L'obiettivo generale di questa procedura è presentare un approccio sperimentale ottimizzato per isolare i tessuti embrionali dalla quaglia e dagli embrioni di pollo. Con questa tecnica, otteniamo tessuti embrionali puri che possono essere utilizzati negli studi di espressione genica e nei test funzionali. I tessuti provenienti da embrioni di quaglia e pollo sono isolati dalla microchirurgia e sottoposti a digestione enzimatica in vitro preservandone le proprietà biologiche.
Dopo l'isolamento, i tessuti conservati tridimensionali possono essere utilizzati per l'analisi dei modelli di espressione genica topografica ad alta risoluzione. Questo approccio è particolarmente utile per dettagliare l'espressione genica in situ in territori embrionali altrimenti inaccessibili con metodi convenzionali. Inoltre, gli approcci di analisi del trascritoma possono anche essere applicati in tessuti isolati senza richiedere marcatori genetici, fornendo al contempo un'analisi omica ad alta produttività specifica dei tessuti.
In alternativa, i tessuti isolati di entrambe le specie possono essere associati in un saggio organotipico in vitro per 48 ore. Questo approccio consente di studiare le interazioni dei tessuti, poiché le cellule di quaglia e pollo possono essere discriminate da caratteristiche nucleari distinte e marcatori molecolari. La capacità dei tessuti di coltura di formare organi può essere ulteriormente testata mediante saggio ovo.
Questo metodo è quindi uno strumento utile per studiare complesse interazioni tissutali in processi di sviluppo con modifiche uciali altamente dinamiche e può anche aiutare a rivelare il potenziale di specifici territori embrionali alla formazione di organi. Ad esempio, nel presente documento viene descritta la formazione di timo chimerico di quaglia-pollo da tessuti embrionali isolati. In primo luogo, l'endoderma del terzo e quarto sacchetto faringeo, la potenziale rudimento timica è isolata dalla regione faringea degli embrioni di quaglia con tre giorni di sviluppo.
Quindi, questo tessuto è associato a un mesenchima in grado di sostenere il suo sviluppo, il mesoderma somatopleura. Infine, l'associazione eterospecifica dei tessuti viene coltivata in vitro e in ovo per formare un timo chimerico. Eseguire tutte le procedure di manipolazione delle uova in condizioni sterili utilizzando una cappa orizzontale a flusso laminare e strumenti e materiali sterilizzati.
Le uova di quaglia fecondate sono state incubate con la camera d'aria rivolta verso l'alto. Per iniziare, rimuovere le uova di quaglia dall'incubatrice. Preparare una grande ciotola di vetro borosilicato piena di PBS freddo.
Con forbici curve, toccare e tagliare un foro circolare nel guscio di un uovo di quaglia con tre giorni di incubazione. Rendere il foro sul lato opposto dell'uovo smussato e trasferire il tuorlo nella ciotola con PBS freddo. Rimuovere l'embrione dal tuorlo tagliando esternamente la membrana vitellina ai vasi extraembrionici.
Con l'aiuto di forcep sottili, trasferire l'embrione in una piccola ciotola piena di PBS freddo, quindi spostare l'embrione in una piastra di Petri con base nera con uno skimmer. Rimuovere la regione faringea contenente il terzo e il quarto sacchetti faringei come descritto nella precedente legatura di Jove SPA. Quindi, trasferire la terza e la quarta regione dell'arco faringeo in un bicchiere riempito con pancreatina fredda e incubare per un'ora, sul ghiaccio, per la digestione enzimatica.
Si noti che il periodo di incubazione della digestione enzimatica dipende dallo stadio di sviluppo. Posizionare la lapide di vetro al microscopio stereo e isolare l'endoderma dalla terza e dalla quarta regione dell'arco faringeo, utilizzando due micro-bisturi in un supporto. In primo luogo la regione faringea con il lato dorsale verso l'alto, mostrando internamente l'endoderma e l'ectoderma nella superficie esterna.
Osserva l'ectoderma, l'endoderma, il mesenchima, il tubo cardiaco e la porzione ventrale del tubo neurale. Rimuovere il tubo neurale e il mesoderma attaccato alla superficie dorsale dell'endoderma faringeo. Osserva l'endoderma della faringe, il quarto e il terzo sacchetto faringeo e il tubo cardiaco.
Con il lato dorsale verso l'alto, staccare con cura e rimuovere il mesenchima tra gli archi faringei ed esporre i sacchetti faringei. Eseguire questa procedura nell'altro lato della regione faringea. Rimuovere il mesenchima attaccato alla parte più posteriore dell'endoderma e osservare la quarta busta faringea.
Con il lato posteriore verso l'alto, osservare sia la quarta sacchetti faringea sinistra che destra. Continuare rimuovendo il mesenchima attaccato alla parte più posteriore dell'endoderma e alla seconda busta. Rimuovere il tubo cardiaco e il mesenchima che circonda i sacchetti interni.
Con il lato ventrale verso l'alto, osserva la faringe endoderma e il lato destro del secondo arco faringeo. In questa fase, l'endoderma del rudimento tiroideo dovrebbe essere visibile. Staccare l'ectoderma del secondo e del terzo arco faringeo e rimuovere con cura il mesenchima degli archi.
Osservare la rimozione del mesenchima del secondo arco faringeo sul lato destro. Si noti la posizione del quarto e terzo sacchetto e rudimento tiroideo. Rimuovere i resti alle cellule mesenchimali attaccate ai sacchetti faringei.
Osservare la terza e la quarta busta del lato destro e la quarta busta dal lato sinistro. Ripetere il distacco del mesenchima del lato sinistro. Osserva ora la terza busta del lato sinistro.
Osservare il distacco del mesenchima del secondo arco sul lato sinistro. Si noti che tutte le superfici e le soluzioni devono essere mantenute fredde durante questa procedura. Passare a una nuova soluzione di pancreatina fredda e piatto in caso di tempo necessario per sezionare i tessuti.
Infine, fai un taglio trasversale tra il secondo e il terzo sacchetto faringeo per rimuovere i secondi sacchetti e il rudimento tiroideo. A questo punto, l'endoderma isolato è composto dalla terza e quarta sacchettia e dalla punta posteriore della faringe. Rimuovere i resti staccati mesenchima con l'aiuto di due micro-bisturi.
Trasferire l'endoderma isolato in un piatto di vetro riempito con siero bovino fetale freddo e tenerlo sul ghiaccio durante la preparazione del saggio in vitro. Le uova sono state poste in posizione orizzontale e il lato superiore contrassegnato per l'uso di un carbone. Per iniziare, rimuovere le uova dall'incubatrice.
Con una forbice curva, aprire un piccolo foro nel guscio, inserire un ago e aspirare due millilitri di albumina con una siringa da 10 millilitri. Aprire un foro circolare nella regione marcata del guscio e tagliare la membrana vitellina esternamente ai vasi embrionali extra tenendo l'embrione con force sottili. Al microscopio stereo, posizionare l'embrione in una piastra di Petri con base nera contenente PBS freddo.
Usa quattro spilli per insetti per tenere l'embrione sul fondo del piatto. Posizionare i perni nella regione extraembrionica formando una forma quadrata. Eseguire due tagli tra i somiti 19 e 24 trasversalmente all'asse embrionale e attraversare l'embrione.
Rilasciare questa sezione tagliando i bordi embrionali marginali. Osservare la piastra laterale, il tubo neurale e le somiti. Aspirare e trasferire i tessuti in un piatto di vetro riempito con pancreatina fredda.
Incubare per 30 minuti sul ghiaccio per la digestione enzimatica. Al microscopio stereo, isolare il mesoderma dai tessuti circostanti usando due micro-bisturi nei supporti. Osserva il mesoderma somatopleura, lo splanchnopleura, il tubo neurale e l'ectoderma.
In primo luogo, rimuovere l'ectoderma sulla superficie. Osservare il mesoderma somatopleura dissociato dall'ectoderma. Quindi, staccare con cura la splancnopleura posizionata ventralmente dal somatopleura.
Osservare il mesoderma laterale destro del somatopleura. Rilascialo tagliandolo in un movimento parallelo al tubo neurale. Si noti che tutte le superfici e le soluzioni devono essere mantenute fredde durante questa procedura.
Passare a una nuova soluzione di pancreatina fredda e piatto in caso di tempo necessario per sezionare i tessuti. Osservare il mesoderma laterale sinistro del somatopleura, dei somiti, del tubo neurale e dell'ectoderma. Ripetere il rilascio di mesoderma di questo lato.
Fai movimenti lenti con il micro-bisturi. Le proteine della matrice extracellulare esposte siedono attraverso tessuti e strumenti, prevenendo i movimenti dei fluidi. Tagliare con cura il somatopleura in un movimento parallelo al tubo neurale.
Trasferire il mesoderma isolato in un piatto di vetro riempito con siero bovino fetale freddo e tenerlo sul ghiaccio durante la preparazione del saggio in vitro. Mettere una griglia metallica a maglie fini in una piastra di Petri e riempire con mezzo di coltura. Rimuovere i liquidi eccessivi per livellare la superficie media con la parte superiore della griglia.
Con l'aiuto di pinza sottile, immergere un filtro a membrana nel mezzo di coltura e posizionarlo con cura sulla parte superiore della griglia per avere una superficie a contatto con lei. Al microscopio stereo, trasferire l'endoderma isolato dalla piastra di vetro al filtro a membrana scivolando delicatamente con l'aiuto di spatole e forcep sottili. Ripetere questa procedura per il mesoderma isolato.
Con l'aiuto di un micro-bisturi, mescolare i tessuti per massimizzare la sua associazione. Posizionare con cura i tessuti associati in un'incubatrice umidificata a 37 gradi con 5%CO2 per 48 ore. Dopo il periodo di incubazione, innestare i tessuti di coltura sulla membrana di tipo coriolano e consentirgli di svilupparsi in ovale per ulteriori 10 giorni per completare la formazione di organi come descritto in precedenza.
Ecco il metodo reticolare che permette l'isolamento dei tessuti embrionali aviari da utilizzare in distinti approcci sperimentali. Ad esempio, l'espressione di geni noti per essere coinvolti nella formazione dei sacchetti faringei è stata anche valutata un endoderma isolato contenente la seconda, terza e quarta sacchetti faringei dagli embrioni di pollo al terzo giorno e mezzo embrionale per ibridazione in situ montata intera. L'espressione di Sonic Hedgehog è stata rilevata nell'endoderma della faringe centrale ed è stata esclusa dai sacchetti, mentre BMP7 è stata espressa nell'endoderma della seconda e della terza busta faringea ed esclusa dalla faringe centrale e dalla quarta busta faringea.
I tessuti isolati possono anche essere vitro specificamente associati in vitro per 48 ore, innesto sulla membrana di tipo coriolano e permesso di svilupparsi per ulteriori 10 giorni. Le espianto possono essere analizzate mediante istologia convenzionale e immunoistochimica. Alcuni risultati rappresentativi dell'associazione dell'endoderma di quaglia dal terzo e quarto sacchetto faringeo con mesoderma di somatopleura di pollo sono i seguenti-Innesti hanno mostrato un timo chimerico completamente formato con cellule epiteliali timiche derivate dalla quaglia positive per qcpn e cellule linfoidi di pollo.
Inoltre, l'epitelio timomico positivo alla citocheratina mostrò caratteristiche morfologiche normali, mostrando una tipica architettura reticolare. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare le quaglie e i tessuti embrionali di pollo che possono essere utilizzati negli studi di espressione genica e formando organi chimerici possono anche aiutare a decifrare la complessità della genetica degli organi.
