La piccola Rho GTPasi è una proteina di una superfamiglia con diverse funzioni cellulari. Ad esempio, queste proteine sono coinvolte nella regolazione del destino cellulare, della risposta cellulare a uno stress, della motilità cellulare e del ciclo cellulare. L'attività di una piccola proteina Rho GTPasi è regolata dalla modifica post-traslazionele.
Queste modifiche sono coinvolte in una stretta regolamentazione della loro attività. Ad esempio, la prenilazione proteica e il legame GTP sono la più importante modifica post-traslazione di queste proteine. Il mio laboratorio ha recentemente modificato e sviluppato un metodo semplice per indagare la modifica post-traslazione di queste proteine della superfamiglia.
A questo scopo, abbiamo usato 251 linee cellulari di glioblastoma, e le abbiamo mirate con simvastatina, e misurato la modifica post-traslazione di queste proteine. Il metodo prevede il frazionamento subcellulare e la proteina legata alla GTP a questa superfamiglia proteica. A questo scopo, abbiamo usato la localizzazione di RhoA, e GTP legata a RhoA per misurare la modifica post-traslizionale di questa proteina.
Rimuovere le cellule dall'incubatore di 37 gradi. Guarda le cellule al microscopio per confermare la confluenza. Le cellule devono essere dal 70 all'80% confluenti.
Lavare le cellule una volta con PBS freddo. Aggiungere cinque millilitri di EDTA e riposizionare le cellule nell'incubatore di 37 gradi per cinque minuti. Dopo cinque minuti di incubazione, raccogliere l'EDTA con le cellule in un tubo da 15 mil.
Posizionare il tubo in una ghiacciaia e procedere verso la centrifuga. Impostare la centrifuga a 1500 g a quattro gradi e ruotare le cellule per cinque minuti. Dopo lo spin, rimuovere il supernato e aggiungere un millilitro di PBS freddo.
Triturare bene le cellule. Trasferire la miscela cellulare in un nuovo tubo etichettato da 1,5 millilitri. Dopo il trasferimento, procedere alla centrifuga.
Impostare la centrifuga su 1500g a quattro gradi e ruotare le cellule per cinque minuti. Controllare le dimensioni del pellet. Metti i campioni sul ghiaccio.
Scartare completamente il supernate, senza disturbare il pellet. Aggiungere buffer uno. Mescolare bene pipettando su e giù.
Procedere alla sonicazione. Impostare il sonicatore per cinque cicli, cinque secondi ciascuno e ripetere tre volte. La sonicazione dovrebbe procedere sul ghiaccio, ma non è mostrata nel video, a scopo illustrativo.
Procedere all'ultracentrifugo. Utilizzare un ultracentrifugo per separare gli omogeneati cellulari in frazioni citoplasmatica e di membrana. Impostare la centrifuga su 100.000g per 35 minuti, a quattro gradi.
Controllare le dimensioni del pellet. Separare il supernate. Raccogliere completamente il supernate, facendo attenzione a non disturbare il pellet.
Il supernato è la frazione citosolica. Posizionare il supernate in un tubo appena etichettato. Aggiungere buffer due al pellet.
Questa è la frazione di membrana. Mescolare bene pipettando su e giù. Procedere alla determinazione delle proteine e alla preparazione del campione di macchie occidentali.
Caricare i campioni su un SDS-PAGE utilizzando un gel del 15%. Confermare il trasferimento proteico visualizzando il marcatore di peso molecolare o usando una macchia di Ponceau. Aggiungere anticorpi primari per l'analisi immunoblotting.
Usiamo Rac1/2/3, Cdc42 e RhoA. Portare i piatti di coltura fuori dall'incubatrice. Guarda le cellule al microscopio per confermare la confluenza.
Le celle devono essere confluenti dal 70 all'80%. Metti il piatto di coltura sul ghiaccio. Aspirare il supporto e lavare le celle con pH PBS freddo a 7,2.
Aspirare il PBS. Inclinare le piastre sul ghiaccio per un minuto in più per rimuovere tutti i resti di PBS. Il PBS residuo influisce negativamente su questo saggio.
Lisciare le cellule in un volume appropriato di tampone di lisi ghiacciata contenente proteasi e inibitori della fosfatasi. Raccogli il lysate cellulare con il raschietto cellulare. Inclinare la piastra di coltura per questa tecnica.
Trasferire il litolato in un tubo criometro etichettato e ghiacciato e tenere sul ghiaccio. Mescolare accuratamente utilizzando un vortice. Conservare 10 microlitri del lysate per un saggio proteico.
Snap congelare il lisato cellulare rimanente in azoto liquido. Trasferire i criotubi congelati a scatto in un congelatore meno 80. Conservare questi campioni.
Si noti che i campioni non devono essere conservati più di 14 giorni. Preparare i lire cellulari dalle altre piastre di coltura ripetendo i passaggi da uno a otto, uno per uno. Lavorare rapidamente e non lasciare mai i campioni sul ghiaccio per più di 10 minuti.
Non maneggiare mai tutte le piastre di coltura contemporaneamente. Misurare la concentrazione proteica. Calcolare il volume del tampone dilisi per normalizzare la concentrazione di proteine tra i campioni.
Nota: un milligrammo per millilitro è di solito il migliore, tuttavia, 0,3-due milligrammi per millilitro possono essere rilevabili. Preparare un controllo vuoto aggiungendo 60 microlitri di tampone di lysis e 60 microlitri di buffer di legame a un microtubo. Preparare un controllo positivo aggiungendo 12 microlitri di proteina di controllo Rho, 48 microlitri di tampone di lysis e 60 microlitri di tampone legante.
Tossire il piatto di affinità Rho dalla sua borsa e posizionare sul ghiaccio. Sciogliere la polvere nei pozzi con 100 microlitri di acqua distillata ghiacciata. Tieni il piatto sul ghiaccio.
Scongelare la cella congelata a scatto lysates in un bagno d'acqua impostato a 25 gradi Celsius. Aggiungere il volume calcolato del tampone di lysis ghiacciata a ciascun campione per normalizzare la concentrazione proteica. Trasferire 60 microlitri di campioni di ghiaccio freddo normalizzati su microtubi e aggiungere 60 microlitri di tampone di legame.
Mescolare accuratamente e tenere sul ghiaccio. Rimuovere completamente l'acqua dalla micropiastra con un vigoroso sfarfallio, seguita da cinque o sette rubinetti duri su un tappetino da laboratorio. Aggiungere 50 microlitri dei campioni normalizzati, un controllo vuoto e un controllo positivo ai pozzi in duplicato.
Posizionare la piastra su uno shaker orbitale per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Nota: la velocità dello shaker deve essere impostata su 300 giri/min. Cancellare i campioni dalla piastra svolazzando e lavare due volte con 200 microlitri di tampone di lavaggio a temperatura ambiente.
Rimuovere vigorosamente il tampone di lavaggio dai pozzi dopo ogni lavaggio svolazzando, seguito da maschiatura e mantenere la piastra sulla panca a temperatura ambiente. Aggiungere 200 microlitri di tampone che presenta l'antigene a temperatura ambiente in ogni pozzo e incubare a temperatura ambiente per due minuti. Spremere la soluzione dai pozzi e lavare tre volte con 200 microlitri di tampone di lavaggio a temperatura ambiente.
Aggiungere 50 microlitri di anticorpo primario anti-RhoA appena preparato a 250 ad ogni pozzo. Posizionare la piastra su uno shaker orbitale per 45 minuti a 300 giri/min, impostato su 25 gradi Celsius. Spremere la soluzione dai pozzi e lavare tre volte con 200 microlitri di tampone di lavaggio a temperatura ambiente.
Aggiungere 50 microlitri di anticorpo secondario anti-RhoA appena preparato a 250 ad ogni pozzo. Posizionare la piastra sopra uno shaker orbitale per 45 minuti, a 300 giri/min, impostato su 25 gradi Celsius. Preparare il reagente di rilevamento HRP mescolando volumi uguali di Reagente A e Reagente B.Flick fuori dalla soluzione da ogni pozzo, e lavare tre volte con 200 microlitri di tampone di lavaggio a temperatura ambiente.
Aggiungere 50 microlitri di reagente di rilevamento HRP appena preparato ad ogni pozzo. Leggere il segnale di luminescenza entro tre o cinque minuti per ottenere un segnale massimo. Analizzare i risultati utilizzando un pacchetto software appropriato.
I nostri risultati mostrano che la simvastatina ha diminuito la localizzazione di RhoA nella frazione di membrana. Ciò che è aumentato è l'accumulo nella frazione citosolica. È interessante notare che la simvastatina ha aumentato gtp legata al RhoA.Perché?
Ci aspettiamo che la simvastatina diminuisca questa attività. È molto importante che misurano sia la localizzazione subcellulare di questa proteina, sia la misurano il legame GTP con questa proteina per avere una valutazione finale dell'attività delle piccole Rho GTPasi.
