このプロジェクトの支援の資金調達は、基本的な科学研究開発プログラムを通じて、国立研究財団の韓国 (NRF) 科学省と ICT (2016R1A2B2006354) によって資金を供給によって提供されました。

1. 媒体の作製
<ol><li>準備酵母エキス サプリメント (はい)、はいアデニン (はい低 Ade)、酵母のグルタミン酸媒体 (PMG12) および PMG なしアデニン (PMG Ade) なしの表 1に示すようにコンポーネントを混合することによって。はいエイド (低 Ade) と PMG Ade プレートがすべての同じコンポーネント、アデニンを後者から省略すると。<ol>
<li>次の塩 (50 x) ストックを使用: 52.5 g/L MgCl2·6H2O、2 グラム/L の CaCl2·2H2O、50 g/L 塩化カリウム、2 グラム/L の Na24蒸留水です。フィルター孔径 0.22 μ m フィルターを使用して殺菌して 4 ° C で保存</li>
		<li>次のビタミンを使用して (1、000 x) 在庫: 1 g/L パントテン酸 10 g/L ニコチン酸、イノシトール 10 g/L、蒸留水で 10 mg/L ビオチン。フィルター孔径 0.22 μ m フィルターを使用して殺菌して 4 ° C で保存</li>
		<li>次の鉱物を使用 (10, 000 x) 在庫: ホウ酸 5 g/L、4 g/L MnSO4、4 g/L ZnSO4·7H2O, 2 g/L した FeCl2·4H2O, 0.4 g/L MoO3, 1 g/L KI、0.4 g/L CuSO4·5H2O、蒸留水の 10 g/L のクエン酸。フィルター孔径 0.22 μ m フィルターを使用して殺菌して 4 ° C で保存 注: はい液体培地を寒天を省略することで可能です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>オートクレーブ中 200 rpm の速度での攪拌棒で攪拌しながら 60 ° C 以下に冷却します。</li>
	<li>はい + G418 (ジェネティシン) プレートはい中 1 mL/L G418 原液を追加します。<ol>
<li>次の G418 を使用 (1、000 x) 在庫: 100 mg/mL G418 蒸留水で。フィルター滅菌-20 ° C で 0.22 μ m の細孔径のフィルター、およびストアの 1.5 mL 遠心チューブに分注を使用して</li>
	</ol>
</li>
	<li>90 mm シャーレ (約 40 シャーレ中の因数の 1 L に別の 5-10 分、因数のメディアをかき混ぜる.4 ° C でプレートを保存します。</li>
</ol>2. クローンのrpt4 +とその 5/3' UTRs
<ol><li>プライマー p1 と p2 で PCR を行う (図 1 a) (〜 1 μ g DNA、20 U 酵素反応バッファー x 1)、50 μ L の総ボリュームでテンプレートとしてゲノム DNA (gDNA) を酵母分裂を使用して、3,315 ベースを増幅して表 2に示す反応サイクルを適用します。ペア (bp) のフラグメントは、 rpt4 +とその 5/3' UTRs で構成されます。PCR の製品の浄化キット13を使用して (図 1 a) の製造元の指示に従ってを浄化します。</li>
	<li>PBlueScript KS(-) ベクトル14と 16-18 の水浴の 37 ° C でrpt4 +とその 5/3' BamH1とXho1 UTRs 20 μ L (〜 1 μ g の DNA、20 U 酵素、1 x 消化バッファー) の総量を含む増幅された DNA 断片をダイジェストします。h (図 1 b)。</li>
	<li>ゲル浄化消化ベクトル (1.2% の agarose のゲル)、DNA を挿入 TAE を用いたアガロース電気泳動 (100 V、1 h) を実行する、任意の大きさの DNA バンドを切除し、ゲル抽出キット15で DNA を分離することです。</li>
	<li>ベクトルとベクトル DNA の 50-100 ng を含む 20 μ L の ligation の反作用を実行することによって T4 DNA リガーゼを使って DNA 挿入を縛る、~ 3 倍モル過剰挿入 DNA、400 U T4 DNA リガーゼと結紮バッファー × 1。16-18 h の 18 ° C でこの混合物を孵化させなさい。</li>
	<li>70 の熱ショックを適用することによって大腸菌DH5α の 100 μ L に結紮の DNA を変換 42 ° C で sポンドの 1 つの mL を追加し、回復の 37 ° C で 1 時間インキュベートします。遠心分離 (13,800 x g) を実行、変換されたエシェリヒア属大腸菌のすべてが LB アンピシリン (ラ) プレート細胞培養上清、, 16 h の 37 ° C で板を破棄します。</li>
	<li>つまようじで 4-8 コロニーをピックアップし、37 ° c 3 mL ラ中で一晩成長します。</li>
	<li>製造元のプロトコルに従って使用されるプラスミド精製キット16で、プラスミドを分離し、孤立したプラスミド (BamH1と各制限酵素の 5 U の 5 μ L で分析の制限の酵素の消化力を実行Xho1) と制限バッファー × 1。3 h 候補プラスミドを配列することによってクローニング確認の水浴の 37 ° C で反応混合物を孵化させなさい。</li>
</ol>3. サイレント突然変異 (Xho1制限サイト) の導入
<ol><li>それ以外の場合補足シーケンスの望ましい突然変異を含む 33 bp プライマー (p3 および p4) のペアを設計します。</li>
	<li>25 μ L の総ボリューム内の忠実度の高いポリメラーゼ17 (図 1) と PCR を行う (10 複製プラスミド、10 pmol プライマー ミックス、2 U 酵素反応バッファーの 1 つの x の 2 μ L の ng) サイクリングのパラメーターを使用して表 3に記載されています。</li>
	<li>Dpnを 1 時間水に 37 ° C で 20 μ L (20 U 酵素, 1 x 消化バッファー) の容量でお風呂が付いているテンプレート プラスミッドを消化します。</li>
	<li>変換、伝達、分離、および 2.5 2.7 の手順に記載されている、サイレント突然変異を含んでいるプラスミッドをシーケンスします。 注:18の単一の反作用の複数の DNA のフラグメントの結合に関することができますクローンの作成方法を使用しても、サイレント突然変異を導入できます。</li>
</ol>4 rpt4 +エラーを起こしやすい PCR によるランダム変異導入
<ol><li>テンプレート、プライマー p5、p6、50 μ L (4.1.1 10 pmol プライマー ミックス、2.5 U 酵素、1 x 反作用バッファーの 2 μ L のステップで定義したテンプレートの量) の総量と、プラスミドを用いたサイレント突然変異 (Xho1サイト)、エラーを起こしやすい PCR を実行します。、高いエラーを生成するために設計されている特別なポリメラーゼ率19 (図 1)。表 2に説明されているように、PCR を実行します。<ol>
<li>4-5 μ g のプラスミド テンプレートを使用して、1 bp/kb (プラスミド) に突然変異の頻度を制御します。 注:高濃度 (> 500 ng/μ L) プラスミド ミニ準備キット20を使用して入手することが、必要です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ゲル電気泳動を使用して 2670 bp (1.2% の agarose のゲル) の PCR の製品を確認します。ゲルは、2.5 の手順で説明されているようにこの PCR の製品を浄化します。</li>
</ol>5. フュージョン PCR のフラグメント (菅、3' UTR) の準備
<ol><li>テンプレート、プライマー p7 と p8, pFA6a KANMX621を使用して PCR を行い、マーカー (菅) フラグメントを取得する表 4 に記載されている条件。ゲルは、2.5 (図 1E) の手順で説明するように結果 1,480 bp のフラグメントを浄化します。<ol>
<li>突然変異とその隣接遺伝子のコーディングの地域を対象とする遺伝子の終止コドンが 500 以上で区切られたかどうかチェックしてください bp。この地域が 500 未満の場合は、内因性のターミネータを使用できません bp;むしろ、内因性のターミネーターではなくADHターミネータを使用ください。ADHの終端文字を使用するために必要なプロトコルの変更は、表 5に掲載されています。 注:これらの変更は、内因性のターミネーターではなく pFA6a 3HA KANMX6 プラスミドであり、 ADHの終端記号を使用する場合にのみ適用されます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>クローンとrpt4 +PCR を実行-テンプレートとプライマー p9、p10 の総量が 50 μ L のベクターを含む (20 クローンのプラスミド、10 pmol プライマー ミックス、2 U 酵素反応バッファーの 1 つの x の 2 μ L の ng)、表 6に提示条件を使用して。ゲルは、得られた 506 bp 3' UTR フラグメント (図 1E) を浄化します。</li>
</ol>6. 融合 PCR (図 1E) による変換のコンス トラクターの生成
<ol><li>50 ng/μ L で 3 フラグメント (人為rpt4 +菅、および 3' UTR) を準備します。</li>
	<li>表 7 に記載されている 3 つの PCR プライマー p11 と p12 を使用して片融合を実行します。(フュージョン PCR のためのプロトコルは元プロトコル22の変更) です。主要な 4,398 bp の PCR の製品を浄化します。<ol>
<li>Rpt4 +を使用: KAN:3'UTR の 1 の割合で断片: 3:1 最適な結果を得るのため。 注:挿入 DNA の総量が 500 を超えない ng。Rpt4 +の推奨量: KAN:3'UTR は 50 ng:150 ng:50 ng。人為の領域は、他の 3 つに変異が各拠点のすべての可能な組み合わせを占めるイースト コロニーの最小数は 1,600 x 3 = 4,800 約 1.6 kb の植民地。変換反応の 1 つは通常 400-500 コロニーを生成、ため融合 PCR を構築の価値が少なくとも 10 の反応が必要です。10 の要因によって単に反応量 (すなわち、 PCR チューブの数) を増やすことによってこの必要性を満たすことが。</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. 電気穿孔法 (図 1 f) による分裂酵母の変換
<ol><li>16 時間以上インキュベートし飽和する [はい] 媒体の 10 mL には、酵母を接種します。</li>
	<li>600 の光学濃度に細胞を希釈はい中の 0.2 で 200 mL の nm (外径600), 外径600 5-6 時間振とうしながら 30 ° C で、= 0.6 - 0.8。</li>
	<li>外径600細胞を集中 = 30、4 つの 50 mL の円錐管に省略し、10 分間氷で冷やします。</li>
	<li>4 ° C で 3 分間 1,050 × g で遠心分離を行い、細胞を収穫します。チューブと 10 電気キュベットを氷の上に配置します。氷上 7.3 7.8 の手順に従います。</li>
	<li>上澄みを廃棄し、1.2 M ソルビトールの 15 mL を加えます。細胞を再懸濁しますチューブを軽く振る。</li>
	<li>4 ° C で 3 分間 1050 x g で細胞を遠心分離します。</li>
	<li>7.4 と 7.5 の手順を繰り返します。上清を捨てます。各管に 1.2 M ソルビトールの 500 μ L を追加、細胞を再懸濁します、1 つ 15 ml の円錐管の細胞のすべてを収集します。</li>
	<li>1.2 M ソルビトールを追加 2.4 mL (外径600 = 0.2 mL あたり 10)。氷の上の管を保ちます。</li>
	<li>(彼らは十分に中断された確認) ソルビトール中断セルを 200 μ l 添加フュージョン PCR を含む EP 管の構築、ミックスも、および電気キュベットにサンプルを転送します。</li>
	<li>Electroporate 次のオプションを持つセル: 菌類、ShS (2.00kV、1 パルス)。</li>
	<li>800 μ L の総ボリュームの場合は、各電気キュベットに 1.2 M ソルビトール 600 μ L を追加し、広がる 4 つはいプレート (200 μ L/プレート) のセル。10 電気キュベットをはいプレート 40 に分配されます。</li>
	<li>30 ° C 24 時間で版を孵化させなさい。</li>
	<li>はい + G418 レプリカ メッキを行い、3 日間の 30 ° C でプレートを孵化させなさい。</li>
</ol>8. 各種ヘテロクロマチン不安定変異体や偽陽性を確認
<ol><li>各はい + G418 プレート レプリカ メッキはいエイド (低 Ade) と PMG エイド (いいえ Ade) プレートを実行します。はい Ade プレート上の植民地のいくつかは赤い着色 (図 1) を示すまで 30 の ° C で 1-2 日のレプリカ版を孵化させなさい。</li>
	<li>比較はい Ade と PMG Ade のプレート地図はい Ade プレートにピンクや白、PMG Ade プレートでも育つセルを選択します。彼らは偽陽性 (例えば、菅カセットがゲノムの他の非ターゲット ・ サイトで統合されていることを反映して)、PMG エイドに成長せずコロニーを選択しないでください。</li>
	<li>各植民地から約 1 x 10 の5セルを選ぶし、SPZ 溶液 2.5 mg/mL ザイモリエイス 100 T コロニー PCR (図 1 H) の開始テンプレートとしてを実行するこのソリューションの少なくとも 30 分使用 1 μ L の 37 ° C で 10 μ L で孵化させなさい。<ol>
<li>15 mL の蒸留水 (最終 pH 7.5) 0.95 mL NaH2PO4 1 M Na2HPO44.05 mL 2 M ソルビトール 30 mL を混合することによって SPZ (50 mL) を作る。サンプル (5 mL) をザイモリエイスを補充し、使用するまで 500 μ 因数-20 ° C で保存できます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ゲル電気泳動 (1.2% の agarose のゲル、180 v、20 分) の結果 + コロニー PCR を視覚化するを実行します。適切なサイズの PCR バンドを展示、 Xhoと各反応生成物の 5 μ L を消化反応を選択 (4 U 酵素、1 x 消化バッファー、37 ° C の水浴、1 h) 偽陽性 (図 1 H) を選別する私。</li>
	<li>XhoIダイジェスト (1.2% の Agarose のゲル、180 V、20 分) を視覚化するゲルの電気泳動を行います。コロニー PCR 製品XhoI、によってカットされ、はい + G418 プレート (図 1I) それらをパッチをマークします。</li>
	<li>分裂酵母細胞から gDNA を分離し、PCR の製品23のシーケンスを実行します。(図 1I) の突然変異を識別するために野生型シーケンスで得られたシーケンスを比較します。</li>
	<li>直接融合構造変異細胞23から PCR によって増幅にそれらを変換することによって野生型細胞に遺伝を再導入します。スポッティング スコープを使用すると、新しく作られた突然変異体の細胞 (図 1 j) の表現型を確認できます。<ol>
<li>プライマー p1 と p10 簡単に融合変換コンス トラクター PCR によって増幅することができます (〜 1 μ g DNA、20 U 酵素反応バッファー x 1)、50 μ L の総ボリュームでテンプレートとして変異体のゲノム DNA を使用し、表 2 に記載されている反応サイクルを適用.コンス トラクターの変換は、7.1 7.13 の手順で行うことができます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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エラーを起こしやすい PCR によってランダムな突然変異は、特定の地域の突然変異体の多様なプールを生成するための強力なツールです。この手法は、特定の状況下でのタンパク質の機能を査定しようとする研究の場合に特に便利です。たとえば、我々 はここヘテロクロマチン メンテナンスで、Rpt4、19 秒プロテアソーム サブユニットの機能を評価するためにエラーを起こしやすい PCR を使?...

順遺伝学は、研究者が特定の表現型を表示する自然発生する突然変異体を求めるし、遺伝学的解析を行う古典的な方法です。逆遺伝学の興味の遺伝子に突然変異を導入し、表現型を検討します。後者の場合、ターゲット遺伝子のランダムな変異は突然変異体感温性などの所望の表現型を選択、その後または酵素活性の変更のプールを生成するよく使用されます。エラーを起こしやすい PCR1を含むランダムな突然変異の誘発を達成するために様々 な方法を使用する場合があります。UV 照射2;亜硝酸3; メタンスルホン酸エチル (EMS) などの化学変異原物質mutD5 4の発現などの一時的なミューテーター系統の使用DNA シャフリング5。
ここでは、分裂酵母のターゲット遺伝子の突然変異体のプールを生成するエラーを起こしやすい PCR を利用逆遺伝学的方法をについて説明します。1 つは、その名前から推測かもしれない、この方法意図的に PCR の間にエラーが発生して突然変異を生成します。他の突然変異誘発の方法とは異なりエラーを起こしやすい PCR はある突然変異誘発する領域を定義するユーザーをことができます。これにより、目的のタンパク質/ドメインの機能を勉強する努力に特に役立ちます。
このランダム変異導入手順を示すためには、我々 ここrpt4 +を使用分 19 秒プロテアソームのサブユニットをエンコードし、例として。Rpt4 分裂酵母6,7,8,9, 以外の生物のタンパク質分解に依存しない機能を持っている示されている、タンパク質分解の欠陥の原因タンパク質を変えることによって間接効果レベル。我々 は、したがって、ヘテロクロマチンのプロテアソームの機能の調査の目標の分解に依存しない変更を引き起こした突然変異体のスクリーニングします。
エラーを起こしやすい PCR プライマーのバインド場所をチューニングすることによって遺伝子領域に適用できます。目的の表現型変更を示す変異体は、適切な記者と識別できます。ここでは、我々 は挿入、 ade6 +記者を利用、セントロメア 1 外側を繰り返す (otr) 地域10。11この地域では、構成のヘテロクロマチンを形成すると、野生型条件でade6 +記者を黙らせたのでこれは、赤色のコロニー10で示されます。動原体で構成のヘテロクロマチンを不安定化突然変異は、白人の植民地として可視化ade6 +記者、発現に します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="825">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">1. Media</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:285px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Glucose</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8270-10KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:155px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">212720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">L-Leucine</td>
			<td style="width:155px;">JUNSEI</td>
			<td style="width:119px;">87070-0310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Adenine sulfate</td>
			<td style="width:155px;">ACR</td>
			<td style="width:119px;">16363-0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Uracil&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">U0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">L-Histidine</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H8125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">1.05108.0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">NaCl</td>
			<td style="width:155px;">JUNSEI</td>
			<td style="width:119px;">19015-0350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:267px;">MgSO4&#8226;7H2O</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">63140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:267px;">CaCl2</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">12095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Potassium phthalate</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P6758-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Inositol</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I7508-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Biotin</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B4501-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Boric Acid</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B6768-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">MnSO4</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M7634-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:267px;">ZnSO4&#8226;7H2O&#160;</td>
			<td style="width:155px;">JUNSEI</td>
			<td style="width:119px;">83060-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:267px;">FeCl2&#8226;4H2O</td>
			<td style="width:155px;">KANTO</td>
			<td style="width:119px;">CB8943686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Sodium molybdate dihydrate</td>
			<td style="width:155px;">YAKURI</td>
			<td style="width:119px;">31621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">KI</td>
			<td style="width:155px;">JUNSEI</td>
			<td style="width:119px;">80090-0301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:267px;">CuSO4&#8226;5H2O</td>
			<td style="width:155px;">YAKURI</td>
			<td style="width:119px;">09605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">D-myo-inositol</td>
			<td style="width:155px;">MP biomedicals</td>
			<td style="width:119px;">102052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Pantothenate</td>
			<td style="width:155px;">YAKURI</td>
			<td style="width:119px;">26003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Nicotinic Acid</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">N4126-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:267px;">(NH4)2SO4&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A4418-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Agarose</td>
			<td style="width:155px;">Biobasic</td>
			<td>D0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">G418, geneticin</td>
			<td style="width:155px;">LPS</td>
			<td style="width:119px;">G41805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">2. Enzyme reactions</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase</td>
			<td style="width:155px;">Aglient</td>
			<td style="width:119px;">600380</td>
			<td>For site-directed mutagenesis</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">GeneMorphII Random mutagenesis Kit</td>
			<td style="width:155px;">Aglient</td>
			<td style="width:119px;">200500</td>
			<td>For error-prone PCR</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td style="width:155px;">Thermo Fisher</td>
			<td>F-530L</td>
			<td>For fusion PCR</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Ex Taq&#160;DNA Polymerase</td>
			<td style="width:155px;">Takara</td>
			<td style="width:119px;">RR001b</td>
			<td>For general PCR</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">BamH1</td>
			<td style="width:155px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">R0136S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">Xho1</td>
			<td style="width:155px;">New England BioLabs</td>
			<td>R0146S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">Dpn1</td>
			<td style="width:155px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">R0176S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">3. Equipment</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Velveteen square, black</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">89033-116</td>
			<td>For replica</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Replica-plating tool</td>
			<td style="width:155px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">25395-380</td>
			<td>For replica</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">MicroPulser Electroporator</td>
			<td style="width:155px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">1652100&#160;</td>
			<td>For fission yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:267px;">Electroporation Cuvettes, 0.2 cm gap</td>
			<td style="width:155px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">1652086&#160;</td>
			<td>For fission yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:267px;">Thermal Cycler</td>
			<td style="width:155px;">Bioer</td>
			<td style="width:119px;">BYQ6078</td>
			<td>For fusion PCR ramp reaction&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gene-targeted random mutagenesis to select heterochromatin-destabilizing proteasome mutants in fission yeast

ターゲット遺伝子のランダムな変異は、所望の表現型をもたらす突然変異を識別するために使用されます。ランダム変異導入を達成するために使用できるメソッドのエラーを起こしやすい PCR は突然変異体の多様なプールを生成するための便利で効率的な戦略 (すなわち。、変異ライブラリー)。エラーを起こしやすい PCR は、影響を受けない他のゲノム領域を残しながら遺伝子のコーディングの地域などの定義済みの領域の変異するように努める研究者選択の方法です。変異ライブラリーは、エラーを起こしやすい PCR によって増幅は後、に適切なプラスミド複製する必要があります。エラーを起こしやすい PCR によって生成されたライブラリのサイズは、クローン作成のステップの効率によって制限されます。ただし、分裂酵母、分裂酵母、クローン作成のステップは非常に効率的なワンステップ融合変換の構成要素を生成する PCR を使用して置き換えることができます。所望の表現型の変異体は、適切な記者を使用して選択できます。ここでは、我々 例、動原体ヘテロクロマチンに挿入されるレポーターとしてこの戦略を詳細をについて説明します。

以下の図 1に示した手順で取得した Rpt4 変異体は、コロニーの色を評価することによって分析できます。コロニーの色が図 2の細胞数の減少に関連するプレートに斑点を付けます。異質染色質領域に挿入ade6 +記者は、野生型の沈黙し、はい Ade プレートで赤色のコロニーを示しています。Ade6 +記者の表現をヘテ?...

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Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

分裂酵母におけるプロテアソーム変異体のヘテロクロマチン不安定を選択するランダムな変異を遺伝子をターゲットとしました。

この資料では、分裂酵母のターゲット遺伝子のランダム突然変異誘発のための詳細な方法論について説明します。たとえば、ターゲットrpt4 +、19 s プロテアソームと不安定にする異質染色質の変異のためのスクリーンの亜単位を符号化します。

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

gene-targeted-random-mutagenesis-to-select-heterochromatin

Research

JoVE Journal

Genetics

10.6K ビュー.  Korea Advanced Institute of Science and Technology. この資料では、分裂酵母のターゲット遺伝子のランダム突然変異誘発のための詳細な方法論について説明します。たとえば、ターゲットrpt4 +、19 s プロテアソームと不安定にする異質染色質の変異のためのスクリーンの亜単位を符号化します。

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Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Genetically-encoded histone-miniSOG induces genome-wide heritable mutations in a blue&#160;light-dependent manner. This mutagenesis method is simple, fast, free of toxic chemicals, and well-suited for forward genetic screening and transgene integration.

でヒストンminiSOGを使用した光遺伝学ランダム突然変異誘発<em&gt; C。エレガンス</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

遺伝学

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the conventional approaches of permanent gene deletion cannot be applied to essential genes. We have pioneered a unique collection of ~70 temperature-sensitive (ts) lethal mutants for studying cell cycle regulation in the unicellular green algae Chlamydomonas reinhardtii1. These mutations identify essential genes, and the ts alleles can be conditionally inactivated by temperature shift, providing valuable tools to identify and analyze essential functions. Mutant collections are much more valuable if they are close to comprehensive, since scattershot collections can miss important components. However, this requires the efficient collection of a large number of mutants, especially in a wide-target screen. Here, we describe a robotics-based pipeline for generating ts lethal mutants and analyzing their phenotype in Chlamydomonas. This technique can be applied to any microorganism that grows on agar. We have collected over 3000 ts mutants, probably including mutations in most or all cell-essential pathways, including about 200 new candidate cell cycle mutations. Subsequent molecular and cellular characterization of these mutants should provide new insights in plant cell biology; a comprehensive mutant collection is an essential prerequisite to ensure coverage of a broad range of biological pathways. These methods are integrated with downstream genetics and bioinformatics procedures for efficient mapping and identification of the causative mutations that are beyond the scope of this manuscript.

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Temperature-sensitive (ts) lethal mutants are valuable tools to identify and analyze essential functions. Here we describe methods to generate and classify ts lethal mutants in high throughput.

ハイスループットは、ロボットに温度に敏感な致死変異体の単離を支援します<em&gt;クラミドモナス</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting mutant alleles reside at their endogenous genomic sites and no exogenous DNA sequences are left in the genome following the procedure. Since in haploid yeast cells each of the four core histone proteins is encoded by two non-allelic genes with highly homologous open reading frames (ORFs), targeting mutagenesis specifically to one of two genes encoding a particular histone protein can be problematic. The strategy we describe here bypasses this problem by utilizing sequences outside, rather than within, the ORF of the target genes for the homologous recombination step. Another feature of this system is that the regions of DNA driving the homologous recombination steps can be made to be very extensive, thus increasing the likelihood of successful integration events. These features make this strategy particularly well-suited for histone gene mutagenesis, but can also be adapted for mutagenesis of other genes in the yeast genome.

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

A strategy for generating mutations in histone genes at their endogenous location in Saccharomyces cerevisiae is presented.

ターゲットを絞りました<em&gt;その場で</em出芽酵母におけるヒストン遺伝子の&gt;突然変異誘発

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play in the functioning of cells and whole organisms. This cause has been tremendously aided by the recent introduction of the CRISPR/Cas9 system-a versatile tool that allows researchers to manipulate the genome and transcriptome in order to, among other things, knock out, knock down, or knock in genes in a targeted manner. For the purpose of knocking out a gene, CRISPR/Cas9-mediated double-strand breaks recruit the non-homologous end-joining DNA repair pathway to introduce the frameshift-causing insertion or deletion of nucleotides at the break site. However, an individual guide RNA may cause undesirable off-target effects, and to rule these out, the use of multiple guide RNAs is necessary. This multiplicity of targets also means that a high-volume screening of clones is required, which in turn begs the use of an efficient high-throughput technique to genotype the knockout clones. Current genotyping techniques either suffer from inherent limitations or incur high cost, hence rendering them unsuitable for high-throughput purposes. Here, we detail the protocol for using fluorescent PCR, which uses genomic DNA from crude cell lysate as a template, and then resolving the PCR fragments via capillary gel electrophoresis. This technique is accurate enough to differentiate one base-pair difference between fragments and hence is adequate in indicating the presence or absence of a frameshift in the coding sequence of the targeted gene. This precise knowledge effectively precludes the need for a confirmatory sequencing step and allows users to save time and cost in the process. Moreover, this technique has proven to be versatile in genotyping various mammalian cells of various tissue origins targeted by guide RNAs against numerous genes, as shown here and elsewhere.

The genotyping technique described here, which couples fluorescent polymerase chain reaction (PCR) to capillary gel electrophoresis, allows for high-throughput genotyping of nuclease-mediated knockout clones. It circumvents limitations faced by other genotyping techniques and is more cost effective than sequencing methods.

ハイスループットフォーマットでの遺伝子型CRISPR / Cas9媒介ノックアウト変異体に蛍光PCR-キャピラリーゲル電気泳動法を用いました

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical regions, is caused by infection with Plasmodium parasites. The development of more effective drugs to combat malaria can be accelerated by improving our understanding of the biology of this complex parasite. Genetic manipulation of these parasites is key to understanding their biology; however, historically the genome of P. falciparum has been difficult to manipulate. Recently, CRISPR/Cas9 genome editing has been utilized in malaria parasites, allowing for easier protein tagging, generation of conditional protein knockdowns, and deletion of genes. CRISPR/Cas9 genome editing has proven to be a powerful tool for advancing the field of malaria research. Here, we describe a CRISPR/Cas9 method for generating glmS-based conditional knockdown mutants in P. falciparum. This method is highly adaptable to other types of genetic manipulations, including protein tagging and gene knockouts.

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

We describe a method for generating glmS-based conditional knockdown mutants in Plasmodium falciparum using CRISPR/Cas9 genome editing.

作る条件付き変異体の人間のマラリア原虫マラリアに CRISPR/Cas9 遺伝子の編集

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool commonly used in yeast studies. The expression of a number of neurodegenerative disease-associated proteins in yeast causes cytotoxicity and aggregate formation, recapitulating findings seen in patients with these disorders. Here, we describe a method for screening a yeast model of the Amyotrophic Lateral Sclerosis-associated protein FUS for modifiers of its toxicity. Instead of using transformation, this new screening platform relies on the mating of yeast to introduce an arrayed library of plasmids into the yeast model. The mating method has two clear advantages: first, it is highly efficient; second, the pre-transformed arrayed library of plasmids can be stored for long-term as a glycerol stock, and quickly applied to other screens without the labor-intensive step of transformation into the yeast model each time. We demonstrate how this method can successfully be used to screen for genes that modify the toxicity of FUS.

This article presents a mating-based method to facilitate overexpression screening in budding yeast using an arrayed plasmid library.

酵母の過剰発現の交尾ベース ライブラリ スクリーニング

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives each year. Effective treatment options able to halt disease progression are lacking. Despite the extensive sequencing efforts in large patient populations, the majority of ALS and PD cases remain unexplained by genetic mutations alone. Epigenetics mechanisms, such as the post-translational modification of histone proteins, may be involved in neurodegenerative disease etiology and progression and lead to new targets for pharmaceutical intervention. Mammalian in vivo and in vitro models of ALS and PD are costly and often require prolonged and laborious experimental protocols. Here, we outline a practical, fast, and cost-effective approach to determining genome-wide alterations in histone modification levels using Saccharomyces cerevisiae as a model system. This protocol allows for comprehensive investigations into epigenetic changes connected to neurodegenerative proteinopathies that corroborate previous findings in different model systems while significantly expanding our knowledge of the neurodegenerative disease epigenome.

This protocol outlines experimental procedures to characterize genome-wide changes in the levels of histone post-translational modifications (PTM) occurring in connection with the overexpression of proteins associated with ALS and Parkinson&#39;s disease in Saccharomyces cerevisiae models. After SDS-PAGE separation, individual histone PTM levels are detected with modification-specific antibodies via Western blotting.

酵母神経変性認知症予備モデルにおけるヒストン翻訳後修飾変化の特性

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely related biochemical pathways. Previous methods such as the Synthetic Genetic Array (SGA) analysis, and random mutagenesis techniques using ultraviolet (UV) or chemicals like ethyl methanesulfonate (EMS) or N-ethyl-N- nitrosourea (ENU), have been widely used but are often costly and laborious. Also, these mutagen-based screening methods are frequently associated with severe side effects on the organism, inducing multiple mutations that add to the complexity of isolating the suppressors. Here, we present a simple and effective protocol to identify suppressor mutations in mutants which confer a growth defect in Schizosaccharomyces pombe. The fitness of cells with a growth deficiency in standard rich liquid media or synthetic liquid media can be monitored for recovery using an automated 96-well plate reader over an extended period. Once a cell acquires a suppressor mutation in the culture, its descendants outcompete those of the parental cells. The recovered cells that have a competitive growth advantage over the parental cells can then be isolated and backcrossed with the parental cells. The suppressor mutations are then identified using whole-genome sequencing. Using this approach, we have successfully isolated multiple suppressors that alleviate the severe growth defects caused by loss of Elf1, an AAA+ family ATPase that is important in nuclear mRNA transport and maintenance of genomic stability. There are currently over 400 genes in S. pombe with mutants conferring a growth defect. As many of these genes are uncharacterized, we propose that our method will hasten the identification of novel functional interactions with this user-friendly, high-throughput approach.

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

We present a simple suppressor screen protocol in fission yeast. This method is efficient, mutagen-free, and&#160; selective&#160; for&#160; mutations that&#160; often&#160; occur at&#160; &#160;a&#160; single&#160; genomic&#160; locus.&#160; The protocol is suitable for isolating suppressors that alleviate growth defects in liquid culture that are caused by a mutation or a drug.

分裂酵母分裂酵母のディープ シーケンス アシスト、自発的な抑制画面

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely ...

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and computational approaches. One such method is the yeast one-hybrid (Y1H) assay, in which interactions between TFs and DNA regions are tested in the milieu of the yeast nucleus using reporter genes. Y1H assays involve two components: a &#8216;DNA-bait&#8217; (e.g., promoters, enhancers, silencers, etc.) and a &#8216;TF-prey,&#8217; which can be screened for reporter gene activation. Most published protocols for performing Y1H screens are based on transforming TF-prey libraries or arrays into DNA-bait yeast strains. Here, we describe a pipeline, called enhanced Y1H (eY1H) assays, where TF-DNA interactions are interrogated by mating DNA-bait strains with an arrayed collection of TF-prey strains using a high density array (HDA) robotic platform that allows screening in a 1,536 colony format. This allows for a dramatic increase in throughput (60 DNA-bait sequences against &#62;1,000 TFs takes two weeks per researcher) and reproducibility. We illustrate the different types of expected results by testing human promoter sequences against an array of 1,086 human TFs, as well as examples of issues that can arise during screens and how to troubleshoot them.

Here, we present an enhanced yeast one-hybrid screening protocol to identify the transcription factors (TFs) that can bind to a human DNA region of interest. This method uses a high-throughput screening pipeline that can interrogate the binding of &#62;1,000 TFs in a single experiment.

人間の DNA 配列に結合する転写因子を識別するために強化されたイースト 1 ハイブリッド スクリーン

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, Eastern equine encephalitis, lymphatic filariasis, and Saint Louis encephalitis. Notably, avian malaria has played a major role in the extinction of numerous endemic island bird species, while WNV has become an important vector-borne disease in the United States. To gain further insight into C. quinquefasciatus biology and expand their genetic control toolbox, we need to develop more efficient and affordable methods for genome engineering in this species. However, some biological traits unique to Culex mosquitoes, particularly their egg rafts, have made it difficult to perform microinjection procedures required for genome engineering. To address these challenges, we have developed an optimized embryo microinjection protocol that focuses on mitigating the technical obstacles associated with the unique characteristics of Culex mosquitoes. These procedures demonstrate optimized methods for egg collection, egg raft separation and other handling procedures essential for successful microinjection in C. quinquefasciatus. When coupled with the CRISPR/Cas9 genome editing technology, these procedures allow us to achieve site-specific, efficient and heritable germline mutations, which are required to perform advanced genome engineering and develop genetic control technologies in this important, but currently understudied, disease vector.

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

This protocol describes microinjection procedures for Culex quinquefasciatus embryos that are optimized to work with CRISPR/Cas9 gene editing tools. This technique can efficiently generate site-specific, heritable, germline mutations that can be used for building genetic technologies in this understudied disease vector.

キュレックス・キンケファシアトゥスにおける効率的な部位特異的変異誘発のための胚微小注入技術

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, ...