Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande chiave nella biologia del parassita della malaria umana, P.Falciparum, aiutando a scoprire la funzione proteica attraverso il knockdown condizionale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che permette una generazione relativamente facile di mutanti condizionali rispetto ai metodi precedenti. Per iniziare, vai a Chop Chop e seleziona Fasta Target'Under Target, incolla le 200 coppie di basi dalle tre estremità principali del frame di lettura aperto di un gene e 200 coppie di basi dall'inizio dei tre UTR primi del gene.
In In'select P.Falciparum' e selezionare CRISPR/Cas9'under Using'Next, fare clic su Trova siti di destinazione'Selezionare una sequenza di gRNA tra le opzioni presentate, privilegiando il gRNA più efficiente più vicino al sito di modifica e con il minor numero di siti fuori destinazione. Acquista la sequenza di gRNA e il suo complemento inverso come oligo purificato di elettroforesi in gel di poliacrilammide. La sequenza di gRNA utilizzata per colpire PfH-sp70x può essere trovata nel protocollo di testo.
Aggiungere 40 microgrammi ciascuno di DNA pMK-U6, pUF1-Cas9 e pHA-glmS in un tubo di centrifuga sterile da 1,5 millimetri. Aggiungere un decimo del volume di DNA di tre acetato di sodio molare in acqua al tubo e mescolarlo bene usando un vortice. Quindi, aggiungere 2,5 volte il volume di etanolo al 100% al tubo e mescolarlo bene usando un vortice per almeno 30 secondi.
Posizionare il tubo sul ghiaccio o a meno 20 gradi Celsius per 30 minuti. Quindi, centrifuga il tubo a 18.300 volte G per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, rimuovere con cura il supernatante dal tubo senza disturbare il pellet.
Aggiungere tre volte il volume del 70% di etanolo al tubo e mescolarlo brevemente usando un vortice. Centrifugare il tubo a 18.300 volte G per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Ancora una volta, rimuovere con cura il supernatante dal tubo senza disturbare il pellet.
Lasciare il tubo aperto e lasciare asciugare il pellet per 15 minuti. Conservare il DNA precipitato a meno 20 gradi Celsius fino a quando non è necessario per la trasfezione. Per trasfetto gli RBC, preparare il buffer 1X cytomix e l'RPMI incompleto e completo come descritto nel protocollo di testo.
Filtrare sterilizzare il buffer utilizzando un filtro da 0,22 micron. Aggiungere 380 microlitri della 1X cytomix al DNA e al vortice per dissolversi. Lasciare sciogliere il DNA nel 1X cytomix per 10 minuti, vortice ogni tre minuti per 10 secondi.
In un tubo conico sterile da 15 millilitri, unire 300 microlitri di RBC umani isolati nell'RPMI incompleto con quattro millilitri di 1X cytomix. Centrifuga gli RBC a 870 volte G per tre minuti. Quindi rimuovere il supernatante dal pellet RBC.
Sospendere di nuovo il pellet RBC con la miscela DNA-cytomix e trasferirlo in una cuvetta di elettroporazione di 0,2 centimetri. Porate gli RBC utilizzando le condizioni elencate nel protocollo di testo. Dopo l'elettroporazione, trasferire il contenuto dalla cuvetta ad un tubo conico da 15 millilitri contenente cinque millilitri di RPMI completo.
Centrifugare il tubo a 870 volte G per tre minuti a 20 gradi Celsius. Quindi, decantare il supernatante. Ora, sospendere di nuovo il pellet in quattro millilitri di RPMI completo e trasferirlo in un pozzo in una piastra di coltura tissutale a sei pozzi.
Aggiungete 400 microlitri di coltura ad alto schizont agli RBC trasferiti. Mantenete tutte le colture a 37 gradi Celsius sotto il 3% di ossigeno, il 3% di CO2 e il 94% di azoto. Il giorno dopo, lavare la coltura con quattro millilitri di RPMI completo.
Centrifugare la coltura a 870 volte G per tre minuti. Aspirare il supernatante. Sospendere di nuovo la coltura in quattro millilitri di RPMI completo.
48 ore dopo, lavare la coltura con quattro millilitri di RPMI completo. Quindi, sospendere di nuovo la coltura in RPMI completo contenente un DSM1 micromolare da selezionare per il plasmide Cas9. Dopo questo punto, sostituire il mezzo di coltura con RPMI fresco completo più un DSM1 micromolare ogni 48 ore.
Continua a lavare le colture ogni giorno con RPMI completo fino a quando i parassiti non sono più visibili dallo striscio di sangue. Per fare uno striscio di sangue, pipettare 150 microlitri di coltura in un tubo di centrifuga da 0,6 millilitri. Dopo aver pellettato le cellule per centrifugazione a 1.700 volte G per 30 secondi, aspirare fuori dal supernatante.
Utilizzare una pipetta per trasferire le celle a pellet in uno scivolo di vetro. Utilizzando un secondo scivolo di vetro tenuto con un angolo di 45 gradi alla prima diapositiva, spalmare la goccia di sangue. Macchiare la diapositiva utilizzando un kit di colorazione disponibile in commercio secondo il protocollo del produttore.
Guarda i parassiti usando l'obiettivo 100 volte l'immersione dell'olio. A partire da cinque giorni dopo la trasfezione, rimuovere due millilitri della coltura con RBC ri-sospesi nel mezzo di coltura. Aggiungere indietro due millilitri di mezzo fresco e sangue al due per cento di ematocrito.
Aggiungere sangue fresco in questo modo una volta alla settimana fino a quando il parassita non riappare, come determinato da sottile striscio di sangue. Eseguire diluizioni seriali della coltura parassita per ottenere una concentrazione finale di 0,5 parassiti per 200 microlitri. Aggiungere 200 microlitri della coltura diluita ai pozzi di una piastra di coltura tissutale a 96 pozzoli.
Mantenere la piastra di clonazione fino a quando i parassiti non sono rilevabili nei pozzi. Ogni 48 ore, sostituire il mezzo nella piastra da 96 pozzi con mezzo fresco. Una volta alla settimana, a partire da cinque giorni dall'inizio della piastra di clonazione, rimuovere 100 microlitri da ogni pozzo e aggiungere indietro 100 microlitri di mezzo fresco più sangue.
Per identificare eventuali pozzi contenenti parassiti, posizionare la piastra di 96 po 'con un angolo di 45 gradi per circa 20 minuti, consentendo al sangue di depositarsi ad angolo all'interno della piastra. Quindi, posizionare la piastra da 96 po 'su una scatola luminosa. Si noti che i pozzi contenenti parassiti contengono mezzi di colore giallo, rispetto ai mezzi rosa dei pozzi senza parassiti, a causa dell'acidificazione del mezzo da parte dei parassiti.
Utilizzando una pipetta sierologica, spostare il contenuto dei pozzi contenenti parassiti su una piastra di coltura tissutale di 24 pozzi per consentire l'espansione della parasitemia. Utilizzando l'analisi PCR, controllare queste linee di parassiti clonali per una corretta integrazione. I risultati di un test di immunofluorescenza sono mostrati qui, dimostrando il tagging HA con successo di PfH-sp70x.
I parassiti glmS PfH-sp70x sono stati fissati e macchiati con DAPI come marcatore del nucleo, così come gli anticorpi contro ha. Proteina ricca di istidina associata alla membrana, un marcatore dell'esportazione di proteine nell'RBC ospite. Qui viene mostrata un'analisi Western Blot del livello proteico PfH-sp70x dopo il trattamento con glucosamina. Come previsto, il livello proteico diminuisce durante la durata del trattamento.
Questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo della parassitologia per indagare le questioni fondamentali nella biologia del parassita della malaria. È importante ricordare che P.Falciparum è un agente patogeno trasportato dal sangue e dovrebbero essere indossati adeguati dispositivi di protezione individuale durante l'esecuzione di questa procedura.
