Questo protocollo ci permette di esplorare facilmente le caratteristiche epigenetiche della malattia neurodegenerativa. Il principale vantaggio di questa tecnica è che sfrutta il lievito come sistema modello, rispetto ad altri modelli cellulari e animali di malattia neurodegenerativa, il lievito è conveniente ed economico. Questa tecnica ci consente di mappare i cambiamenti epigenetici che sorgono nella malattia neurodegenerativa, che possono portare a nuovi marcatori per la diagnosi, così come nuovi obiettivi per la terapia.
Questo metodo consente un'ulteriore indagine sul ruolo dei segni epigenetici nella malattia neurodegenerativa e può essere modificato per la valutazione dei fibroblasti umani e delle cellule staminali pluripotenti indotte. Questo particolare metodo contiene una serie di dettagli che devono essere dimostrati visivamente, come il corretto caricamento dell'apparato western blot. A dimostrare la procedura saranno Michel Fallah e Navin Rana, entrambi ricercatori universitari del laboratorio Torrente.
Iniziare riposando il lievito dalle scorte di glicerolo congelato su lastre medie selettive di agar di istidina al 2%, per un'incubazione da due a tre giorni a 30 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, inoculare il lievito restreaked per ogni modello di espressione superiore e controllare in cinque millilitri di mezzo liquido selettivo di istidina. Integrato con 2%raffinose a 30 gradi Celsius e 200 rotazioni al minuto, durante la notte.
La mattina seguente, coltivare 100 millilitri di coltura liquida per ciascuno dei modelli di sovraespressione e controlli in mezzi selettivi integrati con il 2% di galattosio durante la notte. E misurare la densità ottica a 600 nanometri o OD600 per determinare il volume della coltura notturna necessaria per rendere le colture di espressione ad un OD600 iniziale di 0,3. Per indurre l'iperespressione proteica, far crescere il lievito su un mezzo di galattosio con scuotimento a 30 gradi Celsius per l'appropriato periodo di tempo sperimentale.
Quindi misurare l'OD600 di ogni cultura alla fine del periodo di induzione. E standardizzare tutti i conteggi delle celle al valore OD600 più basso. Raccogliere le colture in tubi di centrifuga da 50 millilitri per centrifugazione e rimosogliere i pellet in un millilitro di acqua sterile ancorata per ogni 10 millilitri di coltura coltivati.
Aliquota un millilitro di resuspensione cellulare in singoli tubi di microcentrifugo per un'ulteriore centrifugazione e aspirare i supernaganti. Quindi agganciare congelare i pellet cellulari in azoto liquido per la conservazione a meno 80 gradi Celsius. Per lire le cellule per l'analisi western delle macchie, scongelare il pellet di cellule di lievito sul ghiaccio prima della resuspensione in 100 microlitri di acqua distillata.
Aggiungere 300 microlitri di idrossido di sodio 0,2 molare e 20 microlitri di 2-Mercaptoetanolo a ciascun campione cellulare. E rimospendare il pellet con la pipettazione. Dopo un'incubazione di 10 minuti sul ghiaccio, pellettò le cellule mediante centrifugazione e rimospendò i campioni in 100 microlitri di colorante di carico.
Quindi far bollire i campioni per 10 minuti su un blocco riscaldante. Durante la lysed dei campioni, posizionare due gel in un supporto in gel e riempire la camera interna verso l'alto con il tampone di corsa e la camera esterna al segno di linea a due gel. Quando i campioni sono pronti, caricare 15 microlitri ciascuno, soluzione di lysis cellulare, in ogni pozzo del pozzo 10, gel di poliacrilammide al 12% e aggiungere bene cinque microlitri di scala proteica alla corsia della scala proteica.
Eseguire il gel per circa 45 minuti a 150 volt o fino a quando il caricamento della parte anteriore del colorante raggiunge il fondo del gel. Mentre il gel è in funzione, immergere due cuscinetti in fibra per gel nel tampone di trasferimento e un fluoruro di polivinilidene, o PVDF, membrana per gel in metanolo. Quando il gel è pronto, sciacquare la membrana nel tampone di trasferimento e posizionare un cuscinetto in fibra presoaked sul fondo di una cella dell'apparato di trasferimento semi-secco.
Seguito dalla membrana PVDF, dal gel e dal secondo cuscinetto in fibra presoaked. Quindi impostare la potenza su 150 milliarti per un'ora. Al termine del trasferimento proteico, rimuovere la membrana dall'apparato di trasferimento per un breve risciacquo con acqua distillata.
Posizionare la membrana risciacquata, il lato proteico in una piccola scatola di colorazione e coprire la membrana con soluzione salina tris-tamponata o TBS, bloccando il buffer per un'incubazione di un'ora a temperatura ambiente con un dolce dondolo. Alla fine dell'incubazione di blocco, incubare la membrana durante la notte con un istono anti-lievito e anticorpi specifici per la modifica in TBS a quattro gradi Celsius. E un vero e proprio anticorpo di controllo del carico nucleare.
La mattina seguente, lavare la membrana quattro volte in TBS, integrata con 0,1% polisorbato 20 per cinque minuti con dondolo a temperatura ambiente per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, incubare la macchia con gli anticorpi secondari appropriati per un'ora a temperatura ambiente. Seguito da quattro lavaggi di cinque minuti in TBST e un lavaggio di cinque minuti in TBS da solo con dondolo.
Quindi immagina la macchia su un sistema di immaginazione western fluorescente per due minuti. Qui, la soppressione della crescita nelle colture solide e liquide è mostrata con effetti significativi sulla crescita del lievito osservati in presenza di galattosio infuso nei modelli di sovraespressione del sarcoma. Una significativa diminuzione dei livelli di istoni è evidente nel modello di sovraespressione del sarcoma e si osservano aumenti significativi dei livelli di acetilazione dell'istone nel modello di sovraespressione della proteina legante TAR 43 che non sono visti né nel modello di sovraespressione del sarcoma né in quello della sinuleina alfa.
Ci sono anche significative diminuzioni dei livelli istoni nel modello di sovraespressione alfa sinuleina. In questo esperimento di accordatura del saccarosio, minore è la quantità di galattosio utilizzata per indurre fusa nella sovraespressione del sarcoma, minore è la tossicità che si osserva sia nella coltura solida che liquida. È importante sottolineare che più basso è il livello di sovraespressione del sarcoma, minore è la grandezza della riduzione dei livelli di istoni.
Durante l'esecuzione di questo protocollo, è imperativo standardizzare la quantità di lievito in ogni campione per consentire un confronto corretto nei livelli di modifica post-traslazionale istonale. 2-Mercaptoetanolo deve essere usato sotto una cappa per evitare l'inalazione. Se viene utilizzata la macchia di Ponceau, deve essere scartata correttamente.
