Vorremmo ringraziare Boast Sharon per le discussioni penetranti molti e B. Novitch per il gentile dono degli anticorpi anti-FOXP1. Questo lavoro finanziato da una borsa di studio del Wellcome Trust a KCT e una borsa di studio del progetto del Wellcome Trust di SRP (Grant numero di riferimento 094399/B/10/Z).

1. Fai soluzioni necessarie <ol><li> Tampone fosfato 1 M:. Pesare 109,4 g di Na 2 HPO 4 e 32 g di NaH 2 PO 4 H 2 0, mescolare e sciogliere in acqua al volume totale di 1 litro. </li><li> Soluzione tampone fosfato (PBS): Preparare tampone fosfato 0,1 M, 0,15 M di NaCl. 100 ml di PBS dovrebbe essere sufficiente per il trattamento di fette da 10 embrioni. </li><li> Agarosio: Calore soluzione di PBS a circa 70 ° C e aggiungere solidi a bassa temperatura di fusione agarosio lentamente, mentre mescolando continuamente. Rendono la soluzione ad una concentrazione finale del 4% (w / v) di agarosio. Fare una scorta di 50 ml di questa soluzione. Lasciare questa soluzione in un bagno d&#39;acqua mantenuto a 48 ° C fino al momento dell&#39;uso. La soluzione di agarosio inutilizzata dopo l&#39;esperimento può essere conservato a 4 ° C per diverse settimane. </li><li> Anticorpo soluzione blocco: Aggiungi il siero fetale di vitello e Triton X-100 a un Concentrazione finalezione del 1% (v / v) di siero fetale bovino, 0,1% (v / v) Triton X-100 in PBS. 10 ml di soluzione di blocco sarà sufficiente per la immunocolorazione su 5 vetrini di sezioni al criostato. </li><li> Fissativo: Preparare NaOH 0,75 millimetri, 4% (w / v) di paraformaldeide (ATTENZIONE). Per preparare fissativo quantità di calore necessaria di acqua a 70 ° C, aggiungere NaOH concentrato a concentrazione finale desiderata, aggiungere paraformaldeide solida e mescolare fino a dissoluzione. Raffreddare su ghiaccio a 4 ° C. 10 ml di questa soluzione è sufficiente per 20 pozzetti di fette embrioni. </li><li> Saccarosio Soluzione: Preparare 10 ml di una soluzione di saccarosio al 30% (w / v) contenente 0,1 M tampone fosfato. 10 ml di questa soluzione sarà sufficiente per 10 pozzetti di fette embrioni. </li><li> 70% (v / v) di etanolo. Diluire 70 ml di etanolo assoluto con 30 ml di acqua. </li><li> Cultura Media: Preparare una soluzione di estratto di pollo 1% degli embrioni, 1% penicillina / streptomicina, 0,35% L-Glutammina, 0,1% 2-mercaptoethanol, 4% siero di pollo, 2% B27 supplemento e 100 ng / ml fattore di crescita ciliaryneurotrophic (CNTF) tutti diluito in terreno Neurobasal; preparata su ghiaccio e usato lo stesso giorno. 10 ml di mezzo di coltura è richiesto per 20 pozzetti di fette embrioni. </li></ol> 2. Chick Embryo Preparazione <ol><li> Luogo fecondati uova di gallina con il lato più lungo in orizzontale in un tiraggio forzato incubatore a 38 ° C fino a quando si sviluppano in scena 15 24. Questo richiede di solito circa 4 giorni di incubazione. </li><li> Il secondo giorno di incubazione, sterilizzare il guscio dell&#39;uovo strofinando con un fazzolettino di carta imbevuto di etanolo al 70%. Attentamente forare l&#39;estremità piatta del guscio dell&#39;uovo utilizzando un ago da 21 attaccato ad una siringa da 5 ml e rimuovere 5 ml di albumina. Questo riduce l&#39;embrione di distanza dalla shell, quindi l&#39;embrione non è danneggiata quando il serbatoio è aperto. Riportare le uova per l&#39;incubatore e incubare loro per altri 2 giorni. </li><li> Utilizzando smussato Dumont # 5 pinze carefully forare il centro della parte superiore del guscio e rimuovere circa 9 cm 2 di shell. Tagliare intorno l&#39;embrione e con attenzione sollevare l&#39;embrione e il luogo in HBSS durante la dissezione. Gli embrioni devono essere messo in scena in base alle Hamburger e Hamilton (1992) 15. Tutti gli embrioni utilizzati dovrebbe essere vicino alla fase 24. Eventuali embrioni che mostrano segni di anomalia deve essere eliminata. </li><li> Rimuovere la membrana amniotica, corio-allantoico membrana, la testa, e allantoide con due Dumont # 5 forcipe. Eviscerate l&#39;embrione per rimuovere tutti gli organi interni. Per effettuare questa operazione, tagliare aprire la linea mediana ventrale dell&#39;embrione con micro forbici dissezione, tenere l&#39;embrione attorno alla regione del tronco rostrale con un paio di pinze, afferrare la parte rostrale del intestino e il cuore e tirare caudalmente. È importante che questo è fatto pulito. Si dovrebbe essere in grado di vedere l&#39;embrione somiti chiaramente. Tagliare l&#39;embrione a metà, trasversalmente tra il buds.Now arto superiore e inferiore tagliare il corpo toracicaparete con le forbici microdissezione. </li></ol> 3. Embrione Slice Preparazione <ol><li> Rimuovere la soluzione di agarosio dal bagnomaria. Tagliare 5 cm dal fondo di una plastica monouso 3 ml pipetta Pasteur. </li><li> Rimuovere delicatamente la parte lombare della dell&#39;embrione sezionato con due pinze per cullare l&#39;embrione dalla soluzione dissezione e mettere in un piatto asciutto Petri. Utilizzando la pipetta Pasteur, rimuovere circa 2 ml di agarosio, pipetta circa 0,5 ml sopra dell&#39;embrione e quindi aspirare la fetta embrione nella pipetta. Trasferire l&#39;embrione e agarosio ad una buccia di distanza stampo di plastica fare attenzione a non introdurre bolle nel agarosio. Abbassare delicatamente l&#39;embrione al fondo del agarosio nello stampo di plastica con la sezione toracica rivolto verso il basso. L&#39;embrione deve essere posizionata per essere direttamente utilizzando un ago calibro 21. Le fette conterrà anche parte dell&#39;arto sviluppo ed è importante che l&#39;orientamento dell&#39;embrione in agarose lo consentiranno. Collocare l&#39;imbarcazione su ghiaccio per impostare l&#39;agarosio. Fare attenzione che l&#39;embrione non cambia l&#39;orientamento in questo periodo (circa 2 min). </li><li> La Leica VT1000S vibratomo (Velocità 3, frequenza 4, 400 micron di spessore fette) deve essere istituito con la camera piena di HBSS affettare e circondato da acqua ghiacciata. Il blocco di agarosio viene quindi attaccato alla piattaforma vibratomo con colla super. Il blocco di agarosio viene tagliato con una lama di rasoio per lasciare il pezzo embrione con 1-3 mm di agarosio circonda. Le fette che includono sezioni gemma degli arti con una chiara apicale ectodermica Rigde vengono selezionati e queste fette vengono poi poste in HBSS. Generalmente, ci sono solo 1-2 fette adatti per embrione. Rimuovere delicatamente l&#39;agarosio intorno alle fette di tessuto con due aghi. È essenziale che questo è fatto accuratamente. </li></ol> 4. Coltura embrioni Fette <ol><li> Aggiungere 500 ml di soluzione di coltura (di cui sopra) al required il numero di pozzetti di una 24 pozzetti bassissimo piastra di fissaggio del tessuto trattato della cultura. Trasferire le fette attentamente dalla soluzione HBSS nel pozzo. In generale, cerchiamo di avere due o tre fette in ciascun pozzetto. Posizionare la piastra a 24 pozzetti in coltura tissutale incubatore a 37 ° C con 5% di CO 2 per 24 ore. </li></ol> 5. Sezionamento delle slice per i Immunostaining <ol><li> A seguito del periodo di coltura, aggiungere 500 microlitri di correzione unbuffered a ciascun pozzetto di fette embrioni e lasciare in ghiaccio per 20 min. La soluzione totale viene poi rimosso con attenzione e tre lavaggi PBS sono effettuate, con intervalli di 5 minuti. Le fette vengono poi lasciati in soluzione di saccarosio a 4 ° C, fino al lavello fette, circa 6 ore, ma può essere lasciato a lungo (ad esempio durante la notte). </li><li> Togliere le fette e tamponare una soluzione di saccarosio in più ed equilibrare in circa 1 ml di ottobre per circa 5 minuti a 20 ° C. Montare ogni appartamento fetta in un PTOM pieno di staccarsi stampi in plastica.Dopo il montaggio, mettere gli stampi in verticale su ghiaccio secco a solidificare. </li><li> Montare i blocchi ottobre nel criostato ed equilibrare i blocchi a -24 ° C per circa 20 min. Tagliare ogni fetta con 15 sezioni mm montato su Superfrost-Plus diapositive. Vetrini possono essere conservati a -80 ° C fino al loro utilizzo. </li></ol> 6. Immunofluorescenza <ol><li> Pipettare 1-2 ml di PBS sulle slitte orizzontali tenuti in una camera umidificata con le slitte sollevate dal fondo della camera (usiamo 1 o 2 ml pipette di plastica fissati con nastro autoclave). Incubare le sezioni in PBS per 5 min a 20 ° C per rimuovere l&#39;eccesso ottobre Rimuovere la soluzione PBS dal vetrino e aggiungere 500 ml di soluzione di blocco sulle sezioni, incubare per 30 min a 20 ° C. Rimuovere la soluzione di blocco e immediatamente aggiungere 500 ml di anticorpo primario diluito aggiunto ai vetrini, incubare a 4 ° C per 18-22 ore. </li><li> Rimuovere la soluzione primaria di anticorpi e subito è statoh i vetrini con 1 ml di PBS per 5 minuti, tre volte a 20 ° C per rimuovere l&#39;eccesso di soluzione di anticorpo primario. Aggiungere 500 ml di soluzione diluita di anticorpo secondario fra le diverse sezioni. I vetrini vengono quindi lasciati a 20 ° C per 30 min. La soluzione di anticorpo secondario viene quindi rimosso e la slitta lavata 3 volte 5 min in PBS a 20 ° C. </li><li> A seguito di queste soluzioni di lavaggio, rimuovere la finale PBS lavaggio, tamponare il bordo della diapositiva per rimuovere l&#39;eccesso di PBS, aggiungere due gocce di Vectashield sulle slitte e appoggiare delicatamente un coprioggetto di vetro sopra le sezioni, evitando la formazione di bolle. Rimuovere Vectashield eccesso tamponando dal bordo delle diapositive prima di imaging. </li></ol> 7. Imaging <ol><li> Immagine le sezioni immunocolorate. Usiamo un Nikon Eclipse E80i microscopio a fluorescenza dotato di una fotocamera digitale ORCA Hamammatsu ER e 10 X, 40 X 20X e lenti degli obbiettivi. </li></ol>

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Nessuno degli autori concorrenti hanno interessi o conflitti di interesse.

Il protocollo qui descritto permette una fetta embrione di pollo da incubare per più di un giorno mantenendo motoneuroni viva e continuando a migrare durante il periodo di coltura. Nel chiarire le condizioni per mantenere in vita i neuroni motori, abbiamo identificato diverse caratteristiche fondamentali richieste. Sembra che il siero del pulcino fino al 4% è fondamentale per la sopravvivenza dei motoneuroni e la sua sostituzione con il siero di una specie diversa non è tollerato. È interessante notare, abbiamo trovato che la presenza di elevate concentrazioni di siero erano dannosi per le fette in quanto promosse crescita eccessiva del tessuto che porta a gravi distorsioni nella forma slice. Ancora più importante, la presenza del fattore neurotrofico ciliare anche dimostrato critico. Esso rimane possibile che le fette possono essere in grado di essere coltivate per periodi notevolmente più lunghi che solo 24 ore, forse anche consentendo la visualizzazione di input sensoriali afferenti al midollo spinale. Inoltre, la culcondizioni tura qui può anche rivelarsi utile per affettare culture del tronco encefalico in via di sviluppo e il mesencefalo / cervelletto. Forse il più grande potenziale beneficio nell&#39;uso di queste condizioni di coltura fetta è che essi facilitano la possibilità di manipolazione farmacologica della funzione della proteina minimizzando la possibilità di effetti negativi sul resto dell&#39;embrione, come il cuore. Un gran numero di inibitori e agonisti di diverse vie di segnalazione può essere utilizzato per valutare la migrazione dei diversi sottotipi di neuroni spinali e, potenzialmente, l&#39;effetto della formazione di circuiti locali spinali durante lo sviluppo. Inoltre, alcune perturbazioni genetiche di espressione della proteina, come quelli che fanno uso di siRNA e oligonucleotidi morfolino, soffrono per il fatto che essi possono essere introdotti precocemente nello sviluppo (a causa delle limitazioni nelle procedure in ovo elettroporazione) e gli effetti durano solo un breve periodo di time (tipicamente un giorno). La nostra cultura fetta viene avviato in fasi successive e offre la possibilità di utilizzare questa tecnologia in seguito in fase di sviluppo in fase di taglio per vedere i loro effetti durante il periodo della cultura della fetta. Il protocollo cultura fetta potrebbe anche permettere la visualizzazione di entrambi neurone spinale motore così come la migrazione interneurone dorsale in tempo reale tramite microscopia time-lapse video. Ciò potrebbe essere realizzato mediante microscopio a contrasto di fase a luce bianca o attraverso l&#39;uso di imaging di fluorescenza. Se quest&#39;ultima tecnica sono da utilizzare quindi l&#39;introduzione di etichette fluorescenti è necessaria. Ciò potrebbe essere realizzato mediante introduzione dei coloranti fluorescenti come DiI o DiO sia tramite marcatura retrograda dall&#39;arto o etichettatura anterograda dal ventricolo o elettroporazione in ovo di costrutti di guidare proteine ​​fluorescenti in un sottoinsieme di neuroni.

Durante lo sviluppo embrionale normale, molti tipi cellulari diversi sono generati che devono migrare dal loro punto di origine a dove finirà funzione nell&#39;organismo maturo. All&#39;interno del midollo spinale sviluppo, cellule progenitrici sono situati nella zona ventricolare alla linea mediana e generare molti sottotipi di neuroni e cellule gliali postmitotici che devono migrare da integrare in circuiti neuronali funzionali richieste per la trasformazione sensoriale e uscite motore 1. Neuroni motori spinali che controllano la contrazione dei muscoli degli arti sono stati ampiamente studiati e si sa molto delle molecole e dei meccanismi che guidano la formazione delle loro diverse sottoclassi. Tuttavia, molto meno si sa dei meccanismi attraverso i quali motoneuroni migrano, segregare e ricevere ingressi sinaptici. Motore identità sottotipo neurone viene acquisita durante lo sviluppo in modo gerarchico. Motore sottotipi dei neuroni può essere generalmente classificati into colonne distinte, le divisioni e le piscine che sono definiti dalle loro proiezioni assone. Motore colonne assoni progetto sia per i muscoli assiali, viscerali o di un arto. Divisioni motore suddividere l&#39;arto sporgente motoneuroni della colonna motore laterale (LMC) in quelli a sbalzo muscoli ventrali o dorsale 2. All&#39;interno delle divisioni, gruppi di neuroni motori del motore denominato progetto piscine per i singoli muscoli dell&#39;arto 2, 3. Arto-sporgenti neuroni motori sono definite dalla loro espressione del fattore di trascrizione FOXP1 4, 5, mentre l&#39;identità divisionale è caratterizzato dalla espressione dei fattori di trascrizione omeodominio Islet-1 (ventrale sporgente) o LHX-1 (dorsalmente sporgente) 6. Infatti, LHX-1 l&#39;espressione è necessario per le proiezioni appropriate dorsali dei motoneuroni 7. Ognuno di questi sottotipi occupano posizioni distinte all&#39;interno del midollo spinale, i neuroni motori ventrali proiettano venire a risiedere mediale dorsalmente projecting motoneuroni. Il risultato è la LMC essere separati in cosiddetta LMCmedial (LMCM) e LMClateral (LMCl) divisioni. Organizzazione divisionale piscina e il motore è acquisito in due fasi 8. Nella prima fase, la segregazione divisionale è ottenuta tramite una migrazione dei motoneuroni una caratteristica mediale a laterale moda. Le cellule LMCl sono generati dopo che le cellule LMCM e così LMCl migra attraverso la LMCM di raggiungere la sua posizione finale decantazione. La seconda fase si motoneuroni all&#39;interno di una divisione e cluster li in motori neuron piscine, presumibilmente attraverso un dorso-ventrale smistamento dei motoneuroni. Membri della famiglia catenina-dipendente caderina classica hanno dimostrato di essere fondamentale per entrambe le fasi di motoneuroni 8-10 dell&#39;organizzazione. Tuttavia, come funzione caderina controlla il movimento delle cellule è poco conosciuta. L&#39;acquisizione di identità colonnare, divisionali e la piscina sono necessari i segnali estrinseci quel modello intrinsecamenc espressione di fattori di trascrizione 11. Inoltre, circa il 50% di tutti i motoneuroni muoiono per apoptosi durante lo sviluppo normale in un processo che richiede segnali estrinseci dal arto, in gran parte attraverso il sostegno neurotrofico di sopravvivenza dei motoneuroni. Così, motor neuron sviluppo richiede il contesto più idoneo deve essere mantenuta in un timecourse relativamente lungo. Per questo motivo, le pratiche di generare culture fetta midollo spinale di mantenere la sopravvivenza dei neuroni motori richiedono la delucidazione delle appropriate condizioni di coltura. Precedenti culture fetta embrioni sono stati utilizzati per seguire il comportamento di estrinsecamente aggiunto purificato popolazioni neuronali 12-14. Tuttavia, per le condizioni di conoscenza nostra cultura che facilitano in situ di sopravvivenza dei motoneuroni e la migrazione all&#39;interno della stessa sezione non sono stati pubblicati. Abbiamo modificato una condizione standard cultura che facilita la sopravvivenza di purificato, dissociate motoneuroni craniali di agevolare motore sviluppo dei neuroni all&#39;interno di un sistema di coltura degli embrioni fetta. Abbiamo anche monitorato il posizionamento dei motoneuroni superstiti e dimostrano che le posizioni ampiamente normali del motoneurone divisioni viene acquisita durante il periodo di coltura.

<table border="1"><tbody><tr><td> Uova </td><td> Henry Stewart Farms, Regno Unito </td><td></td><td> Le uova fecondate Brown Bovan Hen Gold (Henry Farms Stewart, Regno Unito), conservati a 14 ° C fino a quando l&#39;incubazione </td></tr><tr><td> 21 gauge </td><td> BD-Microlance-3 </td><td> 304432 </td><td></td></tr><tr><td> Siringa da 5 ml </td><td> BD Plastipak </td><td> 302187 </td><td></td></tr><tr><td> # 5 forcipe Dumont </td><td> Roboz </td><td> RS 5045 </td><td></td></tr><tr><td> Micro forbici per dissezione </td><td> Roboz </td><td> RS 5910SC </td><td> (3.5 in diritto) </td></tr><tr><td> Embrione formelle: Peel distanza stampi </td><td> Agar Scientific </td><td> G3764 </td><td> Piramidale sagomata 22 mm a 12 mm </td></tr><tr><td> Super Glue </td><td></td><td></td><td> Power Flex, Loctite </td></tr><tr><td> Etanolo </td><td> SIGMA </td><td> 32221 </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Sodio di-idrogeno fosfato, mono-idrato </td><td> BDH </td><td> 102454R </td><td></td></tr><tr><td> Di sodio mono-idrogeno fosfato </td><td> VWR / BDH </td><td> 102494C </td><td></td></tr><tr><td> Cloruro di sodio </td><td> VWR / BDH </td><td> 27810.295 </td><td></td></tr><tr><td> Agarosio a bassa temperatura di fusione </td><td> Invitrogen </td><td> 16520 </td><td></td></tr><tr><td> Siero fetale bovino </td><td> Gibco </td><td> 10500-064 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> SIGMA </td><td> T8787 </td><td></td></tr><tr><td> Soda caustica </td><td> FLUKA </td><td> 71689 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldeide </td><td> VWR / BDH </td><td> 28794.295 </td><td></td></tr><tr><td> Pipette Pasteur in plastica usa e getta </td><td> Elkay di precisione laboratorio di consumo </td><td> 127-P503-000 </td><td> Liquipette 3 ml di volume </td></tr><tr><td> Hanks soluzione salina bilanciata (HBSS) </td><td> Gibco </td><td> 14170 </td><td></td></tr><tr><td> Saccarosio </td><td> SIGMA </td><td> S0389 </td><td></td></tr><tr><td> Carbonato acido di sodio </td><td> SIGMA </td><td> S5761 </td><td></td></tr><tr><td> Embrione di pollo estratto </td><td> Seralabs </td><td> CE650-J </td><td></td></tr><tr><td> Penicillina / streptomicina soluzione </td><td> Gibco </td><td> 15070 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutammina soluzione </td><td> Gibco </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> 2-mercaptoetanolo </td><td> Gibco </td><td> 21985 </td><td></td></tr><tr><td> Siero di cavallo </td><td> Southern Group Labs </td><td> 9028B </td><td></td></tr><tr><td> B27 supplemento </td><td> Invitrogen </td><td> 17504-044 &lt;/ Td&gt; <td></td></tr><tr><td> Media Neurobasal </td><td> Gibco </td><td> Cat ~ 2103 </td><td></td></tr><tr><td> CilliaryNeurotrophic fattore (CNTF) </td><td> R e Sistemi D </td><td> 557-NT-010 </td><td></td></tr><tr><td> Chick Siero </td><td> SIGMA </td><td> C5405 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorpi primari </td><td></td><td></td><td> sono stati acquistati da Developmental Studies Ibridoma Bank, con l&#39;eccezione di anticorpi anti-FOXP1, che erano un gentile dono da Bennett Novitch di UCLA. Primari diluizioni anticorpi erano coniglio anti-FOXP1 (1/32000), Topo anti-Lhx1 / 2 (4F2) (1/50), Guinea Pig anti-FOXP1 (1/1000). Tutti gli anticorpi sono stati conservati a 4 ° C. </td></tr><tr><td> Anticorpi secondari </td><td></td><td></td><td> Donkey anti-Guinea Pig (Cy3) (1:1000) acquistato da Jackson Laboratories Inc. Immunoreseach Donkey anti-Mouse (Alexa Fluor 488) (1:1000), Donkey anti-coniglio (Alexa Fluor 594) (1:1000) acquistato da Invitrogen Tutti gli anticorpi sono stati conservati a 4 ° C. </td></tr><tr><td> 24-pozzetti </td><td> Corning COSTAR </td><td> 3473 </td><td> bassissimo attacco 24-pozzetti </td></tr><tr><td> Ottobre </td><td> Tissue Tek, Sakura </td><td> 4583 </td><td> Temperatura ottimale di taglio </td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Vector Labs </td><td> H1000 </td><td> Vectashield fluorescente mezzo di montaggio </td></tr><tr><td> Diapositive </td><td> Thermo Scientific </td><td></td><td> SuperFrost-Plus vetrini caricati positivamente, 25 x 75 x 1,0 mm </td></tr><tr><td> Copertura in vetro </td><td> VWR International </td><td> 631-0167 </td><td> 25x60 millimetri </td></tr><tr><td> Forzato progetto di incubatore: </td><td> Lione Electric Company </td><td></td><td> mantenuto umido garantendo livelli dell&#39;acqua sempre sufficienti, mantenuta a 38 ° C </td></tr><tr><td> Criostato </td><td> Brite, Huntingdon, UK </td><td></td><td> -36 ° C </td></tr><tr><td> Tissue Culture Incubator </td><td> DH Autoflow </td><td></td><td> Nuaire 38 ° C CO, 5% 2 </td></tr><tr><td> Vibratomo </td><td> Leica </td><td></td><td> Leica VT1000-S </td></tr><tr><td> Microscopio </td><td> Nikon </td><td></td><td> Nikon Eclipse E80i microscopio a fluorescenza </td></tr><tr><td> Macchina fotografica digitale </td><td> Nikon </td><td></td><td> Nikon DS5M e Hamammatsu ORCA ER </td></tr></tbody></table>

chicken embryo spinal cord slice culture protocol

Culture fetta può facilitare la manipolazione dello sviluppo embrionale sia farmacologicamente e attraverso manipolazioni genetiche. In questo sistema ridotto, potenziali effetti collaterali letali a causa di applicazioni farmacologiche sistemiche possono essere superati. Tuttavia, condizioni di coltura devono garantire che lo sviluppo procede normali nell&#39;ambiente ridotto della fetta. Abbiamo focalizzato sullo sviluppo del midollo spinale, in particolare quello dei motoneuroni spinali. Abbiamo sistematicamente variati condizioni di coltura di fette di embrione di pollo dal punto in cui i motoneuroni spinali più era nato. Abbiamo analizzato il numero e il tipo di motoneuroni sopravvissute durante il periodo di coltura e la posizione di tali neuroni motori rispetto a quella in vivo. Abbiamo trovato che tipo di siero e fattori neurotrofici sono stati richiesti durante il periodo di coltura e sono stati in grado di mantenere in vita i neuroni motori per almeno 24 ore e consentire che i neuroni motori di migrare verso posizioni appropriate nelmidollo spinale. Vi presentiamo queste condizioni di coltura e la metodologia di preparazione delle culture embrione fetta utilizzando embrioni di pollo eviscerati incorporati in agarosio e tagliata con una vibratomo.

L&#39;uso di sezioni colti per seguire lo sviluppo dei neuroni interneuroni e proiezione ha influenzato progredire la nostra comprensione della generazione di organizzazione all&#39;interno della corteccia 16. Nel midollo spinale, il motore dello sviluppo dei neuroni è stato seguito utilizzando colture di embrioni di zebrafish interi 17. Tuttavia, spinale motoneurone organizzazione in zebrafish è relativamente semplice (a causa della mancanza di muscoli degli arti grandi pesci). I meccanismi molecolari che guidano una gerarchia di organizzazione spinale motoneurone durante lo sviluppo dei vertebrati superiori sono attualmente poco compresi. Le condizioni di coltura che facilitano la sopravvivenza dei neuroni e il corpo migrazione cellulare in colture di embrioni fetta di vertebrati superiori sono quindi necessari. Attualmente, midollo spinale culture fetta di vertebrati superiori sono stati utilizzati per neuroni dissociate seme sopra le fette 12-14, indagare assoni contrassegnati in modo fluorescente nella periferia della fetta18, o del comportamento di cellule progenitrici nei primi stadi dello sviluppo del midollo spinale 19. Affettare condizioni di coltura per i cavi dopo spinale, in particolare quelli che mantengono motoneuroni sviluppo attualmente mancano. Per tentare di seguire spinale lo sviluppo neuronale, in particolare quella dei motoneuroni spinali, abbiamo studiato diverse condizioni di coltura che potrebbero promuovere la sopravvivenza dei neuroni motori e l&#39;acquisizione di ordine iniziale nell&#39;organizzazione del motore attraverso la migrazione laterale dei neuroni. Prove iniziali tramite stadio 18 allo stadio 20 fette di pollo del midollo spinale di embrioni si sono rivelati infruttuosi, non siamo stati in grado di mantenere in vita i neuroni motori per più di un paio d&#39;ore e sono stati in grado di dimostrare la generazione di un numero considerevole di cellule LMCl nel periodo di coltura (dati non mostrato). Abbiamo quindi studiato le culture fetta di stadio 24 embrioni, una TimePoint quando la maggior parte dei neuroni LMCM LMCl e sono stati generati, ma quando LMCl neurone migrazione è ancora nella sua infancy (Figura 1a-c). Questa migrazione laterale dei neuroni LMCl è in gran parte completa per fase 27, circa 24-36 ore più tardi (Figura 1 df). Il nostro test potrebbe quindi essere semplificata per essere in grado di mantenere in vita i neuroni e di facilitare la loro migrazione lateralmente nel corno ventrale. Abbiamo iniziato i nostri esperimenti con condizioni di coltura relativamente semplici contenenti solo Hank soluzione equilibrata salina con o senza siero di pollo o di estratto di embrione di pollo. In tutti i casi, anche se siamo stati in grado di mantenere i neuroni LMC nella fetta, abbiamo trovato poche prove di neuroni LMCl mantenuto (almeno da espressione di LHX-1). Inoltre, abbiamo trovato espressione di geni appropriati come HB9 nel midollo spinale dorsale, una situazione che non si verifica in vivo (dati non mostrati). Quindi, queste condizioni di coltura semplici non sono adatte per lo studio dell&#39;acquisizione di organizzazione dei motoneuroni. Abbiamo così cercato conditio più complessans e come base utilizzata una formulazione che è stato pubblicato per favorire la sopravvivenza del dissociate motoneuroni embrionali di pollo cranici. Questa condizione 20 (1% estratto di embrione di pollo, 1% Pen Strep, 0,35% L-Glutammina, 0,1% 2-mercaptoetanolo, siero di cavallo 2%, 2% B27 supplemento e 50 ng / ml di fattore di crescita ciliaryneurotrophic (CNTF) nel mezzo Neurobasal (qui chiamato Guthrie media) ha mantenuto motoneuroni più viva che i mezzi di comunicazione più semplici. Inoltre, non ha comportato l&#39;espressione dei fattori di trascrizione spuria del midollo spinale dorsale. Tuttavia, la sopravvivenza dei neuroni LMCl era scarsa (Figura 1 gi, p). Pertanto ciò che varia considerati fattori chiave nel mezzo Guthrie, cioè l&#39;animale di origine del siero, la concentrazione del siero e la concentrazione del CNTF nel mezzo. Abbiamo trovato che cambiando il siero di siero di cavallo Chick siero e un aumento nella concentrazione del CNTF da 50 ng / ml e 100 ng / ml sostanzialmente aumentato tegli sopravvivenza delle cellule e LMCl LMCM e anche permesso loro migrazione nel corno ventrale sul hr 24 delle condizioni di coltura (figura 1 jl, p). Il numero totale di neuroni motore, il rapporto di LMCM a LMCl e, in effetti, la migrazione delle cellule LMCl nel corno ventrale appariva molto simile a sezioni di embrioni che era stato permesso di sviluppare in ovo piuttosto che nella cultura slice (Figura 1 KO, p). Pertanto, riteniamo che in base al numero fattore di trascrizione cellulare espressione, e la posizione dei motoneuroni, le nostre condizioni di coltura fetta ricapitolare il normale sviluppo del motoneurone spinale, almeno per un periodo di 24 ore. <img alt="Figura 1" fo:content-width="2in" fo:src="/files/ftp_upload/50295/50295fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50295/50295fig1.jpg" /> Figura 1. a - c. Stato di generazione di LMC (FOXP1 colorazione inb), e LMCl (LHX-1 in una colorazione) nella prima fase 24. c è una fusione dei due canali. La linea mediana è mostrato come una linea tratteggiata in A e D, V mostra l&#39;orientamento del dorsoventrale (D, V) asse del midollo spinale d -. F. . Stato della LMC (FOXP1 colorazione in d) e LMCl (LHX-1 in colorazione e) l&#39;organizzazione nella fase 27 f è una fusione dei due canali g -. I. LHX-1 (g) e FOXP1 (h) espressione in sezioni di una fetta coltivate in un mezzo che supporta cranica motor neuron sopravvivenza cellulare (media Guthrie, il nostro &quot;iniziale media&quot; vedi riferimento 20). LHX-1 non è più espresso in neuroni motori, anche se vi è qualche sopravvivenza delle cellule LMC rappresentati da FOXP1 espressione. D, V in (g) mostra l&#39;orientamento del dorsoventrale (D, V) asse del midollo spinale. ML mostra l&#39;orientamento del mediolaterale (M, L) dell&#39;asse della scavo di Pinal j - l. Cellule LMCl (LHX-1 nel corno ventrale in j) e la LMC in generale (FOXP1 in k) può essere osservato in fette coltivate in mezzo contenente 4% di siero pulcino e 100 ng / ml CNTF. Si noti che alcune cellule LMCl si trovano in una posizione laterale nel corno ventrale. La freccia a (j) indica la posizione laterale di alcune delle cellule LMCl. (L) è una fusione dei due canali m -. O. Stato di espressione di LHX-1 (m) e FOXP1 (n) in sezioni di un embrione mantenuto in ovo durante la coltura fetta dell&#39;embrione mostrato nella j - l. (O) è una fusione dei due canali. P. La quantificazione della percentuale di LMCl (FOXP1 + ve / Lhx1 + ve), le cellule contro LMC (FOXP1 + ve / Lhx1-ve) cellule che si trovano nelle culture fetta in condizioni diverse compared controllare embrioni conservati in ovo (che rappresentano il 100%). Student t-test rappresenta *** p &lt;0.01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50295/50295fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> .

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Chicken Embryo Spinal Cord Slice Culture Protocol

Culture fetta facilitare la manipolazione dello sviluppo embrionale di gene e perturbazioni farmacologiche. Tuttavia, le condizioni di coltura deve garantire che il normale sviluppo può procedere nell&#39;ambiente ridotto della fetta. Illustriamo un protocollo che facilita il normale sviluppo del midollo spinale procedere per almeno 24 ore.

Embrione di pollo midollo spinale Fetta protocollo Cultura

Slice cultures can facilitate the manipulation of  embryo development both pharmacologically and through gene manipulations. In  this reduced system, ...

chicken-embryo-spinal-cord-slice-culture-protocol

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

22.0K Views.  University College London. Culture fetta facilitare la manipolazione dello sviluppo embrionale di gene e perturbazioni farmacologiche. Tuttavia, le condizioni di coltura deve garantire che il normale sviluppo può procedere nell'ambiente ridotto della fetta. Illustriamo un protocollo che facilita il normale sviluppo del midollo spinale procedere per almeno 24 ore.

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Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissezione e la cultura di neuroni embrionali commissurali da midollo spinale

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Ricerca

Neuroscienze

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate a method to fabricate suction electrodes that are used to examine CPG activity, or fictive locomotion, in dissected rodent spinal cords. The rodent spinal cords are placed in artificial cerebrospinal fluid and the ventral roots are drawn into the suction electrode. The electrode is constructed by modifying a commercially available suction electrode. A heavier silver wire is used instead of the standard wire given by the commercially available electrode. The glass tip on the commercial electrode is replaced with a plastic tip for increased durability. We prepare hand drawn electrodes and electrodes made from specific sizes of tubing, allowing consistency and reproducibility. Data is collected using an amplifier and neurogram acquisition software. Recordings are performed on an air table within a Faraday cage to prevent mechanical and electrical interference, respectively.

A demonstration of the fabrication and use of an extracellular suction electrode used to measure electrophysiological recordings of neonatal rodent spinal cords in vitro

Spinal Cord Elettrofisiologia II: extracellulare fabbricazione di elettrodi di aspirazione

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

Human primary muscle cells cultured aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of a nerve component, cell differentiation is limited and motor neuron stimulation is missing1. These limitations hamper the in vitro study of many neuromuscular diseases in cultured muscle cells. Importantly, the experimental constraints of monolayered, cultured muscle cells can be overcome by functional innervation of myofibers with spinal cord explants in co-cultures.
Here, we show the different steps required to achieve an efficient, proper innervation of human primary muscle cells, leading to complete differentiation and fiber contraction according to the method developed by Askanas2. To do so, muscle cells are co-cultured with spinal cord explants of rat embryos at ED 13.5, with the dorsal root ganglia still attached to the spinal cord slices. After a few days, the muscle fibers start to contract and eventually become cross-striated through innervation by functional neurites projecting from the spinal cord explants that connecting to the muscle cells. This structure can be maintained for many months, simply by regular exchange of the culture medium.
The applications of this invaluable tool are numerous, as it represents a functional model for multidisciplinary analyses of human muscle development and innervation. In fact, a complete de novo neuromuscular junction installation occurs in a culture dish, allowing an easy measurement of many parameters at each step, in a fundamental and physiological context.
Just to cite a few examples, genomic and/or proteomic studies can be performed directly on the co-cultures. Furthermore, pre- and post-synaptic effects can be specifically and separately assessed at the neuromuscular junction, because both components come from different species, rat and human, respectively. The nerve-muscle co-culture can also be performed with human muscle cells isolated from patients suffering from muscle or neuromuscular diseases3, and thus can be used as a screening tool for candidate drugs. Finally, no special equipment but a regular BSL2 facility is needed to reproduce a functional motor unit in a culture dish. This method thus is valuable for both the muscle as well as the neuromuscular research communities for physiological and mechanistic studies of neuromuscular function, in a normal and disease context.

Cultured muscle cells are an inadequate model to recapitulate innervated muscle in vivo. A functional motor unit can be reproduced in vitro by innervation of differentiated human primary muscle cells using rat embryo spinal cord explants. This article describes how co-cultures of spinal cord explants and muscle cells are established.

Un gruppo motore funzionale nella piastra di coltura: Co-coltura degli espianti midollo spinale e le cellule muscolari

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability to reinitiate spinal neurogenesis. However, some anamniotes including the zebrafish Danio rerio exhibit both sensory and functional recovery even after complete transection of the spinal cord. The adult zebrafish is an established model organism for studying regeneration following spinal cord injury, with sensory and motor recovery by 6&#160;weeks post-injury. To take advantage of in vivo analysis of the regenerative process available in the transparent larval zebrafish as well as genetic tools not accessible in the adult, we use the larval zebrafish to study regeneration after spinal cord transection. Here we demonstrate a method for reproducibly and verifiably transecting the larval spinal cord. After transection, our data shows sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury (dpi), with the C-bend movement detectable by 3 dpi and resumption of free swimming by 5 dpi. Thus we propose the larval zebrafish as a companion tool to the adult zebrafish for the study of recovery after spinal cord injury.

After spinal transection, adult zebrafish have functional recovery by six weeks post-injury. To take advantage of larval transparency and faster recovery, we present a method for transecting the larval spinal cord. After transection, we observe sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury, and C-bend movement by 3 days post-injury.

Spinal Cord transezione nel larvale Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal degeneration. Lack of growth cone formation, regeneration, and loss of additional myelinated axonal projections within the spinal cord greatly limits neurological recovery following injury. To assess how central myelinated axons of the spinal cord respond to injury, we developed an ex vivo living spinal cord model utilizing transgenic mice that express yellow fluorescent protein in axons and a focal and highly reproducible laser-induced spinal cord injury to document the fate of axons and myelin (lipophilic fluorescent dye Nile Red) over time using two-photon excitation time-lapse microscopy. Dynamic processes such as acute axonal injury, axonal retraction, and myelin degeneration are best studied in real-time. However, the non-focal nature of contusion-based injuries and movement artifacts encountered during in vivo spinal cord imaging make differentiating primary and secondary axonal injury responses using high resolution microscopy challenging. The ex vivo spinal cord model described here mimics several aspects of clinically relevant contusion/compression-induced axonal pathologies including axonal swelling, spheroid formation, axonal transection, and peri-axonal swelling providing a useful model to study these dynamic processes in real-time. Major advantages of this model are excellent spatiotemporal resolution that allows differentiation between the primary insult that directly injures axons and secondary injury mechanisms; controlled infusion of reagents directly to the perfusate bathing the cord; precise alterations of the environmental milieu (e.g., calcium, sodium ions, known contributors to axonal injury, but near impossible to manipulate in vivo); and murine models also offer an advantage as they provide an opportunity to visualize and manipulate genetically identified cell populations and subcellular structures. Here, we describe how to isolate and image the living spinal cord from mice to capture dynamics of acute axonal injury.

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

Un<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Laser-indotta Spinal Cord Injury modello per valutare i meccanismi di degenerazione assonale in tempo reale

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Diffusion Imaging in the Rat Cervical Spinal Cord

Magnetic resonance imaging (MRI) is the state of the art approach for assessing the status of the spinal cord noninvasively, and can be used as a diagnostic and prognostic tool in cases of disease or injury. Diffusion weighted imaging (DWI), is sensitive to the thermal motion of water molecules and allows for inferences of tissue microstructure. This report describes a protocol to acquire and analyze DWI of the rat cervical spinal cord on a small-bore animal system. It demonstrates an imaging setup for the live anesthetized animal and recommends a DWI acquisition protocol for high-quality imaging, which includes stabilization of the cord and control of respiratory motion. Measurements with diffusion weighting along different directions and magnitudes (b-values) are used. Finally, several mathematical models of the resulting signal are used to derive maps of the diffusion processes within the spinal cord tissue that provide insight into the normal cord and can be used to monitor injury or disease processes noninvasively.

The goal of this protocol is to obtain high-quality diffusion weighted magnetic resonance imaging (DWI) of the rat spinal cord for noninvasive characterization of tissue microstructure. This protocol describes optimizations of the MRI sequence, radiofrequency coil, and analysis methods to enable DWI images free from artifacts.

Diffusion Imaging nel midollo spinale cervicale Rat

Magnetic resonance imaging (MRI) is the state of the art approach for assessing the status of the spinal cord noninvasively, and can be used as a ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on postnatal day 1-3. A mouse litter, usually 4-10 pups born from one breeding pair, is gathered for one experiment, and spinal cords are collected individually from each mouse after euthanasia with isoflurane. The spinal column is dissected out and then the spinal cord is released from the column. The spinal cords are then minced to increase the surface area of delivery for an enzymatic protease that allows for the neurons and other cells to be released from the tissue. Trituration is then used to release the cells into solution. This solution is subsequently fractionated in a density gradient to separate the various cells in solution, allowing for neurons to be isolated. Approximately 1-2.5 x 106 neurons can be isolated from one litter group. The neurons are then seeded onto wells coated with adhesive factors that allow for proper growth and maturation. The neurons take approximately 7 days to reach maturity in the growth and culture medium and can be used thereafter for treatment and analysis.

This study presents a technique for the isolation of neurons from WT neonatal mice. It requires the careful dissection of the spinal cord from the neonatal mouse, followed by the separation of neurons from the spinal cord tissue through mechanical and enzymatic cleavage.

Isolamento e cultura dei neuroni del midollo spinale da topi neonatali

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Imaging di attività neurale nella corteccia somatosensoriale primaria utilizzando Thy1-topi transgenici GCaMP6s

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a signal driving the rhythmic contraction of inspiratory muscles. Rhythmic neural activity generated in the pBC and carried to other neuronal pools to drive the musculature of breathing may be studied using various approaches, including en bloc nerve recordings and transverse slice recordings. However, previously published methods have not extensively described the brainstem-spinal cord dissection process in a transparent and reproducible manner for future studies. Here, we present a comprehensive overview of a method used to reproducibly cut rhythmically-active brainstem slices containing the necessary and sufficient neuronal circuitry for generating and transmitting inspiratory drive. This work builds upon previous brainstem-spinal cord electrophysiology protocols to enhance the likelihood of reliably obtaining viable and rhythmically-active slices for recording neuronal output from the pBC, hypoglossal premotor neurons (XII pMN), and hypoglossal motor neurons (XII MN). The work presented expands upon previous published methods by providing detailed, step-by-step illustrations of the dissection, from whole rat pup, to in vitro slice containing the XII rootlets.

This protocol both visually communicates the brainstem-spinal cord preparation and clarifies the preparation of brainstem transverse slices in a comprehensive step-by-step manner. It was designed to increase reproducibility and enhance the likelihood of obtaining viable, long lasting, rhythmically-active slices for recording neural output from the respiratory regions of the brainstem.

Preparazione di ritmicamente-attivo In Vitro neonatale del roditore del tronco cerebrale-spinale e fetta sottile

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a ...

Activity-based Training on a Treadmill with Spinal Cord Injured Wistar Rats

Spinal cord injury (SCI) results in lasting deficits that include both mobility and a multitude of autonomic-related dysfunctions. Locomotor training (LT) on a treadmill is widely used as a rehabilitation tool in the SCI population with many benefits and improvements to daily life. We utilize this method of activity-based task-specific training (ABT) in rodents after SCI to both elucidate the mechanisms behind such improvements and to enhance and improve upon existing clinical rehabilitation protocols. Our current goal is to determine the mechanisms underlying ABT-induced improvements in urinary, bowel, and sexual function in SCI rats after a moderate to severe level of contusion. After securing each individual animal in a custom-made adjustable vest, they are secured to a versatile body weight support mechanism, lowered to a modified three-lane treadmill and assisted in step-training for 58 minutes, once a day for 10 weeks. This setup allows for the training of both quadrupedal and forelimb-only animals, alongside two different non-trained groups. Quadrupedal-trained animals with body weight support are aided by a technician present to assist in stepping with proper hind limb placement as necessary, while forelimb-only trained animals are raised at the caudal end to ensure no hind limb contact with the treadmill and no weight-bearing. One non-trained SCI group of animals is placed in a harness and rests next to the treadmill, while the other control SCI group remains in its home cage in the training room nearby. This paradigm allows for the training of multiple SCI animals at once, thus making it more time-efficient in addition to ensuring that our pre-clinical animal model mimics the clinical representation as close as possible, particularly with respect to the body weight support with manual assistance.

This protocol demonstrates our model of activity-based locomotor treadmill training for rats with spinal cord injury (SCI). Included is both quadrupedal and forelimb-only groups, in addition to two distinct types of non-trained control groups. Investigators are able to assess training effects on SCI rats using this protocol.

Corsi di formazione basati su attività su un tapis roulant con midollo spinale feriti ratti Wistar

Spinal cord injury (SCI) results in lasting deficits that include both mobility and a multitude of autonomic-related dysfunctions. Locomotor training (LT) ...