Gli autori desiderano ringraziare il sostegno del Forum Cancer Institute Cancer Research Award Samuel Oschin globale così come i fondi presso l&#39;Istituto di Medicina Rigenerativa del Cedars-Sinai, e la famiglia Guerin. Il progetto descritto è stato sostenuto nella forma di un CTSI Nucleo Voucher finanziato dal Centro Nazionale per le Risorse della Ricerca, Grant UL1RR033176, ed è ora presso il Centro Nazionale per l&#39;Avanzamento delle Scienze traslazionale, di Grant UL1TR000124. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del NIH.

Questa procedura è in conformità con i requisiti Cedars-Sinai IACUC. Gli investigatori dovrebbero garantire l&#39;osservanza IACUC istituzionale prima di procedere. Tutti gli strumenti ei reagenti devono essere sterilizzati prima dell&#39;uso. 1. Preparazione di strumenti, soluzioni, e la miscela di DNA <ol><li> Inserire borosilicato lucido tubi capillari di vetro da 100 mm di fuoco in un estrattore micropipetta. Impostare il riscaldamento per consentire tirare ponderata standard per formare la punta di pipetta di circa 17,5 millimetri. Tagliare le punte con forbici chirurgiche taglienti ad una distanza di circa 8-9 mm dall&#39;inizio della punta per creare un&#39;apertura circa 100 micron di diametro. </li><li> Fare un magazzino 1% w / v soluzione verde veloce mescolando acqua priva di nucleasi filtrato (utilizzando un filtro a siringa da 20 micron) con verde veloce asciutto. </li><li> Isolare purificato privo di endotossine DNA plasmide che è altamente concentrato (cioè&gt; 3 mg / mL), diluito in Tris-EDTA (TE) buffer. Importi aggiungere desiderate di plasmidedi miscela diluita in tampone TE e aggiungere un rapporto 1:10 della soluzione verde veloce 1% (per un 0,1% w / v concentrazione finale di verde veloce). Utilizzare una concentrazione finale di 0,5-2,0 mg / mL di plasmide per la robusta espressione dei transgeni. </li></ol> 2. Anestesia animale, Pipetta Caricare, e Pial superficie plasmidi iniezione <ol><li> Indurre l&#39;anestesia ipotermia in 1-2 giorni topi postnatale mettendoli su un piatto di Petri che viene inserito sul ghiaccio per 5-8 minuti (il tempo dipende dall&#39;età pup / peso). Una volta che l&#39;ipotermia è confermato dalla mancanza di da-punta pizzicamento e / o di coda riflesso movimento, i topi sono pronti per essere iniettato. Posizionare gli animali torna sul ghiaccio se riflessi dolore sono evidenti. La procedura di iniezione ed elettroporazione prendono meno di 2-3 minuti in totale così tempo l&#39;ipotermia, iniezione, e procedure elettroporazione conseguenza per mantenere l&#39;anestesia appropriata. </li><li> Durante l&#39;anestesia, con una pipetta standard con attenzione pipetta desiderata quantità di Plasmid miscela da iniettare (0,5-2 microlitri) su un pezzo di pellicola paraffina per riferimento. Qui, un volume totale di 0,5 ml di miscela plasmide viene iniettato. Successivamente, utilizzando un micro iniettore, inserire con attenzione montato pipetta capillare di vetro nella provetta contenente la miscela plasmide. Prendere ulteriore precauzione per evitare che la punta si rompa facendo in modo che non tocchi i bordi del tubo. Aspirare la soluzione nella pipetta lentamente componendo indietro la manopola di trasferimento. Una volta che un volume sufficiente è stato caricato nella pipetta, comporre avanti finché la pressione ritorna nella posizione neutra di 0 hPa. </li><li> Utilizzando 300-450 hPa Pressione per iniezione per assicurare pressione appropriata anche per il riempimento della piale superficie / spazio meningea, posizionare la punta vicina la pipetta di iniezione di paraffina riferimento pellicola di cera (da 2,2) e utilizzare il pedale dal micro iniettore per espellere uno Volume sulla pellicola paraffina. Regolare la pressione di conseguenza fino a quando l&#39;importo espulso pari alla referenc precedenza pipettatie volume. </li><li> Una volta che la punta è stato equilibrato e anestesia è stata confermata, cuccioli sono pronti per essere iniettato. </li><li> L&#39;obiettivo di questo esperimento è quello di iniettare la miscela plasmide sotto il cranio e sopra la superficie piale per consentire elettroporazione DNA verso il basso nella progenitori superficie piale (Figura 1A). Per le iniezioni di corteccia, tenere il cucciolo verso il basso con il pollice e l&#39;indice della mano meno dominante. Gli emisferi corticali e di altre strutture superficiali come i colliculi superiori sono visibili tra P0 e P2, consentendo facile il targeting di queste strutture (Figura 1B). Usando la mano e porta la regione dominante desiderato di corteccia (es. motore, somatosensoriali, ecc), inserire pipetta oltre la pelle e il cranio avendo cura di evitare le arterie cerebrali. Assicurarsi evitare un&#39;ulteriore penetrazione della punta passato cranio (che è indicato dall&#39;assenza di ulteriore resistenza solo dopo aver forato il cranio). </li><li> Iniettare plasmasoluzione id usando il pedale del micro iniettore e assicurarsi che disperde in modo uniforme in tutto il (Figura 2A) dei tessuti. Nota: È molto importante determinare empiricamente un approccio che massimizza consegna plasmide evitando ematoma dovuto alla pressione del fluido. Questo può essere fatto regolando la durata dell&#39;iniezione, l&#39;angolo, il volume, e il sito di destinazione preciso per evitare interruzioni vascolare. </li><li> Assicuratevi di provare e tenere la punta si secchi tra le iniezioni posizionando la punta di goccioline di prova da iniezioni effettuate in precedenza su carta cera o paraffina pellicola di plastica. Questo è necessario per evitare l&#39;accumulo punta della soluzione di DNA evaporato e cristallizzata, che può provocare l&#39;intasamento della punta e dei volumi di consegna incoerenti. </li></ol> 3. Elettroporazione <ol><li> Impostare il Elettroporatore a 135-150 V per cinque impulsi, della durata di 50 msec, con 950 msec intervalli tra ogni impulso. Al fine di aumentare la conduttanza eevitare di bruciare la pelle, coprire 3 mm tweezertrodes platino con gel elettroporazione. Verificare la presenza di riflessi-toe pizzicotti e di coda, a questo punto per garantire l&#39;anestesia. Se reattivo, disporli sul ghiaccio per diversi minuti per anestetizzare. </li><li> Per corteccia (e collicolo superiore) iniezioni, impiegare un elettrodo di 3 mm (Figura 2B) per migliorare la vitalità dei cuccioli (rispetto al 7 - elettrodi e 10 mm, che vengono utilizzati per zona ventricolare elettroporazione). Posizionare la sonda carica negativa dell&#39;elettrodo sull&#39;area iniettato e la sonda carica positiva intorno alla regione controlaterale sotto l&#39;occhio tale che l&#39;orientamento elettrodo è a 45-60 ° rispetto alla linea mediana (Figura 2C). </li><li> Utilizzare il pedale del elettroporatore per innescare corrente e tenere tweezertrodes sul posto per 3-5 impulsi, a seconda dell&#39;età e del peso dei cuccioli, in modo efficace il targeting DNA in cellule di superficie piale sottostanti nella contabilizzazione delle curvaturedegli emisferi. Nota: Il polo negativo può essere spazzato sull&#39;area iniettabile in fra impulsi e un elettrodo grande può essere impiegato per aumentare l&#39;area elettroporate. </li><li> Subito dopo l&#39;elettroporazione, pulire accuratamente fuori dal gel da cuccioli e metterli sotto una lampada di calore per circa 5 min. </li><li> Pups saranno acutamente perderanno il loro colore rosso-rosa naturale nei minuti dopo l&#39;elettroporazione a causa di cianosi. Osservare i cuccioli per il recupero di colore naturale e l&#39;avvio di movimento normale prima di tornare alle loro gabbie. </li><li> Garantire risocializzazione con la madre osservando se lei porta i cuccioli al nido e comincia a governare loro. Se lei diventa aggressivo, assicurarsi che i cuccioli non hanno residui di gel e incubare con alcune delle assestamento di trasferire l&#39;odore dei cuccioli. </li></ol> 4. Modifiche per Targeting collicolo superiore Targeting: <ol><li> Inject collicolo superiore nello stesso modo come la corteccia ma nota che la regione bersaglio si trova appena posteriormente e lateralmente al lambda e all&#39;incirca sulla linea mediana (Figure 3A e 3B). Con iniezioni di successo, la miscela plasmide riempie naturalmente i contorni del collicolo superiore. Una volta che le iniezioni sono state fatte con successo, gli animali sono pronti per l&#39;elettroporazione. </li></ol> Elettroporazione: <ol><li> In modo molto simile, per iniezioni collicolo superiore, posizionare la sonda carica negativa dell&#39;elettrodo sull&#39;area iniettato e la sonda carica positiva intorno all&#39;occhio, muso o mento, guidando DNA nelle regioni superficiali del collicolo superiore (Figura 3C) . In questo caso, l&#39;orientamento elettrodo è a 25-40 ° rispetto alla linea mediana. </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

L&#39;aspetto più critico per il successo elettroporazione di cellule progenitrici superficie piale sono: 1) il targeting di mix plasmide alla superficie piale; 2) evitare la generazione di ematomi nel sito di iniezione; e 3) evitando la mortalità associate con elettroporazione mesencefalo. Opportunamente mira la superficie piale si ottiene punzonamento misurata e attenta del cranio per evitare la penetrazione della superficie piale. Improprio di targeting per la pelle sovrastante o sottos...

Cellule staminali e progenitrici neurali sono presenti in tutta la loro SNC 1, 2. La loro natura e le proprietà nelle zone germinali embrionali e adulte che circondano le regioni ventricolari del cervello e del midollo spinale sono stati ampiamente documentati negli ultimi dieci anni 1-3. In gran parte, ciò è dovuto allo sviluppo di strumenti genetici sempre più precisi, come il sistema nervoso specifico Cre ricombinazione degli alleli floxed e lignaggio retrovirale tracciamento 4. Tuttavia, una regione, il progenitore piale progenitore superficie di zona-ha solo stato recentemente descritto in dettaglio 5-7 e attende esame completo. La superficie piale del cervello è definito come l&#39;interfaccia tra la superficie del cervello e meningi circostanti 8. Durante lo sviluppo, neuroepiteliale e, più tardi, i piedi end gliali radiali attribuiscono a questa superficie 9,10. Alcuni di abetest neuroni nel cervello umano e molte mitosi neuronali si osservano in questa regione 11. Successivamente, durante la neurogenesi embrionale, interneuroni corticali sono noti per attraversare la regione piale, oltre alla loro rotte migratorie nella zona intermedia e zona subventricular 12-14. Durante questo periodo, le cellule staminali possono essere coltivate da questa zona e sembra di essere un sito attivo di neuro-e gliogenesi 5. Nel cervello adulto, è stato riportato che interneuroni possono nascere da progenitori superficie piale seguente sfida ipossica 7. Tuttavia, il contributo di questa regione al suo a genensis durante lo sviluppo embrionale e postnatale è rimasta oscura in parte a causa della difficoltà di specificamente indagare questa regione 6. In collicolo superiore e nella corteccia cerebrale, interneuroni superficiali (o layer I nella corteccia) possono modulare l&#39;uscita del circuito di sottostanti popolazioni neuronali eccitatori e contribuire così significativaantly alla funzione di queste strutture. In particolare, lo strato 1 interneuroni sono in posizione privilegiata per regolare la scarica dei neuroni durante strati superiori della corteccia cerebrale data la loro ampia connettività agli strati superficiali e profondi di colonne corticali 15,16. In modo simile, gli interneuroni orizzontali ricevono input eccitatorio da fibre corticali e retiniche, progetto su un&#39;area relativamente ampia e sono speculato per mediare l&#39;inibizione di popolazioni di neuroni che rispondono a stimoli visivi remoto 17,18. Inoltre, la loro morfologia è adatto a svolgere un ruolo potenziale nell&#39;attività onda modellata nel sistema visivo di sviluppo 19. È interessante notare che lo sviluppo degli interneuroni e maturazione avviene in larga misura dopo la nascita. Inoltre, questo processo di maturazione è stato trovato per essere regolata da attività neuronale ed è quindi un substrato di plasticità dello sviluppo con conseguenze per tutta la vita sulla funzione del circuito 20,21. In particolare, no promotori sono descritti che possono specificatamente indirizzare queste cellule transgenically. Progenitori dividono possono essere mirati con retrovirus 7, ma la produzione di virus è in termini di tempo e richiede abilità per ottenere i titoli elevati necessari per la trasduzione delle cellule. Elettroporazione ha portato ad una rinascita nello studio di neurosviluppo in quanto consente una rapida ed efficace interrogatorio genetica delle vie di segnalazione in progenitori neurali 4, 22, 23. Elettroporazione comporta l&#39;iniezione di DNA plasmidico, seguita dal rilascio di impulsi elettrici al di fuori della testa, per guidare unidirezionalmente il DNA nei progenitori proliferanti circondano i ventricoli 4, 22, 23. Elettroporazione sembra richiedere transito delle cellule attraverso fase M del ciclo cellulare per l&#39;espressione dei transgeni plasmide 24. In particolare, si è scoperto che solocellule di passaggio di fase M entro 8 ore di elettroporazione di plasmidi esprimeranno transgeni nonostante una consegna efficace per tutte le celle all&#39;interno di ~ 160 micron della parete ventricolare 24. Si dice che questo è dovuto alla necessità di ripartizione involucro nucleare nel consentire l&#39;accesso nucleare dei plasmidi episomale, come sostanze chimiche che provocano permeabilizzazione nucleare possono indurre l&#39;espressione di plasmidi in cellule post mitotiche 25. Originariamente impiegato nell&#39;embrione 22, elettroporazione è stato adattato per l&#39;uso nel cervello postnatale molto più tardi 26, 27. Recentemente, abbiamo adattato elettroporazione per l&#39;uso nella manipolazione genetica di progenitori superficie piale 6. Inoltre, con questo metodo abbiamo dimostrato che ci sono apparentemente due linee distinte di progenitori in questa regione-interneuronale e astrocitaria 6. Dettagli Questo protocollo un modo semplice, rapido e potente per indirizzare queste cellule per l&#39;interrogazionelo sviluppo di meccanismi di regolazione di queste cellule.

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			<td style="width:269px;">Vendor</td>
			<td style="width:177px;">Catalog Number</td>
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		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fire Polished Borosilicate Tubing</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td>1B100F-4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments Company</td>
			<td>P-30</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fast Green FCF</td>
			<td>Sigma Aldrich, Inc.</td>
			<td>F7528</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">XenoWorks Digital Microinjector</td>
			<td>Sutter Instruments Company</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ECM 830 Generator</td>
			<td><a name="RANGE!B6">Harvard Apparatus, BTX Instrument Div</a></td>
			<td>45-0052</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3mm Platinum Tweezertrodes</td>
			<td>Harvard Apparatus, BTX Instrument Div</td>
			<td>45-0487</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SignaGel Electrode Gel</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>70315-025</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Tris-EDTA Buffer, pH 8.0</td>
			<td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td>
			<td>11-01-02-05</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Infrared Heat Lamp</td>
			<td>VWR</td>
			<td>36547-009</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine Scissors Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-09</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

neonatal pial surface electroporation

Negli ultimi anni la superficie piale è stato identificato come una nicchia germinale di importanza durante embrionale, perinatale e adulti neuro-e gliogenesi, compreso dopo l&#39;infortunio. Tuttavia, i metodi per interrogare queste popolazioni geneticamente progenitrici e monitoraggio le loro linee erano limitate a causa della mancanza di specificità o tempo di produzione di virus. Così, i progressi in questa regione è stato relativamente lento con solo una manciata di ricerche di questa posizione. L&#39;elettroporazione è stato utilizzato per oltre un decennio a studiare neurali proprietà delle cellule staminali nell&#39;embrione, e più recentemente nel cervello postnatale. Qui si descrive una tecnica efficiente, rapido e semplice per la manipolazione genetica dei progenitori superficie piale basati su un approccio elettroporazione adeguato. Pial superficie elettroporazione consente per l&#39;etichettatura genetica facile e manipolazione di questi progenitori, rappresentando così un approccio risparmio di tempo ed economico per lo studio di queste cellule.

Pial superficiali risultati elettroporazione nell&#39;espressione di DNA plasmidico in cellule principalmente progenitori-o vicino alla superficie piale 6. Più in particolare, l&#39;orientamento degli elettrodi è fondamentale nel dettare la direzione di movimento plasmide e successiva espressione. Così, in configurazioni a doppio elettrodo, il plasmide è diretto in circa un vettore retta tra l&#39;elettrodo negativo e positivo. Pertanto, se il polo negativo è posta sopra il sito di iniezione e il polo po...

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Neonatal Pial Surface Electroporation

La superficie piale è una zona progenitore unico nel SNC che sta ricevendo crescente attenzione. Qui, noi dettaglio un metodo per la manipolazione genetica rapido di questa zona progenitore utilizzando un metodo di elettroporazione modificato. Questa procedura può essere utilizzata per indagini cellulari e molecolari delle linee cellulari e vie di segnalazione coinvolte nella differenziazione cellulare e per chiarire il destino e le proprietà delle cellule figlie.

Neonatale Pial elettroporazione Surface

Over the past several years the pial surface has been identified as a germinal niche of importance during embryonic, perinatal and adult neuro- and ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.8K Views.  Cedars-Sinai Medical Center.  La superficie piale è una zona progenitore unico nel SNC che sta ricevendo crescente attenzione. Qui, noi dettaglio un metodo per la manipolazione genetica rapido di questa zona progenitore utilizzando un metodo di elettroporazione modificato. Questa procedura può essere utilizzata per indagini cellulari e molecolari delle linee cellulari e vie di segnalazione coinvolte nella differenziazione cellulare e per chiarire il destino e le proprietà delle cellule figlie. 

Video: Neonatal Pial Surface Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Trasfezione delle cellule gangliari della retina di topo In vivo Elettroporazione

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Ricerca

Neuroscienze

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

In elettroporazione in vivo di Retina topo in via di sviluppo

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

Mouse in Utero elettroporazione: controllato Transefection Gene spazio-temporale

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Neonatal Subventricular Zone Electroporation

Neural stem cells (NSCs) line the postnatal lateral ventricles and give rise to multiple cell types which include neurons, astrocytes, and ependymal cells1. Understanding the molecular pathways responsible for NSC self-renewal, commitment, and differentiation is critical for harnessing their unique potential to repair the brain and better understand central nervous system disorders. Previous methods for the manipulation of mammalian systems required the time consuming and expensive endeavor of genetic engineering at the whole animal level2. Thus, the vast majority of studies have explored the functions of NSC molecules in vitro or in invertebrates.
Here, we demonstrate the simple and rapid technique to manipulate neonatal NPCs that is referred to as neonatal subventricular zone (SVZ) electroporation. Similar techniques were developed a decade ago to study embryonic NSCs and have aided studies on cortical development3,4 . More recently this was applied to study the postnatal rodent forebrain5-7. This technique results in robust labeling of SVZ NSCs and their progeny. Thus, postnatal SVZ electroporation provides a cost and time effective alternative for mammalian NSC genetic engineering.

We demonstrate a minimally invasive technique referred to as neonatal subventricular zone electroporation. The technique consists of injecting plasmid DNA into the lateral ventricles of neonatal pups and applying electrical current to deliver and genetically manipulate neural stem cells

Neonatale Elettroporazione zona subventricolare

Neural stem cells (NSCs) line the postnatal lateral ventricles and give rise to multiple cell types which include neurons, astrocytes, and ependymal ...

Subtype-selective Electroporation of Cortical Interneurons

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression of genes of interest to specific neuronal subtypes has proven remarkably challenging due to the relative scarcity of specific promoter elements. GABAergic interneurons constitute a neuronal population with extensive genetic and morphological diversity. Indeed, more than 11 different subtypes of GABAergic interneurons have been characterized in the mouse cortex1. Here we present an adapted protocol for selective targeting of GABAergic populations. We achieved subtype selective targeting of GABAergic interneurons by using the enhancer element of the homeobox transcription factors Dlx5 and Dlx6, homologues of the Drosophila distal-less (Dll) gene2,3, to drive the expression of specific genes through in utero electroporation.

This procedure shows how to target interneurons in the developing mouse forebrain by means of in utero electroporation. This technique was particularly efficient to achieve selective gene expression in interneuron subtypes destined to the superficial layers of the cortex.

Sottotipo-selettivo elettroporazione della corticale interneuroni

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on postnatal day 1-3. A mouse litter, usually 4-10 pups born from one breeding pair, is gathered for one experiment, and spinal cords are collected individually from each mouse after euthanasia with isoflurane. The spinal column is dissected out and then the spinal cord is released from the column. The spinal cords are then minced to increase the surface area of delivery for an enzymatic protease that allows for the neurons and other cells to be released from the tissue. Trituration is then used to release the cells into solution. This solution is subsequently fractionated in a density gradient to separate the various cells in solution, allowing for neurons to be isolated. Approximately 1-2.5 x 106 neurons can be isolated from one litter group. The neurons are then seeded onto wells coated with adhesive factors that allow for proper growth and maturation. The neurons take approximately 7 days to reach maturity in the growth and culture medium and can be used thereafter for treatment and analysis.

This study presents a technique for the isolation of neurons from WT neonatal mice. It requires the careful dissection of the spinal cord from the neonatal mouse, followed by the separation of neurons from the spinal cord tissue through mechanical and enzymatic cleavage.

Isolamento e cultura dei neuroni del midollo spinale da topi neonatali

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Due-fotone Imaging dei neuroni corticali in topi neonatali

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous etiologies such as exposure to excessive noise, the use of ototoxic medications, bacterial or viral ear infections, head injuries, and the aging process. Loss of sensory hair cells is a common pathological feature of the varieties of acquired hearing loss. Additionally, the inner hair cell synapse can be damaged by mild insults. Therefore, surface preparations of cochlear epithelia, in combination with immunolabeling techniques and confocal imagery, are a very useful tool for the investigation of cochlear pathologies, including losses of ribbon synapses and sensory hair cells, changes in protein levels in hair cells and supporting cells, hair cell regeneration, and determination of report gene expression (i.e., GFP) for verification of successful transduction and identification of transduced cell types. The cochlea, a bony spiral-shaped structure in the inner ear, holds the auditory sensory end organ, the organ of Corti (OC). Sensory hair cells and surrounding supporting cells in the OC are contained in the cochlear duct and rest on the basilar membrane, organized in a tonotopic fashion with high-frequency detection occurring in the base and low-frequency in the apex. With the availability of molecular and genetic information and the ability to manipulate genes by knockout and knock-in techniques, mice have been widely used in biological research, including in hearing science. However, the adult mouse cochlea is miniscule, and the cochlear epithelium is encapsulated in a bony labyrinth, making microdissection difficult. Although dissection techniques have been developed and used in many laboratories, this modified microdissection method using cell and tissue adhesive is easier and more convenient. It can be used in all types of adult mouse cochleae following decalcification.

This article presents a modified cochlear surface preparation method that requires decalcification and use of a cell and tissue adhesive to adhere the pieces of cochlear epithelia to 10 mm round cover slips for immunohistochemistry in adult mouse cochleae.

Preparazione della superficie cocleare nel topo adulto

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...

Continuous Video Electroencephalogram during Hypoxia-Ischemia in Neonatal Mice

Hypoxia ischemia is the most common cause of neonatal seizures. Animal models are crucial for understanding the mechanisms and physiology underlying neonatal seizures and hypoxia ischemia. This manuscript describes a method for continuous video electroencephalogram (EEG) monitoring in neonatal mice to detect seizures and analyze EEG background during hypoxia ischemia. Use of video and EEG in conjunction allows description of seizure semiology and confirmation of seizures. This method also allows analysis of power spectrograms and EEG background pattern trends over the experimental time period. In this hypoxia ischemia model, the method allows EEG recording prior to injury to obtain a normative baseline and during injury and recovery. Total monitoring time is limited by the inability to separate pups from the mother for longer than four hours. Although, we have used a model of hypoxic-ischemic seizures in this manuscript, this method for neonatal video EEG monitoring could be applied to diverse disease and seizure models in rodents.

This manuscript describes a method for continuous video EEG recordings using multiple depth electrodes in neonatal mice undergoing hypoxia-ischemia.

Elettroencefalogramma video continuo durante l'ipossia-ischemia nei topi neonatali

Hypoxia ischemia is the most common cause of neonatal seizures. Animal models are crucial for understanding the mechanisms and physiology underlying ...

Micro-TC del cervello neonatale del topo Scansione ed elaborazione delle immagini

Micro-CT Imaging and Morphometric Analysis of Mouse Neonatal Brains

Neuroimages are a valuable tool for studying brain morphology in experiments using animal models. Magnetic resonance imaging (MRI) has become the standard method for soft tissues, although its low spatial resolution poses some limits for small animals. Here, we describe a protocol for obtaining high-resolution three-dimensional (3D) information on mouse neonate brains and skulls using micro-computed tomography (micro-CT). The protocol includes those steps needed to dissect the samples, stain and scan the brain, and obtain morphometric measurements of the whole organ and regions of interest (ROIs). Image analysis includes the segmentation of structures and the digitization of point coordinates. In sum, this work shows that the combination of micro-CT and Lugol's solution as a contrast agent is a suitable alternative for imaging the perinatal brains of small animals. This imaging workflow has applications in developmental biology, biomedicine, and other sciences interested in assessing the effect of diverse genetic and environmental factors on brain development.

Autore in primo piano: Imaging ad alta risoluzione del cervello di un neonato di topo - Un protocollo Micro-CT con l&#39;agente di contrasto in soluzione di Lugol

This study describes the steps for obtaining high-resolution images of neonatal mouse brains by combining micro-computed tomography (micro-CT) and a contrast agent in ex vivo samples. We describe basic morphometric analyses to quantify brain size and shape in these images.

Imaging micro-CT e analisi morfometrica del cervello neonatale del topo

Neuroimages are a valuable tool for studying brain morphology in experiments using animal models. Magnetic resonance imaging (MRI) has become the standard ...