>
			<td style="width:119px;">200500</td>
			<td>For error-prone PCR</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td style="width:155px;">Thermo Fisher</td>
			<td>F-530L</td>
			<td>For fusion PCR</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Ex Taq&#160;DNA Polymerase</td>
			<td style="width:155px;">Takara</td>
			<td style="width:119px;">RR001b</td>
			<td>For general PCR</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">BamH1</td>
			<td style="width:155px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">R0136S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">Xho1</td>
			<td style="width:155px;">New England BioLabs</td>
			<td>R0146S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">Dpn1</td>
			<td style="width:155px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">R0176S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">3. Equipment</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Velveteen square, black</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">89033-116</td>
			<td>For replica</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Replica-plating tool</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">25395-380</td>
			<td>For replica</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">MicroPulser Electroporator</td>
			<td style="width:155px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">1652100&#160;</td>
			<td>For fission yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">Electroporation Cuvettes, 0.2 cm gap</td>
			<td style="width:155px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">1652086&#160;</td>
			<td>For fission yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Thermal Cycler</td>
			<td style="width:155px;">Bioer</td>
			<td style="width:119px;">BYQ6078</td>
			<td>For fusion PCR ramp reaction&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gene-targeted random mutagenesis to select heterochromatin-destabilizing proteasome mutants in fission yeast

Mutagenesi casuale di geni bersaglio è comunemente usata per identificare le mutazioni che producono il fenotipo desiderato. Dei metodi che possono essere utilizzati per raggiungere mutagenesi casuale, errori PCR è una strategia conveniente ed efficiente per la generazione di un pool di diverso mutanti (i. e., una libreria mutante). Errori PCR è il metodo di scelta quando un ricercatore cerca di mutare una regione pre-definita, come la regione di codificazione di un gene lasciando inalterato altre regioni genomiche. Dopo la libreria mutante è amplificata dalla PCR errori, deve essere clonato in un plasmide adatto. La dimensione della biblioteca generata da errori PCR è limitata dall'efficienza del passaggio clonazione. Tuttavia, il lievito di fissione, Schizosaccharomyces pombe, il clonazione passo possa essere sostituito dall'uso di una fusione altamente efficiente One-Step PCR per generare costrutti per la trasformazione. Mutanti di fenotipi desiderati quindi sono selezionabili utilizzando appropriati ai giornalisti. Qui, descriviamo questa strategia in dettaglio, prendendo come esempio, un reporter inserito all'eterocromatina centromerica.

I mutanti di Rpt4 acquisiti seguendo le procedure descritte nella Figura 1 possono essere analizzati valutando i colori delle colonie. I colori delle colonie sono macchiati sulle piastre pertinenti nel fare diminuire il numero delle cellule nella Figura 2. Il reporter ade6 + inserito presso la regione di eterocromatina è messo a tacere nel selvaggio-tipo e Mostra colonie rosse in piastra sì-Ade. Una volta che l'eterocr...

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Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

Gene targeting mutagenesi casuale per selezionare eterocromatina-destabilizzare Proteasome mutanti in lievito di fissione

Questo articolo descrive una metodologia dettagliata per mutagenesi casuale di un determinato gene in lievito di fissione. Ad esempio, noi target rpt4 +, che codifica per una subunità del proteasoma 19S e schermo per le mutazioni che destabilizzare eterocromatina.

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

gene-targeted-random-mutagenesis-to-select-heterochromatin

Research

JoVE Journal

Genetics

10.6K Views.  Korea Advanced Institute of Science and Technology. Questo articolo descrive una metodologia dettagliata per mutagenesi casuale di un determinato gene in lievito di fissione. Ad esempio, noi target rpt4 +, che codifica per una subunità del proteasoma 19S e schermo per le mutazioni che destabilizzare eterocromatina.

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Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Genetically-encoded histone-miniSOG induces genome-wide heritable mutations in a blue&#160;light-dependent manner. This mutagenesis method is simple, fast, free of toxic chemicals, and well-suited for forward genetic screening and transgene integration.

Optogenetic caso Mutagenesi Utilizzando istone-miniSOG in<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Ricerca

Genetica

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the conventional approaches of permanent gene deletion cannot be applied to essential genes. We have pioneered a unique collection of ~70 temperature-sensitive (ts) lethal mutants for studying cell cycle regulation in the unicellular green algae Chlamydomonas reinhardtii1. These mutations identify essential genes, and the ts alleles can be conditionally inactivated by temperature shift, providing valuable tools to identify and analyze essential functions. Mutant collections are much more valuable if they are close to comprehensive, since scattershot collections can miss important components. However, this requires the efficient collection of a large number of mutants, especially in a wide-target screen. Here, we describe a robotics-based pipeline for generating ts lethal mutants and analyzing their phenotype in Chlamydomonas. This technique can be applied to any microorganism that grows on agar. We have collected over 3000 ts mutants, probably including mutations in most or all cell-essential pathways, including about 200 new candidate cell cycle mutations. Subsequent molecular and cellular characterization of these mutants should provide new insights in plant cell biology; a comprehensive mutant collection is an essential prerequisite to ensure coverage of a broad range of biological pathways. These methods are integrated with downstream genetics and bioinformatics procedures for efficient mapping and identification of the causative mutations that are beyond the scope of this manuscript.

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Temperature-sensitive (ts) lethal mutants are valuable tools to identify and analyze essential functions. Here we describe methods to generate and classify ts lethal mutants in high throughput.

High-throughput robotizzata Assisted Isolamento di sensibile alla temperatura letale Mutants in<em&gt; Reinhardtii Chlamydomonas</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting mutant alleles reside at their endogenous genomic sites and no exogenous DNA sequences are left in the genome following the procedure. Since in haploid yeast cells each of the four core histone proteins is encoded by two non-allelic genes with highly homologous open reading frames (ORFs), targeting mutagenesis specifically to one of two genes encoding a particular histone protein can be problematic. The strategy we describe here bypasses this problem by utilizing sequences outside, rather than within, the ORF of the target genes for the homologous recombination step. Another feature of this system is that the regions of DNA driving the homologous recombination steps can be made to be very extensive, thus increasing the likelihood of successful integration events. These features make this strategy particularly well-suited for histone gene mutagenesis, but can also be adapted for mutagenesis of other genes in the yeast genome.

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

A strategy for generating mutations in histone genes at their endogenous location in Saccharomyces cerevisiae is presented.

Mirata<em&gt; In Situ</em&gt; mutagenesi dell&#39;istone geni in germogliamento lievito

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play in the functioning of cells and whole organisms. This cause has been tremendously aided by the recent introduction of the CRISPR/Cas9 system-a versatile tool that allows researchers to manipulate the genome and transcriptome in order to, among other things, knock out, knock down, or knock in genes in a targeted manner. For the purpose of knocking out a gene, CRISPR/Cas9-mediated double-strand breaks recruit the non-homologous end-joining DNA repair pathway to introduce the frameshift-causing insertion or deletion of nucleotides at the break site. However, an individual guide RNA may cause undesirable off-target effects, and to rule these out, the use of multiple guide RNAs is necessary. This multiplicity of targets also means that a high-volume screening of clones is required, which in turn begs the use of an efficient high-throughput technique to genotype the knockout clones. Current genotyping techniques either suffer from inherent limitations or incur high cost, hence rendering them unsuitable for high-throughput purposes. Here, we detail the protocol for using fluorescent PCR, which uses genomic DNA from crude cell lysate as a template, and then resolving the PCR fragments via capillary gel electrophoresis. This technique is accurate enough to differentiate one base-pair difference between fragments and hence is adequate in indicating the presence or absence of a frameshift in the coding sequence of the targeted gene. This precise knowledge effectively precludes the need for a confirmatory sequencing step and allows users to save time and cost in the process. Moreover, this technique has proven to be versatile in genotyping various mammalian cells of various tissue origins targeted by guide RNAs against numerous genes, as shown here and elsewhere.

The genotyping technique described here, which couples fluorescent polymerase chain reaction (PCR) to capillary gel electrophoresis, allows for high-throughput genotyping of nuclease-mediated knockout clones. It circumvents limitations faced by other genotyping techniques and is more cost effective than sequencing methods.

Usando una tecnica fluorescente PCR-capillare elettroforesi su gel al genotipo CRISPR / Cas9 mediata Knockout Mutants in un formato high-throughput

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical regions, is caused by infection with Plasmodium parasites. The development of more effective drugs to combat malaria can be accelerated by improving our understanding of the biology of this complex parasite. Genetic manipulation of these parasites is key to understanding their biology; however, historically the genome of P. falciparum has been difficult to manipulate. Recently, CRISPR/Cas9 genome editing has been utilized in malaria parasites, allowing for easier protein tagging, generation of conditional protein knockdowns, and deletion of genes. CRISPR/Cas9 genome editing has proven to be a powerful tool for advancing the field of malaria research. Here, we describe a CRISPR/Cas9 method for generating glmS-based conditional knockdown mutants in P. falciparum. This method is highly adaptable to other types of genetic manipulations, including protein tagging and gene knockouts.

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

We describe a method for generating glmS-based conditional knockdown mutants in Plasmodium falciparum using CRISPR/Cas9 genome editing.

CRISPR/Cas9 Gene Editing per rendere la mutanti condizionali del parassita di Malaria umana da p. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool commonly used in yeast studies. The expression of a number of neurodegenerative disease-associated proteins in yeast causes cytotoxicity and aggregate formation, recapitulating findings seen in patients with these disorders. Here, we describe a method for screening a yeast model of the Amyotrophic Lateral Sclerosis-associated protein FUS for modifiers of its toxicity. Instead of using transformation, this new screening platform relies on the mating of yeast to introduce an arrayed library of plasmids into the yeast model. The mating method has two clear advantages: first, it is highly efficient; second, the pre-transformed arrayed library of plasmids can be stored for long-term as a glycerol stock, and quickly applied to other screens without the labor-intensive step of transformation into the yeast model each time. We demonstrate how this method can successfully be used to screen for genes that modify the toxicity of FUS.

This article presents a mating-based method to facilitate overexpression screening in budding yeast using an arrayed plasmid library.

Sovraespressione di accoppiamento-based Library Screening in lievito

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives each year. Effective treatment options able to halt disease progression are lacking. Despite the extensive sequencing efforts in large patient populations, the majority of ALS and PD cases remain unexplained by genetic mutations alone. Epigenetics mechanisms, such as the post-translational modification of histone proteins, may be involved in neurodegenerative disease etiology and progression and lead to new targets for pharmaceutical intervention. Mammalian in vivo and in vitro models of ALS and PD are costly and often require prolonged and laborious experimental protocols. Here, we outline a practical, fast, and cost-effective approach to determining genome-wide alterations in histone modification levels using Saccharomyces cerevisiae as a model system. This protocol allows for comprehensive investigations into epigenetic changes connected to neurodegenerative proteinopathies that corroborate previous findings in different model systems while significantly expanding our knowledge of the neurodegenerative disease epigenome.

This protocol outlines experimental procedures to characterize genome-wide changes in the levels of histone post-translational modifications (PTM) occurring in connection with the overexpression of proteins associated with ALS and Parkinson&#39;s disease in Saccharomyces cerevisiae models. After SDS-PAGE separation, individual histone PTM levels are detected with modification-specific antibodies via Western blotting.

Alterazioni di modificazione post-traduzionale istone caratterizzante nel lievito Neurodegenerative Proteinopathy modelli

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely related biochemical pathways. Previous methods such as the Synthetic Genetic Array (SGA) analysis, and random mutagenesis techniques using ultraviolet (UV) or chemicals like ethyl methanesulfonate (EMS) or N-ethyl-N- nitrosourea (ENU), have been widely used but are often costly and laborious. Also, these mutagen-based screening methods are frequently associated with severe side effects on the organism, inducing multiple mutations that add to the complexity of isolating the suppressors. Here, we present a simple and effective protocol to identify suppressor mutations in mutants which confer a growth defect in Schizosaccharomyces pombe. The fitness of cells with a growth deficiency in standard rich liquid media or synthetic liquid media can be monitored for recovery using an automated 96-well plate reader over an extended period. Once a cell acquires a suppressor mutation in the culture, its descendants outcompete those of the parental cells. The recovered cells that have a competitive growth advantage over the parental cells can then be isolated and backcrossed with the parental cells. The suppressor mutations are then identified using whole-genome sequencing. Using this approach, we have successfully isolated multiple suppressors that alleviate the severe growth defects caused by loss of Elf1, an AAA+ family ATPase that is important in nuclear mRNA transport and maintenance of genomic stability. There are currently over 400 genes in S. pombe with mutants conferring a growth defect. As many of these genes are uncharacterized, we propose that our method will hasten the identification of novel functional interactions with this user-friendly, high-throughput approach.

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

We present a simple suppressor screen protocol in fission yeast. This method is efficient, mutagen-free, and&#160; selective&#160; for&#160; mutations that&#160; often&#160; occur at&#160; &#160;a&#160; single&#160; genomic&#160; locus.&#160; The protocol is suitable for isolating suppressors that alleviate growth defects in liquid culture that are caused by a mutation or a drug.

Una schermata di soppressore Deep-sequenziamento-assistita, spontanea nel lievito a fissione Schizosaccharomyces pombe

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely ...

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and computational approaches. One such method is the yeast one-hybrid (Y1H) assay, in which interactions between TFs and DNA regions are tested in the milieu of the yeast nucleus using reporter genes. Y1H assays involve two components: a &#8216;DNA-bait&#8217; (e.g., promoters, enhancers, silencers, etc.) and a &#8216;TF-prey,&#8217; which can be screened for reporter gene activation. Most published protocols for performing Y1H screens are based on transforming TF-prey libraries or arrays into DNA-bait yeast strains. Here, we describe a pipeline, called enhanced Y1H (eY1H) assays, where TF-DNA interactions are interrogated by mating DNA-bait strains with an arrayed collection of TF-prey strains using a high density array (HDA) robotic platform that allows screening in a 1,536 colony format. This allows for a dramatic increase in throughput (60 DNA-bait sequences against &#62;1,000 TFs takes two weeks per researcher) and reproducibility. We illustrate the different types of expected results by testing human promoter sequences against an array of 1,086 human TFs, as well as examples of issues that can arise during screens and how to troubleshoot them.

Here, we present an enhanced yeast one-hybrid screening protocol to identify the transcription factors (TFs) that can bind to a human DNA region of interest. This method uses a high-throughput screening pipeline that can interrogate the binding of &#62;1,000 TFs in a single experiment.

Schermi di monoibrido lievito avanzata per identificare il fattore di trascrizione associazione a sequenze di DNA umano

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, Eastern equine encephalitis, lymphatic filariasis, and Saint Louis encephalitis. Notably, avian malaria has played a major role in the extinction of numerous endemic island bird species, while WNV has become an important vector-borne disease in the United States. To gain further insight into C. quinquefasciatus biology and expand their genetic control toolbox, we need to develop more efficient and affordable methods for genome engineering in this species. However, some biological traits unique to Culex mosquitoes, particularly their egg rafts, have made it difficult to perform microinjection procedures required for genome engineering. To address these challenges, we have developed an optimized embryo microinjection protocol that focuses on mitigating the technical obstacles associated with the unique characteristics of Culex mosquitoes. These procedures demonstrate optimized methods for egg collection, egg raft separation and other handling procedures essential for successful microinjection in C. quinquefasciatus. When coupled with the CRISPR/Cas9 genome editing technology, these procedures allow us to achieve site-specific, efficient and heritable germline mutations, which are required to perform advanced genome engineering and develop genetic control technologies in this important, but currently understudied, disease vector.

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

This protocol describes microinjection procedures for Culex quinquefasciatus embryos that are optimized to work with CRISPR/Cas9 gene editing tools. This technique can efficiently generate site-specific, heritable, germline mutations that can be used for building genetic technologies in this understudied disease vector.

Tecniche di microiniezione embrionale per un'efficiente mutagenesi sito-specifica in Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, ...