Name: novel method of plasmid dna delivery to mouse bladder urothelium by electroporation
Uploaded: 2018-05-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
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Ringraziamo il Professor Bin Chen, Dr. Yue Zhang e Kendy Hoang per aiuto con configurazione del sistema di elettroporazione. Quest'opera è stata sostenuta da sovvenzioni dal gruppo beneficio del cancro di Santa Cruz e NIH di Z.A.W.

Tutte le procedure qui descritte sono state eseguite in conformità con le linee guida e regolamenti istituzionali Animal Care e uso Committee (IACUC) della University of California Santa Cruz.
1. plasmide e preparazione di strumenti
<ol><li>Per ogni vescica a transfect, preparare almeno 20 µ l di plasmide del DNA (1 µ g / µ l).</li>
	<li>Aggiungere 1 µ l di Trypan Blue il 20 µ l di soluzione di plasmide in una microcentrifuga da 1,5 mL. Pipetta per mescolare bene.</li>
	<li>Autoclave tutti chirurgico strumenti e sterilizzare l'area di lavoro con etanolo al 70%. Spruzzare frequentemente gli strumenti chirurgici e guanti con etanolo al 70% o utilizzare uno sterilizzatore del branello di vetro quando si eseguono le seguenti operazioni per mantenere condizioni di sterilità.</li>
</ol>2. anestetizzante animale
<ol><li>Utilizzare un sistema di anestesia top tavolo per anestetizzare l'animale con isoflurano. Girare sul serbatoio O2 e regolare il flussometro ossigeno a 1 L/min.</li>
	<li>Posto un topo C57BL/6J femmina adulto nella camera di induzione. Accendere e regolare il vaporizzatore di isoflurane al 3% per induzione. Il mouse dovrebbe essere in anestesia entro 2 min amministra buprenorfina analgesico (0,1 mg/kg) per via sottocutanea dopo la rimozione del mouse dalla camera di induzione per preemptive analgesia. Nota: Nel presente protocollo, i topi femminili sono usati, come sono più facili da lavorare con durante la cateterizzazione di uretra. Il protocollo funziona anche per topi maschi, ma prestare particolare attenzione è necessaria quando si esegue il passaggio 3.</li>
	<li>Applicare unguento oftalmico agli occhi dell'animale per prevenire la secchezza. Posizionare il mouse anestetizzato rivolto verso l'alto su un rilievo di riscaldamento con il suo naso nel cono di naso. Girare l'interruttore del circuito di aria per lasciare isoflurano andare attraverso il cono di naso.</li>
	<li>Trattenere la testa e il naso a cono con nastro adesivo. Regolare il vaporizzatore di isoflurane al 2% per la manutenzione.</li>
	<li>Trattenere le membra con nastro adesivo. Eseguire test toe-pizzico per assicurarsi che l'animale è in anestesia profonda e quindi radere la zona addominale.</li>
</ol>3. urina svuotamento e lavaggio della vescica
<ol><li>Applicare il lubrificante al catetere (24G, 2,11 cm di lunghezza, diametro esterno di 0,045 cm) e garantire che la sua superficie esterna è completamente coperto.</li>
	<li>Inserire il catetere nell'uretra apertura e spingere lentamente fino a raggiungere la vescica, momento in cui l'urina dovrebbe defluire attraverso il catetere. Premere delicatamente l'addome per aiutare lo svuotamento dell'urina.<ol>
<li>Verifica se il catetere è inserito correttamente nella vescica osservando automatico urina fuori-flusso. Evitare piercing la parete della vescica e uretra e applicare il lubrificante più volte se necessario.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Scartare l'urina con una pipetta in un becher da rifiuti.</li>
	<li>Pipettare 80 µ l di tampone fosfato salino (PBS) nell'estremità esterna del catetere, con l'altra estremità ancora nella vescica. Con attenzione è possibile collegare una siringa da 1 mL al catetere. Spingere delicatamente la siringa per iniettare il PBS nella vescica. Lasciare alcuni PBS del catetere per evitare di creare bolle d'aria nella vescica.</li>
	<li>Rimuovere la siringa. Aspettare per la PBS drenare dalla vescica. Premere delicatamente l'addome per evacuare PBS.</li>
	<li>Scartare il PBS del catetere con una pipetta nel contenitore dei rifiuti.</li>
	<li>Ripetere PBS lavaggio (passaggi 3.4-3.6) per altre due volte. Nota: È fondamentale lavorare delicatamente durante queste fasi di lavaggio. Sangue nel catetere o il fallimento di automatico fuori-fluire del liquido indica in genere l'uretra è trafitto. È anche importante evitare di introdurre bolle d'aria, come essi potranno diminuire l'efficienza di elettroporazione.</li>
</ol>4. plasmide consegna
<ol><li>Applicare etanolo al 70% all'addome del mouse e utilizzare un bisturi per praticare un'incisione verticale di 1 cm per aprire la pelle dell'addome sopra la vescica.</li>
	<li>Pipettare almeno 20 µ l di plasmide plus soluzione tripan blu in estremità esterna del catetere e collegare la siringa.</li>
	<li>Iniettare la soluzione di plasmide nella vescica. Se la vescica diventa blu, l'iniezione è successo. Lasciare un po' di liquido del catetere per evitare di creare bolle d'aria nella vescica.</li>
	<li>Afferrare l'orifizio uretrale esterno con pinzette e quindi rimuovere il catetere e la siringa. Utilizzare una stringa per stringere l'orifizio uretra esterno. Fare due anelli con la stringa e poi legare con due nodi. Nota: Serraggio dell'uretrale è importante per impedire il riflusso del liquido del plasmide.</li>
	<li>Accendere il generatore di elettroporazione con i seguenti parametri: 33V, 50 ms tempo di lavoro e 950 ms tempo di intervallo.</li>
	<li>Tenere la vescica con una pinzetta e pizzicare la vescica con due elettrodi. Spingere il pedale per eseguire l'elettroporazione. Nota: Gli impulsi elettrici sono impostati a verificarsi 5 volte con brevi intervalli di tempo dopo ogni pressione del pedale. Il mouse può contrarsi in questo processo. Spingendo il pedale più di una volta può aumentare l'efficienza di consegna, ma anche molti impulsi elettrici possono danneggiare l'integrità del tessuto dell'urotelio.<ol>
<li>Evitare il contatto tra le pinzette e gli elettrodi, come questo genererà una scintilla.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. il recupero
<ol><li>Suturare l'apertura addominale e pelle con sutura chirurgica sterile e clip. Applicare iodio sulla ferita.</li>
	<li>Rimuovere l'animale dal sistema isoflurano. Amministrare la buprenorfina analgesico (0,1 mg/kg) per via sottocutanea per alleviare il dolore post-operatorio.</li>
	<li>Tenere l'animale il termoforo e tornare alla gabbia a casa dopo il recupero completo. Controllare l'animale almeno una volta al giorno per la normale mobilità, abbeveraggio e alimentazione comportamenti e senza segni di infezione, fino a quando l'incisione è guarito e quindi rimuovere le clip. Se l'animale Visualizza il sintomo di dolore come ridotto toelettatura, aumentata aggressività e vocalizzazione, somministrare iniezioni successive di buprenorfina analgesico.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Sharpless, N. E., Depinho, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mighty+mouse:+genetically+engineered+mouse+models+in+cancer+drug+development.">The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development.</a> Nat Rev Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).</li><li>Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. 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L., Golberg, A., Sersa, G., Kotnik, T., Miklavcic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation-based+technologies+for+medicine:+principles,+applications,+and+challenges.">Electroporation-based technologies for medicine: principles, applications, and challenges.</a> Annu Rev Biomed Eng. 16, 295-320 (2014).</li><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).</li><li>Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+vivo+electroporation+of+the+postnatal+rodent+forebrain.">Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain.</a> PLoS One. 3 (4), e1883 (2008).</li><li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system.">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nat Protoc. 1 (3), 1552-1558 (2006).</li><li>Molotkov, D. A., Yukin, A. Y., Afzalov, R. A., Khiroug, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+to+postnatal+rat+brain+by+non-ventricular+plasmid+injection+and+electroporation.">Gene delivery to postnatal rat brain by non-ventricular plasmid injection and electroporation.</a> J Vis Exp. (43), (2010).</li><li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E15+mouse+embryos.">In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos.</a> J Vis Exp. (6), e239 (2007).</li><li>Follenzi, A., Santambrogio, L., Annoni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+responses+to+lentiviral+vectors.">Immune responses to lentiviral vectors.</a> Curr Gene Ther. 7 (5), 306-315 (2007).</li></ol>

Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.

Elettroporazione migliora la permeabilità della membrana cellulare ed è una potente tecnologia per gene electrotransfer16. Consegna del gene in roditori vivente mediante elettroporazione è stato frequentemente utilizzato in neurobiologia campi17,18,19,20,21. Le sue potenziali applicazioni in molti altri organi non sono stati esplorat...

Modelli murini geneticamente (GEMM) hanno giocato un ruolo essenziale ad ampliare la nostra conoscenza circa lo sviluppo animale, gene funzioni in vivoe meccanismi di malattia progressione1,2. Germline GEMM sono tradizionalmente sviluppato in due modi. Il primo è la creazione di topi transgenici di pronuclei iniezione del plasmide DNA seguito da trapianto di zigoti in femmine pseudopregnant. L'altra è la generazione di topi knock-out/knock-in di ricombinazione omologa in cellule staminali embrionali e lo sviluppo delle chimere. Knockout condizionale di geni nel tipo specifico dei tessuti o cellule di interesse comporta l'allevamento degli alleli geneticamente ingegnerizzati con siti Cre e flox per più generazioni. L'intero processo può essere costoso e richiede tempo, soprattutto se l'obiettivo è di indirizzare i geni multipli del tessuto-specifico. Recentemente, la modifica del gene tecnologie quali cluster regolarmente intercapedine ripetizioni brevi palindromi (CRISPR) sono state applicate a parecchi organi dei topi per indurre le alterazioni genetiche tessuto-specifico per il cancro autoctono modellazione3, 4,5,6,7 o mutazioni della malattia corretta in situ8,9. In questi studi, la consegna dei vettori gRNA solitamente è stata realizzata attraverso l'infezione adenoviral o lentivirale dell'organo o idrodinamico vena caudale iniezione. La relativa facilità di consegna dei componenti CRISPR il polmone ed il fegato ha notevolmente migliorato la comodità e l'efficienza di cancro in questi organi rispetto ai tradizionali modelli del mouse Cre-Lox basata di modellazione.
Il urothelium della vescica è dove la maggior parte dei tumori della vescica hanno origine. La consegna dei vettori di DNA per il urothelium della vescica per la terapia del gene o modellazione è ostacolata da uno strato di glicosaminoglicani sulla superficie apicale urothelial, che agisce come una barriera per l'aderenza di virus infettivi10,11. Diversi agenti di pretrattamento come Syn3 e dodecil-β-d-maltoside sono stati utilizzati per interrompere questa barriera e usufruire dell'adenovirus infezione efficienza12,13,14. Se il virus adeno-associato (AAVs) efficacemente può infettare la vescica non è stata segnalata. Nel complesso, un metodo di consegna di base non-virale sarebbe auspicabile. Qui, descriviamo un nuovo metodo sviluppato in laboratorio per consegna efficiente DNA del plasmide dell'urotelio del mouse tramite cateterizzazione dell'uretra e l'elettroporazione. Perché il nostro approccio non comporta pretrattamento chimico di strato di glicosaminoglicani o produzione di virus, significativamente semplifica la consegna dei plasmidi di DNA nell'urotelio vescica del mouse e dovrebbe facilitare vari studi in vivo di malattie di vescica.

<table><tbody><tr><td>BD 1mL TB Syringe</td><td>Fisher</td><td>148232E</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td>Sigma</td><td>B9275-50MG</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Tweezers</td><td>Roboz Surgical Instr</td><td>RS-5005</td><td>Treat with 70% ethanol before surgical use</td></tr><tr><td>ECM830 SQ Wave Electroporator</td><td>Harvard Apparatus</td><td>450052</td><td></td></tr><tr><td>Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-841-21</td><td>24G, 2.11 cm length, 0.045 cm outer diameter</td></tr><tr><td>Extra Fine Micro Dissecting Scissors</td><td>Roboz Surgical Instr</td><td>RS-5135</td><td>Treat with 70% ethanol before surgical use</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Vet one</td><td>501017</td><td></td></tr><tr><td>K&amp;amp;H Heated Resting Mat for Small Animals, 9 By 12 Inches</td><td>Amazon</td><td>n/a</td><td>Cover the heat mat with paper towels</td></tr><tr><td>Ophthalmic ointment</td><td>Fisher</td><td>NC0849514</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH7.4</td><td>Life Technologies</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>Pipet tips 200 &amp;micro;L</td><td>USA Scientific</td><td>1111-0206</td><td></td></tr><tr><td>Pipet Tips, Universal Fit; 0.1 to 10 &amp;micro;L</td><td>Fisher</td><td>02707438(CS)</td><td></td></tr><tr><td>PIPETMAN NEO P2</td><td>Gilson</td><td>F144561</td><td></td></tr><tr><td>PIPETMAN NEO P200N</td><td>Gilson</td><td>F144565</td><td></td></tr><tr><td>plasmid CAG-GFP</td><td>Addgene</td><td>16664</td><td></td></tr><tr><td>Platinum tweezertrode 5 mm</td><td>Harvard Apparatus</td><td>450489</td><td>5 mm diameter</td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Roboz Surgical Instr</td><td>RS-5880</td><td>Treat with 70% ethanol before surgical use</td></tr><tr><td>String cord</td><td>Amazon</td><td>n/a</td><td>Mandala Crafts 150D 210D 0.8mm 1mm leather sewing stitching flat waxed thread string cord</td></tr><tr><td>Tape, Scotch</td><td>Fisher</td><td>19047257</td><td></td></tr><tr><td>Therio-gel Veterinary Lubricant</td><td>PBS animal health</td><td>353-736</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain</td><td>Life Technologies</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>V-1 Table top system anesthesia</td><td>VetEquip</td><td>901806</td><td></td></tr><tr><td>Vicryl violet suture 18&quot; FS-2 cutting 5-0</td><td>Fisher</td><td>NC0578475</td><td></td></tr><tr><td>Walgreens Povidone Iodine 10%</td><td>Walgreens</td><td>953982</td><td></td></tr><tr><td>Wound clip</td><td>Fisher</td><td>018045</td><td></td></tr><tr><td>Wound clip applier</td><td>Fisher</td><td>01804</td><td></td></tr></tbody></table>

novel method of plasmid dna delivery to mouse bladder urothelium by electroporation

Modelli murini geneticamente (GEMM) sono estremamente utili nel rivelare nuove conoscenze biologiche sui meccanismi di iniziazione e progressione delle malattie umane come il cancro. Topi knock-out condizionale e transgenici sono stati usati frequentemente per la sovraespressione genica o tipi di ablazione in specifici tessuti o cellule in vivo. Tuttavia, la generazione di modelli murini di germline possono essere lunghe e costose. Gli avanzamenti recenti nel gene editing tecnologie e la fattibilità di erogare plasmidi di DNA tramite l'infezione virale hanno permesso la rapida generazione di modelli di germline non autoctono del topo del cancro per parecchi organi. La vescica è un organo che è stato difficile per vettori virali accedere, a causa della presenza di uno strato di glicosaminoglicani che copre l'urotelio. Qui, descriviamo un nuovo metodo sviluppato nel laboratorio per la distribuzione efficiente dei plasmidi di DNA nel mouse vescica urotelio in vivo. Tramite instillazione intravescicale di plasmide del DNA pCAG-GFP ed elettroporazione della vescica esposta chirurgicamente, indichiamo che il plasmide del DNA possa essere consegnato in particolare le cellule uroteliali della vescica per espressione transitoria. Il nostro metodo fornisce un modo veloce e conveniente per la sovraespressione e atterramento di geni nella vescica del mouse e può essere applicato alla costruzione di GEMM di cancro alla vescica e altre malattie urologiche.

Per dimostrare il successo di consegna del gene in urothelium della vescica, abbiamo usato il plasmide di15 pCAG-GFP per elettroporazione. 20 µ l di soluzione Trypan Blue e plasmide è stato iniettato attraverso l'uretra e 5 impulsi elettrici sono stati amministrati. Dopo 48 h, abbiamo dissecato la vescica del mouse e osservato le patch di fluorescenza di GFP sotto un microscopio di fluorescenza di dissezione, mentre un negativo di controllo della vescica che non ...

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Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation

Descriviamo un metodo novello per la consegna del plasmide del DNA nelle cellule uroteliali del mouse della vescica in vivo tramite cateterizzazione dell'uretra e l'elettroporazione. Offre un modo veloce e conveniente per la generazione di modelli murini autoctoni di malattie di vescica.

Nuovo metodo di consegna plasmide DNA Urothelium della vescica del Mouse mediante elettroporazione

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms ...

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8.4K Views.  University of California, Santa Cruz. Descriviamo un metodo novello per la consegna del plasmide del DNA nelle cellule uroteliali del mouse della vescica in vivo tramite cateterizzazione dell'uretra e l'elettroporazione. Offre un modo veloce e conveniente per la generazione di modelli murini autoctoni di malattie di vescica.

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Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

Mouse in Utero elettroporazione: controllato Transefection Gene spazio-temporale

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

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Neuroscienze

An Orthotopic Bladder Cancer Model for Gene Delivery Studies

Bladder cancer is the second most common cancer of the urogenital tract and novel therapeutic approaches that can reduce recurrence and progression are needed. The tumor microenvironment can significantly influence tumor development and therapy response. It is therefore often desirable to grow tumor cells in the organ from which they originated. This protocol describes an orthotopic model of bladder cancer, in which MB49 murine bladder carcinoma cells are instilled into the bladder via catheterization. Successful tumor cell implantation in this model requires disruption of the protective glycosaminoglycan layer, which can be accomplished by physical or chemical means. In our protocol the bladder is treated with trypsin prior to cell instillation. Catheterization of the bladder can also be used to deliver therapeutics once the tumors are established. This protocol describes the delivery of an adenoviral construct that expresses a luciferase reporter gene. While our protocol has been optimized for short-term studies and focuses on gene delivery, the methodology of mouse bladder catheterization has broad applications.

Implantation of cancer cells into the organ of origin can serve as a useful preclinical model to evaluate novel therapies. MB49 bladder carcinoma cells can be grown within the bladder following intravesical instillation. This protocol demonstrates catheterization of the mouse bladder for the purpose of tumor implantation and adenoviral delivery.

Un ortotopico cancro della vescica Modello di Gene Studi di consegna

Bladder cancer is the second most common cancer of the urogenital tract and novel therapeutic approaches that can reduce recurrence and progression are ...

Medicina

Neonatal Pial Surface Electroporation

Over the past several years the pial surface has been identified as a germinal niche of importance during embryonic, perinatal and adult neuro- and gliogenesis, including after injury. However, methods for genetically interrogating these progenitor populations and tracking their lineages had been limited owing to a lack of specificity or time consuming production of viruses. Thus, progress in this region has been relatively slow with only a handful of investigations of this location. Electroporation has been used for over a decade to study neural stem cell properties in the embryo, and more recently in the postnatal brain. Here we describe an efficient, rapid, and simple technique for the genetic manipulation of pial surface progenitors based on an adapted electroporation approach. Pial surface electroporation allows for facile genetic labeling and manipulation of these progenitors, thus representing a time-saving and economical approach for studying these cells.

The pial surface is a unique progenitor zone in the CNS that is receiving increasing attention. Herein, we detail a method for rapid genetic manipulation of this progenitor zone using a modified electroporation method. This procedure can be used for cellular and molecular investigations of cell lineages and signaling pathways involved in cell differentiation and to elucidate the fate and properties of daughter cells.

Neonatale Pial elettroporazione Surface

Over the past several years the pial surface has been identified as a germinal niche of importance during embryonic, perinatal and adult neuro- and ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular transfection technique for testicular mouse cells allows the study of unique processes in spermatogenesis.
The following protocol focuses on transfection of testicular mouse cells with plasmid constructs. Specifically, we used the reporter vector pEGFP-C1, which expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) and also the pDsRed2-N1 vector expressing red fluorescent protein (DsRed2). Both encoded reporter genes were under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter (CMV).
For performing gene transfer into mouse testes, the reporter plasmid constructs are injected into testes of living mice. To that end, the testis of an anaesthetized animal is exposed and the site of microinjection is prepared. Our preferred place of injection is the efferent duct, with the ultimately connected rete testis as the anatomical transport route of the spermatozoa between the testis and the epididymis. In this way, the filling of the seminiferous tubules after microinjection is excellently managed and controlled due to the use of stained DNA solutions. After observing a sufficient filling of the testis by its colored tubule structure, the organ is electroporated. This enables the transfer of the DNA solution into the testicular&#160;cells. Following 3 days of incubation, the testis is removed and investigated under the microscope for green or red&#160;fluorescence, illustrating transfection success.
Generally, this protocol can be employed for delivering DNA- or RNA- constructs into living mouse testis in order to (over)express or knock down genes, facilitating in vivo gene function analysis. Furthermore, it is suitable for studying reporter constructs or putative gene regulatory elements. Thus, the main advantages of the electroporation technique are fast performance in combination with low effort as well as the moderate technical equipment and skills required compared to alternative techniques.

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This article describes microinjection and electroporation of mouse testis in&#160;vivo as a&#160;transfection technique for testicular mouse cells to study unique processes of spermatogenesis. The presented protocol involves steps of glass capillary preparation, microinjection via the efferent duct, and transfection by electroporation.

In Vivo Microiniezione e Elettroporazione di mouse Testicolo

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

Biologia

Electroporation of Plasmid DNA into Mouse Skeletal Muscle

Transient gene expression modulation in murine skeletal muscle by plasmid electroporation is a useful tool for assessing normal and pathological physiology. Overexpression or knockdown of target genes enables investigators to manipulate individual molecular events and, thus, better understand the mechanisms that impact muscle mass, muscle metabolism, and contractility. In addition, electroporation of DNA plasmids that encode fluorescent tags allows investigators to measure changes in subcellular localization of proteins in skeletal muscle in vivo. A key functional assessment of skeletal muscle includes the measurement of muscle contractility. In this protocol, we demonstrate that whole muscle contractility studies are still possible after plasmid DNA injection, electroporation, and gene expression modulation. The goal of this instructional procedure is to demonstrate the step-by-step method of DNA plasmid electroporation into mouse skeletal muscle to facilitate uptake and expression in the myofibers of the tibialis anterior and extensor digitorum longus muscles, as well as to demonstrate that skeletal muscle contractility is not compromised by injection and electroporation.

Electroporation of plasmid DNA into skeletal muscle is a viable method to modulate gene expression without compromising muscle contractility in mice.

Elettroporazione del DNA plasmidico nel muscolo scheletrico del topo

Transient gene expression modulation in murine skeletal muscle by plasmid electroporation is a useful tool for assessing normal and pathological ...

Expression of Transgenes in Native Bladder Urothelium Using Adenovirus-Mediated Transduction

In addition to forming a high-resistance barrier, the urothelium lining the renal pelvis, ureters, bladder, and proximal urethra is hypothesized to sense and transmit information about its environment to the underlying tissues, promoting voiding function and behavior. Disruption of the urothelial barrier, or its sensory/transducer function, can lead to disease. Studying these complex events is hampered by lack of simple strategies to alter gene and protein expression in the urothelium. Methods are described here that allow investigators to generate large amounts of high-titer adenovirus, which can then be used to transduce rodent urothelium with high efficiency, and in a relatively straightforward manner. Both cDNAs and small interfering RNAs can be expressed using adenoviral transduction, and the impact of transgene expression on urothelial function can be assessed 12 h to several days later. These methods have broad applicability to studies of normal and abnormal urothelial biology using mouse or rat animal models.

Methods are described for the generation of large amounts of recombinant adenoviruses, which can then be used to transduce the native rodent urothelium allowing for expression of transgenes or downregulation of endogenous gene products.

Espressione di transgeni nell'urotelio vescicale nativo mediante trasduzione mediata da adenovirus

In addition to forming a high-resistance barrier, the urothelium lining the renal pelvis, ureters, bladder, and proximal urethra is hypothesized to sense ...

Electroporation-Mediated In Vitro Gene Delivery: An Electric Pulse Technique to Introduce Fluorescent Reporter Protein-Encoding Plasmids Into Cultured Cells

Source: Lo, J. C. W. et al., <a href="https://www.jove.com/v/63283">Efficient and Cost Effective Electroporation Method to Study Primary Cilium-Dependent Signaling Pathways in the Granule Cell Precursor.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160; (2021)
This video demonstrates the electroporation technique that introduces fluorescent protein-encoding plasmid DNA into mouse primary cerebellar granule cell precursors.

Consegna genica in vitro mediata da elettroporazione: una tecnica di impulso elettrico per introdurre plasmidi codificanti proteine reporter fluorescenti in cellule coltivate

Source: Lo, J. C. W. et al., Efficient and Cost Effective Electroporation Method to Study Primary Cilium-Dependent Signaling Pathways in the Granule Cell ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biological Techniques

Gene Transfer Techniques

Transfection

Urine Depletion and Bladder Rinsing in Mouse Model: A Catheter-based Procedure to Empty and Wash Murine Urinary Bladder

Source: Yu, C. et al. <a href="https://www.jove.com/video/57649" target="_blank">Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation.</a> J. Vis. Exp. (2018)
In this video, we describe a catheter-based procedure to empty and rinse the urinary bladder of a mouse model. The prepped mouse can then be used for further experimental procedures.

Deplezione delle urine e risciacquo della vescica in un modello murino: una procedura basata su catetere per svuotare e lavare la vescica urinaria murina

Source: Yu, C. et al. Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation. J. Vis. Exp. (2018)
In this video, we describe ...

Ricerca sul cancro

Urinary Tract Cancer

In vivo studies

Delivery of DNA Plasmids into Urothelium of Mouse Bladder: An Electroporation-based Procedure to Efficiently Deliver DNA Plasmids into Urothelial Cells of Murine Bladder to Generate Genetically Engineered Models

Source: Chuan, Y. et al. <a href="https://www.jove.com/video/57649" target="_blank">Novel method of plasmid DNA delivery to mouse bladder urothelium by electroporation.</a> J. Vis. Exp.&#160; (2018)
This video demonstrates the delivery of DNA plasmid into the urothelium of the mouse bladder using a combination of urethral catheterization and electroporation techniques. The described procedure allows the generation of mouse bladder cancer models.

Somministrazione di plasmidi di DNA nell'urotelio della vescica di topo: una procedura basata sull'elettroporazione per erogare in modo efficiente plasmidi di DNA nelle cellule uroteliali della vescica murina per generare modelli geneticamente modificati

Source: Chuan, Y. et al. Novel method of plasmid DNA delivery to mouse bladder urothelium by electroporation. J. Vis. Exp.&#160; (2018)
This video ...

Hydrodynamic Renal Pelvis Injection: A Technique to Directly Deliver DNA into Kidney Cells of Murine Model

Source: Woodard, L. E. et al. <a href="https://www.jove.com/video/56324" target="_blank">Hydrodynamic Renal Pelvis Injection for Non-viral Expression of Proteins in the Kidney.</a> J. Vis. Exp. (2018)
In this video, we present the protocol for hydrodynamic injection of plasmids into the renal pelvis of the mouse kidney for nucleic acid transfection. This technique allows organ-specific delivery of plasmids by utilizing the principle of high hydrostatic pressure, which forcefully drives the plasmids into the specific site without causing tissue injury.

Iniezione idrodinamica della pelvi renale: una tecnica per fornire direttamente il DNA nelle cellule renali del modello murino

Source: Woodard, L. E. et al. Hydrodynamic Renal Pelvis Injection for Non-viral Expression of Proteins in the Kidney. J. Vis. Exp. (2018)
In this video, ...