이 프로젝트에 대 한 지원 자금 기본 과학 연구 프로그램을 통해 국가 연구 재단의 한국 (NRF) 과학과 ICT (2016R1A2B2006354)에 의해 자금에 의해 제공 되었다.

1입니다. 미디어 준비
<ol><li>준비 효 모 추출 보충 교재 (예), 네 아데닌 (예 로우 에이드), Pombe 조미료 매체 (PMG12), 그리고 PMG 없이 아데닌 (PMG-Ade) 없이 표 1에 설명 된 대로 구성 요소를 혼합 하 여. 예-에이드 (Ade 낮은)와 PMG-에이드 접시 같은 구성 요소를 모두 하지만 아데닌 후자에서 생략 됩니다.<ol>
<li>다음 소금 (50 x) 주식을 사용: 52.5 g/L MgCl2·6H2O, 2 g/L CaCl2·2H2O, 50 g/L KCl, 2 g/L 나24 에 증류수 그래서. 필터는 0.22 μ m 기 공 크기 필터를 사용 하 여 소독 및 4 ° c.에 저장</li>
		<li>다음과 같은 비타민을 사용 하 여 (1, 000 x) 주식: 1 g/L pantothenate, 10 g/L 니코틴산 산, 이노 시 톨 10 g/L, 증류수 비오 틴 10 mg/L. 필터는 0.22 μ m 기 공 크기 필터를 사용 하 여 소독 및 4 ° c.에 저장</li>
		<li>다음 미네랄을 사용 하 여 (10, 000 x) 주식: 붕 5 g/L, 4 g/L MnSO4, 4 g/L ZnSO4·7H2O, 2 g/L FeCl2·4H2O, 0.4 g/L MoO3, 1 g/L 0.4 g/L CuSO4·5H2O 기 증류수에 연산 10 g/L. 필터는 0.22 μ m 기 공 크기 필터를 사용 하 여 소독 및 4 ° c.에 저장 참고: 네 액체 매체는 agar를 생략 하 여 만들 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>압력솥 매체 200 rpm의 속도로 저 어 바 교 반 하면서 60 ° C 아래에 그것을 냉각 하 고.</li>
	<li>예 + G418 (geneticin) 판 예 매체 1 mL/L G418 재고 솔루션을 추가 합니다.<ol>
<li>다음 G418 사용 (1, 000 x) 주식: 100 mg/mL 증류수에 G418. 필터-20 ° c.에 0.22 μ m 기 공 크기 필터, 1.5 mL 원심 분리기 튜브 및 저장소에 aliquot를 사용 하 여 소독</li>
	</ol>
</li>
	<li>또 다른 5-10 분, 약 수에 대 한 미디어 90 mm 페 트리 접시 (대략 40 접시를 중간 aliquots의 1 L에 저. 4 ° c.에 접시를 저장</li>
</ol>2. 복제 rpt4 + 와 그것의 5' / 3' Utr의
<ol><li>PCR 뇌관 p1와 p2 수행 (그림 1A) 분열을 사용 하 여 50 µ L (~ 1 µ g DNA, 20 U 효소 반응 버퍼 x 1)의 총 볼륨에 템플릿으로 genomic DNA (gDNA)를 효 모 그리고 3,315 베이스 증폭 반응 사이클을 표 2 에 설명 된 적용 쌍 (bp) 조각 rpt4 + 및 그것의 5' / 3' Utr. (그림 1A) 제조업체 지시에 따라 정화 키트13 를 사용 하 여 PCR 제품을 정화.</li>
	<li>PBlueScript KS(-) 벡터14 16 18 물 목욕에서 37 ° C에서 rpt4 + 와 그것의 5' / 3' Utr BamH1 와 Xho1 (~ 1 µ g의 DNA, 효소, U-20-1 x 소화 버퍼) 20 µ L의 전체 볼륨에 포함 된 증폭된 한 DNA 파편을 소화 h (그림 1B)입니다.</li>
	<li>젤 소화 벡터 (1.2 %agarose 젤)를 정화 하 고 태 기반 agarose 젤 전기 이동 법 (100 V, 1 시간)을 수행, 원하는 크기의 DNA 밴드를 절 개 하 고 젤 추출 키트15DNA를 분리 하 여 DNA 삽입.</li>
	<li>벡터 및 벡터 DNA의 50-100 ng를 포함 20 µ L 결 찰 반응을 수행 하 여 T4 DNA 리가 사용 하 여 DNA 삽입을 위하여는 ~ 삽입 DNA, 400 U T4 DNA 리가 고 결 찰 버퍼 x 1의 3 어 금 니 과잉. 16-18 h 18 ° C에이 혼합물을 품 어.</li>
	<li>열 충격 70을 적용 하 여 합자 DNA를 대장균 DH5α의 100 µ L에 변환 42 ° c.에 s 파운드의 1 mL을 추가 하 고 복구에 대 한 37 ° C에서 1 시간에 품 어. 원심 (13,800 x g)를 변형된 대장균 의 모든 파운드-암 피 실린 (라) 접시에 셀 16 h 37 ° C에서 품 어, 표면에 뜨는 접시를 삭제 합니다.</li>
	<li>이쑤시개와 4-8 식민지를 선택 하 고 하룻밤 3 mL 라 중간에서 37 ° C에서 성장.</li>
	<li>한 플라스 미드 정화 키트16 제조업체의 프로토콜에 따라 사용 되는 플라스 미드를 분리 하 고 고립 된 플라스 미드, 각 제한 효소 (BamH1 및 의 U 5의 5 µ L로 분석 금지 효소 소화를 수행 Xho1) 제한 버퍼 1. 3 헤 시퀀싱 후보 플라스 미드로 복제 하는 확인에 대 한 물 목욕에서 37 ° C에서 반응 혼합물을 품 어.</li>
</ol>3. 침묵 돌연변이 (Xho1 제한 사이트) 소개
<ol><li>한 쌍의 33-bp 뇌관 (p3 및 p4) 그렇지 않으면 보완 순서로 원하는 돌연변이 포함 하는 디자인.</li>
	<li>25 µ L의 전체 볼륨에 높은 중 합 효소17 (그림 1C) PCR을 수행 (10 복제 플라스 미드, 10 pmol 뇌관 믹스, 2 U 효소, 1 x 반응 버퍼 2 µ L의 ng) 자전거 매개 변수를 사용 하 여 표 3에 나열 된.</li>
	<li>DpnI 20 µ L (20 U 효소, 1 x 소화 버퍼) 37 ° c 물에서의 전체 볼륨에 h 1에 대 한 목욕으로 템플릿 플라스 미드를 소화.</li>
	<li>변환 하 고, 전파 하 고 분리, 한 시퀀싱 단계 2.5-2.7에서에서 설명한 대로 자동 돌연변이 포함 하는 플라스 미드. 참고: 또한 단일 반응18여러 DNA 파편의 합류에 대 한 허용 하는 복제 메서드를 사용 하 여 자동 돌연변이 도입 수 있습니다.</li>
</ol>4. 무작위 Mutagenesis의 rpt4 + 오류가 PCR에 의해
<ol><li>서식 파일, 뇌관 p5 및 p6, 50 µ L (단계 4.1.1, 10 pmol 뇌관 믹스, 2.5 U 효소, 1 x 반응 버퍼 2 µ L에서에서 정의 하는 서식 파일의 금액)의 총 볼륨으로 침묵 돌연변이 (Xho1 사이트)와 플라스 미드를 사용 하 여 오류가 PCR을 수행 그리고 높은 오류를 생성 하도록 설계 된 특별 한 중 합 효소 평가19 (그림 1D). 표 2에 설명 된 대로 PCR을 수행 합니다.<ol>
<li>서식 파일 플라스 미드의 4-5 µ g를 사용 하 여 1 bp/kb (kilobase) 돌연변이 주파수를 제어. 참고: 고 농도 (> 500 ng / µ L) 소형 예비 키트20를 사용 하 여 얻을 수 있습니다, 플라스 미드의 필수입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>젤 전기 이동 법을 사용 하 여 확인 (1.2 %agarose 젤) 2670 bp의 PCR 제품. 2.5 단계에서 설명한 대로 젤이 PCR 제품을 정화.</li>
</ol>5. 퓨전 PCR 파편 (칸, 3' UTR)의 준비
<ol><li>서식 파일, 프라이 머 p 7과 p8,으로 pFA6a KANMX621 을 사용 하 여 PCR을 수행 하 고 마커 (칸) 조각을 표 4에 나열 된 조건. 젤 단계 2.5 (그림 1E)에 설명 된 대로 결과 1480-bp 조각 정화.<ol>
<li>정지 codon 돌연변이 그것의 인접 한 유전자의 코딩 지구에 대 한 타겟 유전자의 500 이상의 구분 됩니다 경우 확인 혈압. 이 지구는 500 미만 때 생 터미네이터 사용할 수 없습니다 혈압; 오히려, ADH 터미네이터 생 터미네이터 대신 사용 되어야 한다. ADH 터미네이터를 사용 하는 데 필요한 프로토콜 변경 표 5에 표시 됩니다. 참고: 이러한 변경 내용은 ADH 터미네이터 pFA6a-3HA-KANMX6 플라스 미드에서 사용할 수 있는 내 생 터미네이터 대신 사용 하는 경우에 적용 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PCR를 수행 하는 복제 rpt4 +-템플릿과 뇌관 p9, p10 50 µ L의 총 볼륨에서으로 벡터를 포함 (20 복제 플라스 미드, 10 pmol 뇌관 믹스, 2 U 효소, 1 x 반응 버퍼 2 µ L의 ng), 표 6에 제시 하는 조건을 사용 하 여. 젤 정화 획득 506-혈압 3' UTR 조각 (그림 1E).</li>
</ol>6. 퓨전 PCR (그림 1E)에 의해 변환 구문이 생성
<ol><li>50 ng / µ L에서 3 조각 (mutagenized rpt4 +, 칸, 그리고 3' UTR)를 준비 합니다.</li>
	<li>퓨전 3의 PCR 파편 뇌관 p11 및 p12를 사용 하 여 표 7에 설명 된 대로 수행 합니다. (융해 PCR 프로토콜은 원래 프로토콜22의 수정입니다.) 주요 4,398 bp의 PCR 제품을 정화.<ol>
<li>Rpt4 +사용: KAN:3'UTR 1의 비율로 조각: 최적의 결과 대 한 3:1. 참고: 삽입 DNA의 총 금액 500을 넘지 말아야 한다 니. Rpt4 +의 권장된 금액: KAN:3' UTR는 50 ng:150 ng:50 ng. Mutagenized 지역에서 약 1.6 kb가 이므로 다른 3 돌연변이 되 고 각 자료의 모든 가능한 조합에 대 한 계정을 것 이라고 하는 효 모 식민지의 최소 수는 1, 600 x 3 = 4800 식민지. 한 변환 반응 일반적으로 400-500 식민지 수율, PCR 건설 융합의 가치가 10 반응 필요 합니다. 이 필요 10의 요인에 의해 단순히 증가 반응 (즉, PCR 튜브의 수)에 의해 충족 될 수 있다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. 변화의 Electroporation (그림 1 층)으로 분열 효 모
<ol><li>16 시간 이상 배양 하 여 누 룩 채도 예 매체의 10 mL을 접종.</li>
	<li>600에서 광학 밀도를 셀 희석 예 매체의 0.2에서 200 mL의 nm (OD600)와 OD600 5-6 h 동안 흔들어 30 ° C에 품 어 = 0.6-0.8.</li>
	<li>OD600 세포 집중 = 30, 4 개의 50 mL 원뿔 관에 분배 하 고 10 분 동안 얼음에 진정.</li>
	<li>4 ° c.에 3 분 1050 x g에서 원심 분리를 수행 하 여 셀을 수확 얼음에 튜브와 10 전기-큐 벳을 놓습니다. 얼음에 7.3 7.8 단계를 수행 합니다.</li>
	<li>삭제는 상쾌한 고 1.2 M sorbitol의 15 mL를 추가 합니다. 부드럽게 튜브 resuspend 세포를 흔들어.</li>
	<li>1050 x g 4 ° c.에 3 분에 세포를 원심</li>
	<li>7.4 및 7.5 단계를 반복 합니다. 폐기는 상쾌한. 각 관에 1.2 M sorbitol의 500 µ L을 추가 하 고 셀, resuspend 한 15 ml 원뿔 튜브에 세포의 모든 수집.</li>
	<li>1.2 M sorbitol 추가 최대 2.4 mL (OD600 = 0.2 mL 당 10). 얼음에 튜브를 유지.</li>
	<li>Sorbitol 중단 셀 (그들은 완전히 일시 중지 되었는지 확인)의 200 µ L 추가 퓨전 PCR을 포함 하는 EP 튜브 구성, 잘, 그리고 전기 멧에 샘플을 전송.</li>
	<li>Electroporate 다음 옵션으로 셀: 버섯, ShS (2.00kV, 1 펄스).</li>
	<li>800 µ L의 전체 볼륨에 대 한 각 전기 멧을 1.2 M sorbitol의 600 µ L을 추가 하 고 4 예 판 (200 µ L/접시)에 셀을 확산. 10 전기-큐 벳 것 이다 분배 40 예 판.</li>
	<li>24 h 30 ° C에서 번호판을 품 어.</li>
	<li>예 + G418 도금 복제를 수행 하 고 3 일 동안 30 ° C에서 번호판을 품 어.</li>
</ol>8. 섬으로 불안정 돌연변이 및 판정에 대 한 검사의 선택
<ol><li>각 예 + G418 플레이트에 대 한 예-에이드 (Ade 낮은) PMG-에이드 (Ade 없음) 접시를 복제 도금을 수행 합니다. 예-에이드 접시에 식민지의 일부 빨간 채색 (그림 1G) 표시 될 때까지 30 ° C에서 1-2 일에 대 한 복제 판을 품 어.</li>
	<li>예-에이드와 PMG-에이드와 예 에이드 접시에 분홍색 또는 흰색을 표시 하 고 또한 PMG-에이드 접시에 성장 하는 선택 셀을 비교 합니다. 그들은 가양성 (예를 들어, 칸 카세트는 게놈에서 비 대상 사이트에 통합 되어 반영) PMG-에이드에 성장 없이 식민지를 선택 하지 마십시오.</li>
	<li>각 식민지에서 약 1 × 105 셀을 선택 하 고 포함 된 식민지 PCR (그림 1 H)에 대 한 시작 템플릿으로 수행 하기 위해이 솔루션의 적어도 30 분 사용 1 µ L 37 ° C에서 2.5 mg/mL zymolyase 100 T SPZ 솔루션의 10 µ L에서 품 어.<ol>
<li>2m sorbitol의 30 mL, 4.05 mL의 1 M 나2HPO4, 0.95 mL NaH2포4 증류수 (최종 pH 7.5) 15 mL를 혼합 하 여 SPZ (50 mL)을 확인 합니다. 샘플 (5 mL) zymolyase 보충 고 사용까지-20 ° C에서 500 µ L aliquots에 저장 될 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>젤 전기 이동 법 (1.2 %agarose 젤, 180V, 20 분)의 결과 + 식민지 PCR 시각화를 수행 합니다. 선택 적절 한 크기의 PCR 악대를 전시 하 고 Xho와 각 반응 제품의 5 µ L를 소화 하는 반응 (4 U 효소, 1 x 소화 버퍼, 37 ° C 물 목욕, 1 시간)을 화면으로 가양성 (그림 1 H).</li>
	<li>XhoI 소화 (1.2 %Agarose 젤, 180 V, 20 분)을 시각화 하기 위해 젤 전기 이동 법을 수행 합니다. 식민지 PCR 제품은 XhoI, 절단 및 예 + G418 번호판 (그림 1I) 패치를 표시 합니다.</li>
	<li>분열 효 모 세포에서 gDNA를 분리 하 고 PCR 제품23의 시퀀싱을 수행. 돌연변이 (그림 1I)를 식별 하는 야생-타입 시퀀스와 얻은 시퀀스를 비교 합니다.</li>
	<li>직접 다시 돌연변이 세포23에서 PCR에 의해 증폭 퓨전 구문으로 변환 하 여 야생-타입 셀에 mutation(s)를 소개 합니다. 새로 만든된 돌연변이 세포 (그림 1J)에 표현 형을 확인 하기 위해 안보를 사용 합니다.<ol>
<li>퓨전 변환 구문을 증폭 하실 수 있습니다 쉽게 PCR에 의해 뇌관 p1와 p10 50 µ L (~ 1 µ g DNA, 20 U 효소 반응 버퍼 x 1)의 총 볼륨에 템플릿으로 돌연변이의 게놈 DNA를 사용 하 고 표 2에에서 설명 된 반응 사이클을 적용 . 구성의 변화 단계 7.1-7.13에 따라 수행할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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저자는 공개 없다.

오류가 PCR 통해 임의의 mutagenesis 주어진된 지역에서 돌연변이의 다양 한 풀을 생성 하기 위한 강력한 도구입니다. 이 기술은 특정 상황에서 단백질의 기능을 평가 하는 연구에 대 한 특히 유용 합니다. 예, 우리는 여기는 19S 프로테아좀 소 단위, Rpt4, 섬으로 유지 보수에서의 기능을 평가 하기 위해 오류가 PCR을 사용. 변화 하 여 지역 오류가 PCR에 의해 표적으로 하 고 심사 조건 조정, 우리 관심 및 ?...

앞으로 유전학 연구원 추구 특정 표현 형을 표시 하는 자연적 사건 돌연변이 및 유전 분석을 수행 고전적인 방법입니다. 반전 유전학에서 관심사의 유전자에 돌연변이 소개 하 고 표현 형 검사. 후자의 경우 대상 유전자의 무작위 mutagenesis 이후에 온도 감도 등 원하는 고기에 대 한 선택 또는 효소 활동을 변경 하는 돌연변이의 풀을 생성 하 자주 사용 됩니다. 다양 한 방법은 오류가 PCR1;를 포함 하 여 임의의 mutagenesis 달성 하는 데 사용할 수 있습니다. UV 방사선 조사2. 화학 mutagens, 에틸 methanesulfonate (EMS) 등 질소 산3; - mutD5 4; 표현 등 임시 mutator 긴장의 사용 그리고 DNA5를 걸어 갔다입니다.
여기, 우리는 우리 분열 효 모에 대상 유전자 돌연변이 풀을 생성 하는 오류가 PCR을 이용 하는 반전 유전학 전략을 설명 합니다. 로 한의 이름에서이 메서드는 PCR 동안 일부러 오류를 도입 하 여 돌연변이 생성 합니다. 다른 mutagenesis 방법과 달리 오류가 PCR mutagenized 될 영역을 정의 하는 사용자 수 있습니다. 이것은 관심사의 단백질/도메인의 기능을 연구 하는 노력에 특히 유용 하다.
이 무작위 mutagenesis 절차를 보여, 우리 여기 사용 rpt4 +, 19S 프로테아좀 소 단위를 인코딩하는 예를 들어. Rpt4 분열 효 모6,7,,89, 다른 유기 체에 있는 베이스-독립적인 기능을가지고 표시 되었습니다 및 베이스 결함 단백질을 변경 하 여 간접 효과 일으킬 수 있습니다. 수준입니다. 우리는, 그러므로, 섬으로에 프로테아좀의 기능을 조사 하는 목적으로 베이스-독립적인 변화를 유발 하는 돌연변이 대 한 검사.
오류가 PCR 뇌관을 바인딩할 위치를 조정 하 여 어떤 유전자 영역에 적용할 수 있습니다. 적절 한 기자와 원하는 phenotypic 변화 하는 돌연변이 확인할 수 있습니다. 여기, 우리는 ade6 + 기자 삽입 활용는 centromere 1 외부 반복 (otr) 지역10. Ade6 + 기자 야생-타입 상태;에서 침묵은 그래서 제정 섬으로이 지역11에 형성 된다 이 빨간 식민지10으로 표시 됩니다. Centromere는에 제정 섬으로 destabilizes 하는 돌연변이 ade6 + 기자, 백색 식민지로 시각 이다는 식으로 이어질 것입니다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;1. Media&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-10KG</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>BD Biosciences</td><td>212720</td><td></td></tr><tr><td>L-Leucine</td><td>JUNSEI</td><td>87070-0310</td><td></td></tr><tr><td>Adenine sulfate</td><td>ACR</td><td>16363-0250</td><td></td></tr><tr><td>Uracil&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U0750</td><td></td></tr><tr><td>L-Histidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8125</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.05108.0050</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>JUNSEI</td><td>19015-0350</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;bull;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63140</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12095</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phthalate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6758-500g</td><td></td></tr><tr><td>Inositol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7508-50G</td><td></td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4501-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Boric Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768-1KG</td><td></td></tr><tr><td>MnSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7634-500G</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;bull;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>JUNSEI</td><td>83060-031</td><td></td></tr><tr><td>FeCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;bull;4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>KANTO</td><td>CB8943686</td><td></td></tr><tr><td>Sodium molybdate dihydrate</td><td>YAKURI</td><td>31621</td><td></td></tr><tr><td>KI</td><td>JUNSEI</td><td>80090-0301</td><td></td></tr><tr><td>CuSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;bull;5H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>YAKURI</td><td>09605</td><td></td></tr><tr><td>D-myo-inositol</td><td>MP biomedicals</td><td>102052</td><td></td></tr><tr><td>Pantothenate</td><td>YAKURI</td><td>26003</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4126-500G</td><td></td></tr><tr><td>(NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4418-100G</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Biobasic</td><td>D0012</td><td></td></tr><tr><td>G418, geneticin</td><td>LPS</td><td>G41805</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;2. Enzyme reactions&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase</td><td>Aglient</td><td>600380</td><td>For site-directed mutagenesis</td></tr><tr><td>GeneMorphII Random mutagenesis Kit</td><td>Aglient</td><td>200500</td><td>For error-prone PCR</td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td><td>Thermo Fisher</td><td>F-530L</td><td>For fusion PCR</td></tr><tr><td>Ex Taq&amp;nbsp;DNA Polymerase</td><td>Takara</td><td>RR001b</td><td>For general PCR</td></tr><tr><td>BamH1</td><td>New England BioLabs</td><td>R0136S</td><td></td></tr><tr><td>Xho1</td><td>New England BioLabs</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>Dpn1</td><td>New England BioLabs</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;3. Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Velveteen square, black</td><td>VWR</td><td>89033-116</td><td>For replica</td></tr><tr><td>Replica-plating tool</td><td>VWR</td><td>25395-380</td><td>For replica</td></tr><tr><td>MicroPulser Electroporator</td><td>Biorad</td><td>1652100&amp;nbsp;</td><td>For fission yeast transformation</td></tr><tr><td>Electroporation Cuvettes, 0.2 cm gap</td><td>Biorad</td><td>1652086&amp;nbsp;</td><td>For fission yeast transformation</td></tr><tr><td>Thermal Cycler</td><td>Bioer</td><td>BYQ6078</td><td>For fusion PCR ramp reaction&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

gene-targeted random mutagenesis to select heterochromatin-destabilizing proteasome mutants in fission yeast

대상 유전자의 무작위 mutagenesis 원하는 표현 형을 생성 하는 돌연변이 식별 하기 위해 일반적으로 사용 됩니다. 무작위 mutagenesis 달성 하는 데 사용할 수 있습니다 방법의 오류가 PCR는 돌연변이의 다양 한 풀을 생성 하기 위한 편리 하 고 효율적인 전략 이다 (즉., 돌연변이 도서관). 연구원은 다른 게놈 영역을 영향을 받지 떠나는 동안 유전자의 코딩 지구 같은 미리 정의 된 영역을 변형 하고자 하는 경우 오류가 PCR 방법의 선택입니다. 돌연변이 라이브러리 오류가 PCR에 의해 증폭 되어, 후 적당 한 플라스 미드로 복제 해야 합니다. 오류가 PCR에 의해 생성 된 라이브러리의 크기는 복제 단계의 효율에 의해 제한 됩니다. 그러나, 분열 효 모, Schizosaccharomyces pombe, 복제 단계는 매우 효율적인 원스텝 퓨전 변환에 대 한 구문을 생성 하는 PCR의 사용으로 대체할 수 있습니다. 원하는 고기의 돌연변이 다음 적절 한 기자를 사용 하 여 선택할 수 있습니다. 여기,이 전략 자세하게, 예를 들어, centromeric 섬으로에 삽입 기자 복용 설명 합니다.

그림 1 에 설명 된 절차에 따라 인수 Rpt4 돌연변이 식민지의 색상을 평가 하 여 분석할 수 있습니다. 식민지의 색상은 그림 2에 셀 수 감소에 관련 된 접시에 발견 했다. 섬으로 지역에 삽입 기자 ade6 + 야생-타입에 침묵 하 고 예 에이드 접시에 빨간 식민지를 보여줍니다. 일단는 섬으로 불안정 하 고 ade6 + 기자 표현, ...

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Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

분열 효 모 섬으로 불안정 프로테아좀 돌연변이 선택할 임의의 Mutagenesis 유전자 타겟팅

이 문서에는 분열 효 모에 대상 유전자의 무작위 mutagenesis에 대 한 자세한 방법을 설명합니다. 예를 들어, 우리가 대상 rpt4 +, 19S 프로테아좀 섬으로 불안정 돌연변이 대 한 스크린의 소 단위를 인코딩하는.

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

gene-targeted-random-mutagenesis-to-select-heterochromatin

Research

JoVE Journal

Genetics

10.6K 조회수.  Korea Advanced Institute of Science and Technology. 이 문서에는 분열 효 모에 대상 유전자의 무작위 mutagenesis에 대 한 자세한 방법을 설명합니다. 예를 들어, 우리가 대상 rpt4 +, 19S 프로테아좀 섬으로 불안정 돌연변이 대 한 스크린의 소 단위를 인코딩하는.

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Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Genetically-encoded histone-miniSOG induces genome-wide heritable mutations in a blue&#160;light-dependent manner. This mutagenesis method is simple, fast, free of toxic chemicals, and well-suited for forward genetic screening and transgene integration.

히스톤 - miniSOG에서 사용 Optogenetic 무작위 돌연변이 유발<em&gt; C. 엘레</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

연구

유전학

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting mutant alleles reside at their endogenous genomic sites and no exogenous DNA sequences are left in the genome following the procedure. Since in haploid yeast cells each of the four core histone proteins is encoded by two non-allelic genes with highly homologous open reading frames (ORFs), targeting mutagenesis specifically to one of two genes encoding a particular histone protein can be problematic. The strategy we describe here bypasses this problem by utilizing sequences outside, rather than within, the ORF of the target genes for the homologous recombination step. Another feature of this system is that the regions of DNA driving the homologous recombination steps can be made to be very extensive, thus increasing the likelihood of successful integration events. These features make this strategy particularly well-suited for histone gene mutagenesis, but can also be adapted for mutagenesis of other genes in the yeast genome.

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

A strategy for generating mutations in histone genes at their endogenous location in Saccharomyces cerevisiae is presented.

대상<em&gt; 현장에서</em신진 효모에서&gt; 돌연변이 유발 히스톤의 유전자

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool commonly used in yeast studies. The expression of a number of neurodegenerative disease-associated proteins in yeast causes cytotoxicity and aggregate formation, recapitulating findings seen in patients with these disorders. Here, we describe a method for screening a yeast model of the Amyotrophic Lateral Sclerosis-associated protein FUS for modifiers of its toxicity. Instead of using transformation, this new screening platform relies on the mating of yeast to introduce an arrayed library of plasmids into the yeast model. The mating method has two clear advantages: first, it is highly efficient; second, the pre-transformed arrayed library of plasmids can be stored for long-term as a glycerol stock, and quickly applied to other screens without the labor-intensive step of transformation into the yeast model each time. We demonstrate how this method can successfully be used to screen for genes that modify the toxicity of FUS.

This article presents a mating-based method to facilitate overexpression screening in budding yeast using an arrayed plasmid library.

효 모에 짝짓기 기반 Overexpression 라이브러리 심사

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely related biochemical pathways. Previous methods such as the Synthetic Genetic Array (SGA) analysis, and random mutagenesis techniques using ultraviolet (UV) or chemicals like ethyl methanesulfonate (EMS) or N-ethyl-N- nitrosourea (ENU), have been widely used but are often costly and laborious. Also, these mutagen-based screening methods are frequently associated with severe side effects on the organism, inducing multiple mutations that add to the complexity of isolating the suppressors. Here, we present a simple and effective protocol to identify suppressor mutations in mutants which confer a growth defect in Schizosaccharomyces pombe. The fitness of cells with a growth deficiency in standard rich liquid media or synthetic liquid media can be monitored for recovery using an automated 96-well plate reader over an extended period. Once a cell acquires a suppressor mutation in the culture, its descendants outcompete those of the parental cells. The recovered cells that have a competitive growth advantage over the parental cells can then be isolated and backcrossed with the parental cells. The suppressor mutations are then identified using whole-genome sequencing. Using this approach, we have successfully isolated multiple suppressors that alleviate the severe growth defects caused by loss of Elf1, an AAA+ family ATPase that is important in nuclear mRNA transport and maintenance of genomic stability. There are currently over 400 genes in S. pombe with mutants conferring a growth defect. As many of these genes are uncharacterized, we propose that our method will hasten the identification of novel functional interactions with this user-friendly, high-throughput approach.

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

We present a simple suppressor screen protocol in fission yeast. This method is efficient, mutagen-free, and&#160; selective&#160; for&#160; mutations that&#160; often&#160; occur at&#160; &#160;a&#160; single&#160; genomic&#160; locus.&#160; The protocol is suitable for isolating suppressors that alleviate growth defects in liquid culture that are caused by a mutation or a drug.

분열 효 모 Schizosaccharomyces pombe 에 깊은 시퀀싱 지원, 자발적인 억압 화면

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely ...

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers. Genetic studies in mammalian systems have been limited due to the lack of readily available tools including defined mutant genetic cell lines, regulatory expression systems, and appropriate selectable markers. To circumvent these difficulties, model genetic systems in lower eukaryotes have become an attractive choice for the study of functionally conserved DNA repair proteins and pathways. We have developed a model yeast system to study the poorly defined genetic functions of the Werner syndrome helicase-nuclease (WRN) in nucleic acid metabolism. Cellular phenotypes associated with defined genetic mutant backgrounds can be investigated to clarify the cellular and molecular functions of WRN through its catalytic activities and protein interactions. The human WRN gene and associated variants, cloned into DNA plasmids for expression in yeast, can be placed under the control of a regulatory plasmid element. The expression construct can then be transformed into the appropriate yeast mutant background, and genetic function assayed by a variety of methodologies. Using this approach, we determined that WRN, like its related RecQ family members BLM and Sgs1, operates in a Top3-dependent pathway that is likely to be important for genomic stability. This is described in our recent publication [1] at <a href="http://www.impactaging.com">www.impactaging.com</a>. Detailed methods of specific assays for genetic complementation studies in yeast are provided in this paper.

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System

Genetic studies in yeast can be employed to investigate the molecular and cellular functions of human genes in cellular DNA metabolism. Methods are described for the genetic characterization of the human WRN gene product defective in the premature aging disorder Werner syndrome in functionally conserved pathways using yeast as a tractable model system.

인간의 DNA 수리 단백질의 유전자 연구는 모델 시스템으로 효모를 사용하여

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

생물학

Isolating Potentiated Hsp104 Variants Using Yeast Proteinopathy Models

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic lateral sclerosis, and &#945;-synuclein, implicated in Parkinson&#8217;s disease, are toxic and form cytoplasmic aggregates in yeast. These features recapitulate protein pathologies observed in patients with these disorders. Thus, yeast are an ideal platform for isolating toxicity suppressors from libraries of protein variants. We are interested in applying protein disaggregases to eliminate misfolded toxic protein conformers. Specifically, we are engineering Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast that is uniquely capable of solubilizing both disordered aggregates and amyloid and returning the proteins to their native conformations. While Hsp104 is highly conserved in eukaryotes and eubacteria, it has no known metazoan homologue. Hsp104 has only limited ability to eliminate disordered aggregates and amyloid fibers implicated in human disease. Thus, we aim to engineer Hsp104 variants to reverse the protein misfolding implicated in neurodegenerative disorders. We have developed methods to screen large libraries of Hsp104 variants for suppression of proteotoxicity in yeast. As yeast are prone to spontaneous nonspecific suppression of toxicity, a two-step screening process has been developed to eliminate false positives. Using these methods, we have identified a series of potentiated Hsp104 variants that potently suppress the toxicity and aggregation of TDP-43, FUS, and &#945;-synuclein. Here, we describe this optimized protocol, which could be adapted to screen libraries constructed using any protein backbone for suppression of toxicity of any protein that is toxic in yeast.

Yeast proteinopathy models are valuable tools to assess the toxicity and aggregation of proteins implicated in disease. Here, we present methods for screening Hsp104 variant libraries for toxicity suppressors. This protocol could be adapted to screen any protein library for toxicity suppressors of any protein that is toxic in yeast.

효력을 더 Hsp104 변종 사용 효모 Proteinopathy 모델을 분리

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

화학 유전자 상호 작용의 신속한 식별<em&gt; 사카로 미세스 세 레비 시아</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic requirements for eukaryotic protein degradation was initially established in Saccharomyces cerevisiae. Classical analyses of protein degradation have relied on biochemical pulse-chase and cycloheximide-chase methodologies. While these techniques provide sensitive means for observing protein degradation, they are laborious, time-consuming, and low-throughput. These approaches are not amenable to rapid or large-scale screening for mutations that prevent protein degradation. Here, a yeast growth-based assay for the facile identification of genetic requirements for protein degradation is described. In this assay, a reporter enzyme required for growth under specific selective conditions is fused to an unstable protein. Cells lacking the endogenous reporter enzyme but expressing the fusion protein can grow under selective conditions only when the fusion protein is stabilized (i.e. when protein degradation is compromised). In the growth assay described here, serial dilutions of wild-type and mutant yeast cells harboring a plasmid encoding a fusion protein are spotted onto selective and non-selective medium. Growth under selective conditions is consistent with degradation impairment by a given mutation. Increased protein abundance should be biochemically confirmed. A method for the rapid extraction of yeast proteins in a form suitable for electrophoresis and western blotting is also demonstrated. A growth-based readout for protein stability, combined with a simple protocol for protein extraction for biochemical analysis, facilitates rapid identification of genetic requirements for protein degradation. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of short-lived proteins. In the example presented, the His3 enzyme, which is required for histidine biosynthesis, was fused to Deg1-Sec62. Deg1-Sec62 is targeted for degradation after it aberrantly engages the endoplasmic reticulum translocon. Cells harboring Deg1-Sec62-His3 were able to grow under selective conditions when the protein was stabilized.

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

성장 기반의 결정 및 단백질 분해에 대한 유전 요구 사항의 생화학 적 확인에<em&gt; 사카로 미세스 세 레비 시아</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that involves the construction, cloning and expression of mutant libraries, coupled to high frequency homologous DNA recombination in vivo. Here, we present a protocol to create and screen mutant libraries in yeast based on the example of a fungal aryl-alcohol oxidase (AAO) to enhance its total activity. Two protein segments were subjected to focused-directed evolution by random mutagenesis and in vivo DNA recombination. Overhangs of ~50 bp flanking each segment allowed the correct reassembly of the AAO-fusion gene in a linearized vector giving rise to a full autonomously replicating plasmid. Mutant libraries enriched with functional AAO variants were screened in S. cerevisiae supernatants with a sensitive high-throughput assay based on the Fenton reaction. The general process of library construction in S. cerevisiae described here can be readily applied to evolve many other eukaryotic genes, avoiding extra PCR reactions, in vitro DNA recombination and ligation steps.

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

진화 방법에 감독<em&gt; 사카로 마이 세스 세레 비지에</em&gt; : 돌연변이 라이브러리 생성 및 검사

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...

A Protocol for Functional Assessment of Whole-Protein Saturation Mutagenesis Libraries Utilizing High-Throughput Sequencing

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel sequencing technology have opened up the possibility of assessing the functional or fitness effects of large numbers of mutations simultaneously. Here, we present a protocol for experimentally determining the effects of all possible single amino acid mutations in a protein of interest utilizing high-throughput sequencing technology, using the 263 amino acid antibiotic resistance enzyme TEM-1 &#946;-lactamase as an example. In this approach, a whole-protein saturation mutagenesis library is constructed by site-directed mutagenic PCR, randomizing each position individually to all possible amino acids. The library is then transformed into bacteria, and selected for the ability to confer resistance to &#946;-lactam antibiotics. The fitness effect of each mutation is then determined by deep sequencing of the library before and after selection. Importantly, this protocol introduces methods which maximize sequencing read depth and permit the simultaneous selection of the entire mutation library, by mixing adjacent positions into groups of length accommodated by high-throughput sequencing read length and utilizing orthogonal primers to barcode each group. Representative results using this protocol are provided by assessing the fitness effects of all single amino acid mutations in TEM-1 at a clinically relevant dosage of ampicillin. The method should be easily extendable to other proteins for which a high-throughput selection assay is in place.

We present a protocol for the functional assessment of comprehensive single-site saturation mutagenesis libraries of proteins utilizing high-throughput sequencing. Importantly, this approach uses orthogonal primer pairs to multiplex library construction and sequencing. Representative results using TEM-1 &#946;-lactamase selected at a clinically relevant dosage of ampicillin are provided.

높은 처리량 시퀀싱을 활용하여 전체 - 단백질 포화 돌연변이 유발 도서관의 기능 평가를위한 프로토콜

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel ...

분열 효 모 섬으로 불안정 프로테아좀 돌연변이 선택할 임의의 Mutagenesis 유전자 타겟팅

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히스톤 - miniSOG에서 사용 Optogenetic 무작위 돌연변이 유발

대상

효 모에 짝짓기 기반 Overexpression 라이브러리 심사

분열 효 모 Schizosaccharomyces pombe 에 깊은 시퀀싱 지원, 자발적인 억압 화면

인간의 DNA 수리 단백질의 유전자 연구는 모델 시스템으로 효모를 사용하여

효력을 더 Hsp104 변종 사용 효모 Proteinopathy 모델을 분리

화학 유전자 상호 작용의 신속한 식별

성장 기반의 결정 및 단백질 분해에 대한 유전 요구 사항의 생화학 적 확인에

진화 방법에 감독

높은 처리량 시퀀싱을 활용하여 전체 - 단백질 포화 돌연변이 유발 도서관의 기능 평가를위한 프로토콜