Il Proximity Ligation Assay o PLA in situ è una tecnologia in grado di rilevare interazioni tra proteine, tessuto apposto e cellule. Le associazioni tra proteine possono essere identificate e quantificate senza la necessità di espressione transgenica o tecnologie aggiuntive. L'unico requisito è la disponibilità di anticorpi specifici ad alta efficienza che possono essere modificati con oligonucleotidi del DNA.
Nei tessuti MST1 e MST2 esistono principalmente come omodimeri attivi, ma gli stimoli oncogenici possono aumentare il livello di eterodimeri MST1 MST2 e tali eterodimeri sono inattivi. Dopo l'incubazione con anticorpi primer specifici contro le proteine di interesse, vengono aggiunti allo slot speciali anticorpi secondari specifici, ognuno collegato a un filamento di DNA unico, corto e gratuito ad esso collegato, per legarsi agli anticorpi primari. Se le proteine in questione sono eterodimerizzate, sia gli anticorpi primari che gli anticorpi secondari ad essi legati saranno nelle immediate vicinanze.
In questo stato, i filamenti di DNA attaccati sul secondo anticorpo possono interagire attraverso una successiva aggiunta di altri due oligonucleotidi del DNA che formano cerchi. Diverse centinaia di volte la replicazione del cerchio del DNA può verificarsi dopo una reazione di amplificazione e un segnale di fluorescenza è generato da sonde oligonucleotidi gratuite livellate. Pertanto, ogni segnale rilevato viene visualizzato come un singolo punto fluorescente che può essere assegnato a una specifica posizione subcellulare basata su immagini al microscopio.
Il giorno prima dell'esperimento, rivestire 16 diapositive ben camerate aggiungendo da 50 a 100 microlitri di laminina di topo o poli-L-lisina e incubare a 37 gradi Celsius. Dopo 30 minuti rimuovere la soluzione fredda, dividere le celle utilizzando tripina e piastra da 15.000 a 25.000 celle per pozzo in 16 vetri ben camerati. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato del 5% di anidride carbonica per 24 ore.
Dopo 24 ore, rimuovere il mezzo dai pozzi e lavare delicatamente le cellule con PBS. Utilizzare una micropipetta per ridurre al minimo l'assunzione di rischi del campione, quindi aspirare il PBS e fissare le cellule aggiungendo 50 microlitri di 4%PFA per pozzo e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente senza agitazione. Non pipettare la soluzione direttamente sulle cellule, in quanto ciò potrebbe causare il distacco delle cellule.
Dopo la fissazione, lavare le cellule con TBST tre volte per cinque minuti ciascuna con lieve agitazione. Successivamente permeabilizzare le cellule e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente senza agitazione. Al termine della permeabilizzazione, lavare le cellule con TBST tre volte per cinque minuti per lavaggio con agitazione.
Dopo aver rimosso TBST aggiungere una goccia di soluzione di blocco in ogni pozzo e incubare i vetrini in una camera di umidità preriscaldata per un'ora a 37 gradi Celsius. Diluire gli anticorpi primari. Rimuovere la soluzione di blocco utilizzando una micropipetta ma non lasciare asciugare i vetrini.
Vortice e aggiungere 40 microlitri della soluzione anticorpale diluita ai pozzi appropriati e incubare i campioni a 37 gradi Celsius in una camera di umidità preriscaldata per un'ora. Durante l'incubazione, diluire le due sonde PLA in diluinte anticorpale. Per ogni campione preparare 40 microlitri di sonda PLA.
Dopo un'ora di incubazione, aspirare la soluzione anticorpale e lavare gli scivoli due volte per cinque minuti con TBST a temperatura ambiente. Rimuovere delicatamente il TBST dalle diapositive e aggiungere 40 microlitri della soluzione di sonda PLA ad ogni pozzo. Incubare i vetrini in una camera di umidità preriscaldata per un'ora a 37 gradi Celsius.
Vortice e diluire i volumi richiesti del materiale di legatura da 1 a 5 in acqua ad alta purezza immediatamente prima dell'uso. Per ogni pozzo sono necessari 40 microlitri della soluzione di legatura. Dopo l'incubazione, rimuovere la soluzione PLA dagli scivoli e lavarli due volte in TBST per cinque minuti a temperatura ambiente con agitazione.
Utilizzare un blocco di congelamento quando si rimuove la ligasi dal congelatore e poco prima di aggiungerla alle cellule, al vortice e diluirla con la soluzione di legatura. Rimuovere il TBST dalle diapositive e aggiungere 40 microlitri della soluzione di legatura ligasi ad ogni pozzo. Incubare i vetrini in una camera di umidità preriscaldata per 30 minuti a 37 gradi Celsius.
Dopo l'incubazione aspirare la soluzione e lavare due volte con TBST per cinque minuti a temperatura ambiente con agitazione. Evitare di esporre il pozzo alla luce intensa in quanto i reagenti sono sensibili alla luce. Durante l'ultimo lavaggio, vortice e diluire i volumi di fabbisogno della soluzione di amplificazione in acqua ad alta purezza immediatamente prima dell'uso.
Mantenere la polimerasi sul ghiaccio o in un blocco di raffreddamento e poco prima di aggiungerla al vortice delle cellule e diluire con la soluzione di amplificazione. Aspirare il TBST dai pozzi e aggiungere 40 microlitri di soluzione di amplificazione ad ogni pozzo. Incubare gli scivoli in una camera di umidità preriscaldata scura per 100 minuti a 37 gradi Celsius.
Dopo l'incubazione, aspirare la soluzione di amplificazione della polimerasi dagli scivoli e lavare due volte dieci minuti ciascuno in TBST a temperatura ambiente. Rimuovere completamente le camere e il silicone intorno ai pozzi dalla diapositiva. Raschiare le perline rimanenti di silicone con un rasoio.
Disegnare una griglia sulla diapositiva che separa ogni pozzo. Aggiungere circa 40 microlitri del supporto di montaggio con DAPI, assicurando che nessuna bolla d'aria sia catturata sotto lo scivolo di copertura. Utilizzare lo smalto per fissare il vetro di copertura.
L'analisi microscopica può essere eseguita in 20 minuti dopo la fissazione, ma in pratica troviamo più conveniente eseguire l'analisi delle immagini il giorno seguente. Per analizzare i campioni, utilizziamo un microscopio a scansione laser Leica SP8. Di seguito sono riportati esempi di saggi di litigazione di prossimità in situ che visualizzano la vicinanza tra le proteine MST 1 e MST2 nelle cellule renali embrionali umane nei pannelli da A a D e le cellule di Schwann umano nei pannelli da E a H.In tutti i nuclei cellulari dei pannelli sono macchiati di blu da DAPI e i punti rossi indicano segnali di dosaggio di ligation di prossimità positivi derivanti da una stretta vicinanza tra le proteine indicate.
Il pannello A mostra la vicinanza di MST1 e MST2 e il pannello B mostra la vicinanza di ERK e fosfoERK in quanto questi epitopi si trovano sulla stessa proteina. Il pannello C rappresenta un controllo negativo in quanto queste cellule come MST1 e MST2 e Pannello D rappresentano un secondo controllo negativo macchiato di anticorpi per MST1 ed ERK che non dovrebbero essere in prossimità l'uno dell'altro. I pannelli E e F mostrano la vicinanza di MST1 con MST2 ed ERK con fosfoERK nelle celle Schwann.
I pannelli G e H sono controlli negativi macchiati solo con anticorpi MST1 o con anticorpi MST1 ed ERK. È imperativo usare anticorpi primari non reattivi incrociati che dovrebbe riconoscere solo un membro dell'eterodimero. Inoltre è importante ricordare di utilizzare diverse punte per evitare la contaminazione incrociata di anticorpi primari e sonde PLA, per evitare di toccare il fondo del pozzo ed evitare di pipettare direttamente sui campioni.
Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come usare il PLA in situ per studiare la dimerizzazione delle proteine nelle cellule fisse.
