Questa ricerca è finanziata dalla MRC e le sovvenzioni BBSRC. Ringraziamo Agata Zieba e Katerina Pardalis nel laboratorio di Ulf Landegren, Università di Uppsala per aiutare con la creazione di la tecnica e utili consigli. Biosience Olink per assistenza tecnica e la presentazione.

1. Placcatura di Cellule e trattamento con BMP <ol><li> Cellule in coltura Neuro2a GMEM supplementato con 10% FBS, 1x aminoacidi non essenziali (NEAM), 1x piruvato di sodio e 1x L-glutammina. Dividere le celle utilizzando tripsina (0,05%-EDTA) e la piastra 15,000-20,000 cellule per bene in un 16-scivolo e da camera. Cultura HEK293T o Cos7 cellule in DMEM supplementato con 10% FBS, 1x L-glutamina e 1 penicillina / streptomicina. Sterilizzare diapositive polysine immergendole in etanolo al 70% e l&#39;uso della penna Immedge disegnare 1 cm 2 pozzi. Dividere le celle utilizzando tripsina (0,05%-EDTA) e la piastra 20,000-25,000 cellule per pozzetto in 50 microlitri di media. </li><li> Incubare le cellule a 37 ° C in un umidificata, 5% CO 2 incubatore. </li><li> Dopo 24 h sostituire il mezzo con i livelli di free GMEM (integrata con 0,1% di albumina, NEAM 1x, 1x piruvato di sodio e 1x L-glutamina) per Neuro2a o con i livelli di free DMEM (integrato con L-Glutamina e 1 penicillina / streptomicina) per HEK293T / Cos7 e incubare le cellule per 2-3 h. Mantenere tre pozzi con le cellule in condizioni normali di coltura (10% FBS) da utilizzare come controlli. </li><li> Trattare le cellule con dorsomorphin (inibitore del pathway BMP, 2 mM) o BMP4 (25 ng / ml) per il tempo desiderato (ad esempio per 10 min-1 h) 5. </li></ol> 2. Fissazione e permeabilizzazione <ol><li> Preparare il fissativo, 4% PFA. Pesare 4 g di PFA per preparare una soluzione al 4% in 100 ml di PBS. Riscaldare la soluzione a 50 ° C fino a quando non è chiara. Filtrare la soluzione attraverso un filtro a 0,22 micron e conservare a 4 ° C fino all&#39;uso. Usa fissativo fresco (non persistono per più di 2 giorni). </li><li> Aspirare il terreno dai pozzetti e lavare con 1xPBS. Non pipettare le soluzioni direttamente sulle cellule in quanto ciò può causare il distacco delle cellule. Prima di passare alla fase successiva, se scivoli da camera vengono utilizzati rimuovere le camere, ma lasciare il silicio attorno ai pozzi. </li><li> Aggiungere 50 microlitri PFA 4% e incubare per 10 minuti, a temperatura ambiente, senza mescolare. </li><li> Lavare le cellule con PBS per 3 x 5 minuti in una vaschetta Coplin con agitazione a temperatura ambiente. </li><li> Trattare le cellule con lo 0,5% Triton X-100 in PBS per 10 minuti senza agitazione a temperatura ambiente. </li><li> Lavare le cellule con il 0,05% di Tween 20 in TBS (TBS-T) per 3 x 5 minuti in una vaschetta Coplin con agitazione a temperatura ambiente. </li></ol> 3. Blocco <ol><li> Preleva il TBS-T. Aggiungere una goccia di soluzione Duolink Blocco II (1x) per bene. </li><li> Incubare i vetrini in un pre-riscaldato camera umida per 1 ora a 37 ° C. </li></ol> 4. Anticorpi primari <ol><li> Mescolare e diluire aP-Smad1/5/8 (policlonale di coniglio) a 1:100 e a-Smad4 (monoclonale di topo) a 1:100 nel diluente anticorpale II Duolink (1x). Preparare anche aP-Smad1/5/8 e a-Smad4 solo alle stesse concentrazioni da utilizzare per i controlli. </li><li> Rubinetto la soluzione di saturazione da diapositive. Rimuovere il blocco soluzione molto possibile, ma fare molta attenzione a non lasciare le pile a secco prima di aggiungere l&#39;anticorpo. Aggiungere 40 ml di soluzioni di anticorpi nei pozzetti. In un solo bene aggiungere diluente anticorpale come un ulteriore controllo negativo. </li></ol> 5. PLA sonde <ol><li> Diluire le due sonde PLA (Duolink II anti-mouse MINUS e Duolink II anti-coniglio PLUS) 1:5 con il diluente anticorpale. </li><li> Rubinetto la soluzione primaria di anticorpi da diapositive. Lavare le diapositive 2 volte 5 minuti ciascuno con tampone 1x Duolink II lavaggio A in una vaschetta Coplin con agitazione a temperatura ambiente. </li><li> Preleva il tampone di lavaggio A da diapositive e aggiungere la soluzione PLA sonda (40 microlitri / pozzetto). Incubare i vetrini in un pre-riscaldato camera umida per 1 ora a 37 ° C. </li></ol> 6. Legatura <ol><li> Il vortice Duolink II magazzino Legatura (5x) e diluire 1:5 in acqua ad elevata purezza e mescolare. Quando si calcola il volume di acqua, tener conto del volume della ligasi che verrà aggiunto ad una diluizione finale di 1:40 poco prima l&#39;aggiunta della miscela nei pozzetti. </li><li> Rubinetto la soluzione della sonda PLA da diapositive. Lavare i vetrini nella soluzione di lavaggio 1x A per 2 volte ogni 5 minuti in una vaschetta Coplin con agitazione a temperatura ambiente. </li><li> Estrarre la ligasi dal freezer utilizzando un blocco di congelamento (-20 ° C). Aggiungere la ligasi alla soluzione Ligation (preparata in 6.1) ad una diluizione 1:40 e vortice. </li><li> Preleva il tampone di lavaggio A da diapositive e aggiungere la legatura-ligasi soluzione ad ogni pozzetto (40 microlitri / pozzetto). Incubare i vetrini in un pre-riscaldato camera umida per 30 minuti a 37 ° C. </li></ol> 7. Amplificazione Nota: reagenti sensibili alla luce. Tenere le diapositive al riparo dalla luce. <ol><li> Diluire il Amplificazione Duolink II stock (5x) 1:5 in acqua ad elevata purezza e mescolare. Quando si calcola il volume di acqua tener conto del volume della polimerasi, che verrà aggiunto ad una diluizione finale di 1:80 poco prima che l&#39;aggiunta del mix di secoloe pozzi. </li><li> Tocca al largo della legatura-ligasi soluzione da diapositive. Lavare i vetrini in tampone di lavaggio 1x A con per 2 volte 2 minuti ciascuna in una vaschetta Coplin con agitazione a temperatura ambiente. </li><li> Estrarre la polimerasi dal congelatore utilizzando un blocco di congelamento (-20 ° C). Aggiungere la polimerasi alla soluzione di amplificazione (preparata in 7.1) ad una diluizione 1:80 e vortice. </li><li> Preleva il tampone di lavaggio A da diapositive e aggiungere il Amplificazione-Polymerase soluzione ad ogni pozzetto (40 microlitri / pozzetto). Incubare i vetrini in un pre-riscaldato camera umida per 100 minuti a 37 ° C. </li></ol> 8. Preparazione per l&#39;imaging Nota: reagenti sensibili alla luce. Tenere le diapositive al riparo dalla luce. <ol><li> Preleva il Amplificazione-polimerasi soluzione da diapositive e lavarsi per 2 volte ogni 10 minuti in 1x Duolink II tampone di lavaggio B in una vaschetta Coplin con agitazione a temperatura ambiente. </li><li> Immergere i vetrini nel tampone di lavaggio 0,1 x B. </li><li> Togliere il silicone dal 16-scivolo completamente bene. Aggiungi ~ 40μl del II Duolink Mezzo di montaggio con DAPI sul coprioggetto e appoggiarlo sopra i campioni premendolo leggermente in modo che non ci siano bolle d&#39;aria sotto il vetrino. Fissare e sigillare il coprioggetto sul vetrino con smalto. Attendere almeno 15 minuti prima di procedere alla imaging. </li><li> Analizzare i campioni con un microscopio confocale o fluorescenza. Ottenere immagini digitali. </li></ol> 9. Quantificazione Nota: reagenti sensibili alla luce. Tenere le diapositive al riparo dalla luce. <ol><li> Usa Duolink ImageTool a contare i segnali sulle immagini per ottenere una misurazione del livello di segnalazione. </li><li> Confrontare le misure e fare un grafico. </li></ol> 10. Rappresentante Risultati Il risultato di un esperimento in situ PLA presenta macchie fluorescenti discreti. La posizione del segnale dipende dalle specifiche proteine ​​studiate. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/2631/2631fig1.jpg" /> Figura 1. PLA in situ sulle cellule Neuro2a dopo la stimolazione BMP4. Le cellule sono state trattate con mM dorsomorphin 2 (inibitore della via BMP) (A) o 25 ng / ml BMP4 (B) per 60 minuti o non trattata (CE). Anticorpi contro P-Smad1/5/8 e Smad4 sono stati utilizzati per rilevare i complessi attivi in ​​A e B. Gli anticorpi primari aP-Smad1/5/8 solo (C) e una-Smad4 solo (D) o omissione del primario anticorpi (E) sono stati utilizzati come controlli. Blu: DAPI; Rosso: segnale di PLA. Immagini sono state ottenute con un microscopio confocale Leica SP5. (F) I segnali di PLA sono stati contati con il software Duolink ImageTool e il numero medio di macchie nel nucleo per cella è presentato nel grafico. (G), le cellule Neuro2a sono stati lasciati non trattati o trattati con Dorsomorphin (2 mM) o BMP4 (25 ng / ml) per 60 min. Le cellule sono state lisate e le proteine ​​sono stati sottoposti a SDS-PAGE ed analizzati mediante immunoblotting con aP-Smad1/5/8 e a-PCNA il caricamento di controllo. (*) Non specifica banda. Si noti che il aP-Smad1/5/8 anticorpi non può distinguere tra i 3 differenti proteine ​​presenti nei complessi con Smad4.

<ol>
	<li>Miyazono, K., Kamiya, Y., Morikawa, M. B. o. n. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=morphogenetic+protein+receptors+and+signal+transduction.">morphogenetic protein receptors and signal transduction.</a> J Biochem. 147, 35-51 (2010).</li><li>Gustafsdottir, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+ligation+assays+for+sensitive+and+specific+protein+analyses.">Proximity ligation assays for sensitive and specific protein analyses.</a> Anal Biochem. 345, 2-9 (2005).</li><li>Soderberg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation.">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nat Methods. 3, 995-1000 (2006).</li><li>Soderberg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+proteins+and+their+interactions+in+cells+and+tissues+using+the+in+situ+proximity+ligation+assay.">Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay.</a> Methods. 45, 227-232 (2008).</li><li>Yu, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsomorphin+inhibits+BMP+signals+required+for+embryogenesis+and+iron+metabolism.">Dorsomorphin inhibits BMP signals required for embryogenesis and iron metabolism.</a> Nat Chem Biol. 4, 33-41 (2008).</li><li>Baan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+proximity+ligation+detection+of+c-Jun/AP-1+dimers+reveals+increased+levels+of+c-Jun/Fra1+complexes+in+aggressive+breast+cancer+cell+lines+in+vitro+and+in+vivo.">In situ proximity ligation detection of c-Jun/AP-1 dimers reveals increased levels of c-Jun/Fra1 complexes in aggressive breast cancer cell lines in vitro and in vivo.</a> Mol Cell Proteomics. 9, 1982-1990 .</li><li>Massinen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+interaction+of+DYX1C1+with+estrogen+receptors+suggests+involvement+of+hormonal+pathways+in+dyslexia.">Functional interaction of DYX1C1 with estrogen receptors suggests involvement of hormonal pathways in dyslexia.</a> Hum Mol Genet. 18, 2802-2812 (2009).</li><li>Thymiakou, E., Zannis, V. I., Kardassis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+and+functional+interactions+between+liver+X+receptor/retinoid+X+receptor+and+Sp1+modulate+the+transcriptional+induction+of+the+human+ATP+binding+cassette+transporter+A1+gene+by+oxysterols+and+retinoids.">Physical and functional interactions between liver X receptor/retinoid X receptor and Sp1 modulate the transcriptional induction of the human ATP binding cassette transporter A1 gene by oxysterols and retinoids.</a> Biochemistry. 46, 11473-11483 (2007).</li></ol>

La produzione di questo video-articolo è stato sponsorizzato da OLINK che fa un reagente utilizzato nella procedura di test vicinanza legatura.

La visualizzazione di complessi proteici in situ è molto richiesto, in particolare per gli studi di segnalazione in cui l&#39;interazione delle proteine ​​e modificazione delle proteine ​​sono i mezzi che le cellule utilizzano per l&#39;invio di un segnale da loro superficie al nucleo. Non è stato possibile visualizzare e quantificare i complessi tra due proteine ​​endogene in situ con immunofluorescenza prima. Co-localizzazione di anticorpi mostre bassa risoluzione e non può essere utilizzato per visualizzare l&#39;interazione vera. PLA è una nuova tecnica che i ricercatori hanno iniziato a utilizzare in sistemi diversi con grande successo, 6, 7. Qui, ci dimostrano come utilizzare PLA non solo di visualizzare, ma anche di quantificare i complessi endogena tra effettori Smad attivato a valle della stimolazione BMP nel tempo. Abbiamo utilizzato cellule di coltura di tessuto differenti tra cui Neuro2a e invocato anticorpi commerciali cresciuto a specie diverse (mouse a-Smad4 e coniglio aP-Smad1/5/8) per raggiungere questo obiettivo (fig. 1). Questo metodo ci ha permesso, per la prima volta, per vedere l&#39;attivazione di BMP effettrici complessi nel tempo e non solo la presenza del fosforilata Smad1/5/8, che non possono essere tutti impegnati in complessi attivi con Smad4. Abbiamo contato i segnali (Fig. 1F) e rispetto la misura con la quantificazione ottenute da immunoblot delle stesse cellule 8 (figura 1G). Siamo giunti alla conclusione che il numero delle macchie di fornire una misurazione accurata comparativa dei livelli di segnale nel tempo. La tecnica è stata applicata anche su altre linee cellulari (HEK293T e Cos7) con risultati simili (dati non riportati). Il principio della tecnologia si basa su due sonde uniche fornite con il kit Duolink. Ogni sonda PLA è costituito da un anticorpo secondario collegato a un oligonucleotide sintetico unico, che agisce come reporter. La vicinanza delle sonde permette di legatura del DNA nel punto esatto in cui sono attaccati a queste sonde di prossimità. La distanza del oligonucleotidi, che permette l&#39;ibridazione del DNA e la legatura è piccolo (40 nm &lt;) e quindi, solo le proteine ​​che interagiscono può permettere la legatura. Il DNA legatura possono poi essere amplificate e analizzate con ibridazione di oligonucleotidi etichetta della sequenza amplificata. L&#39;amplificazione è specifica in quanto dipende da DNA-DNA principi di ibridazione e fornisce anche ad alta sensibilità, come il DNA è amplificato legatura diverse volte con conseguente valorizzazione della manifestazione legatura iniziale. Il DNA amplificato viene rilevato tramite l&#39;ibridazione con oligonucleotidi etichettati e produce un luogo visibile e piuttosto grande. Come gli spot possono essere contati, il segnale di PLA fornisce non solo le informazioni esatte spaziale (la posizione degli eventi interazione), ma anche un modo obiettivo di quantificare questi eventi 2-4. Altre tecniche che vengono impiegate per la rilevazione delle interazioni proteiche sono co-immunoprecipitazione, immunofluorescenza e fluorescente Resonance Energy Transfer (FRET). Co-immunoprecipitazione test sono ampiamente utilizzati consente l&#39;isolamento di complessi proteici. Il metodo è accompagnato da immunoblotting che significa che le proteine ​​deve essere espressa a livelli relativamente elevati per poter essere rilevato. I problemi di fondo alto o legame non specifico di alcune proteine ​​ai talloni sono a volte difficili da superare in co-immunoprecipitazione. Inoltre, la co-immunoprecipitazione test permettono la rilevazione di proteine ​​che possono essere parte di un complesso di proteine, ma non riescono a distinguere quelli che sono nelle immediate vicinanze interagire fisicamente con l&#39;altro. Inoltre, il co-immunoprecipitazione non può fornire la quantificazione nella risoluzione singola cella o le informazioni sulla localizzazione dei complessi proteina nella cellula. Rilevazione di co-esistenza di complessi proteici in una cella o un vano cella immunofluorescenza si basa sulla sovrapposizione di segnali diffusi e, quindi, ha una bassa risoluzione spaziale e non può fornire informazioni accurate sulle interazioni delle proteine. Quantificazione del segnale di immunofluorescenza può essere fatto da stima visiva solo se la differenza è diverse volte, e non possono essere accurate o misurabili, come le macchie PLA. FRET permette la visualizzazione di complessi proteici in cellule vive e supera la necessità di anticorpi e l&#39;esposizione della epitopo. Tuttavia, FRET di solito dipende la sovraespressione di proteine ​​artificiali fusa, che potrebbero non riflettere l&#39;complessi proteici endogeni come nel PLA. Condizioni di blocco del protocollo di PLA sono critici come aggregazione degli anticorpi si possono verificare ed aumentare lo sfondo. Alternative condizioni di blocco possono essere trovati nelle schede del prodotto anticorpi. Controlli appropriati con omissione anticorpo primario e secondario di fornire informazioni su cosa possa essere andato male e hanno bisogno di essere sempre inclusi. E &#39;importante schermo anticorpi diversi che darà il minimo background quando vengono utilizzati da soli e il miglior segnale quando sono insieme. Fissazione di cells è critica come oltre la fissazione può causare complessi proteici a snaturare e degradare completamente, mentre la fissazione insufficiente può portare alla perdita di complessi proteici durante le fasi della procedura. Questo può essere controllato abbassando la concentrazione del fissativo al 3% o limitando il tempo di fissazione. Tuttavia, la fissazione dipende anche dal fatto che gli anticorpi primari riconoscono proteine ​​denaturate o meno. Come la tecnica PLA è molto sensibile, particolare attenzione è necessaria per mantenere i tempi di incubazione e le condizioni micro uguali tra diversi campioni. I campioni non deve essere lasciato ad asciugare in ogni caso prima che il passo finale. L&#39;essiccazione dei campioni può portare a un aumento di fondo. La rimozione completa della soluzione di bloccaggio è anche fondamentale per evitare di fondo. I tamponi di lavaggio deve sempre essere portato a temperatura ambiente prima dell&#39;uso, la temperatura bassa rallenta le reazioni enzimatiche. Per la risoluzione dei problemi consultare il manuale del kit. E &#39;utile utilizzare le macchie di accertare la localizzazione sub-cellulare del segnale di PLA (per esempio DAPI, actina ecc). Qui abbiamo usato DAPI (nel mezzo di montaggio) per colorare i nuclei. PLA è compatibile con l&#39;uso di immunofluorescenza con anticorpi per determinare il tipo cellulare o un compartimento cellulare (non mostrati qui). Quantificazione precisa può essere fatta contando i segnali e l&#39;uso di software specifici (Image Tool Duolink, Olink Biosience). In conclusione abbiamo dimostrato come utilizzare in situ PLA, utilizzando il kit per rilevare Duolink BMP segnalazione nelle cellule fisse e ha presentato i suoi vantaggi: facile da usare, molto sensibile, senza sfondo, e una capacità unica di quantificare attivo BMP segnalazione in situ. La limitazione di applicare questa tecnica per studiare le interazioni delle proteine ​​differenti dipende dalla disponibilità e qualità degli anticorpi primari che riconoscono le proteine ​​sotto inchiesta.

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>GMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>21710025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>21063029</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>AutogenBioclear</td>
<td>7.01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Non-essential Amino Acids</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11149068</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Pyruvate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11360070</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin / Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25030-054</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25300-054</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>16-well chamber slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lab-Tek</td>
<td>178599</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polysine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>631-0107</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cover glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>631-0138</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>a-pSmad1/5/8</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cell Signaling</td>
<td>9511</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>a-Smad4 (B8) </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
<td>sc-7966</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dorsomorphin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Merck</td>
<td>171260-10MG</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Recombinant Mouse BMP-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>R&amp;D</td>
<td>5020-BP-010</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PFA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P6148</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton-X 100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T8787</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tween-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>H5151</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II Detection Reagents (Orange)</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>OLINK</td>
<td>92007-0100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II PLA probe anti-Mouse MINUS</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olink Bioscience</td>
<td>92004-0100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II PLA probe anti-Rabbit PLUS</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olink Bioscience</td>
<td>92002-0100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II Mounting Medium with DAPI</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olink Bioscience</td>
<td>82040-0005</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.olink.webbhuset.com/products_services/duolink_products.php?menu=380">Duolink II Wash Buffers Fluorescence</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olink Bioscience</td>
<td>82049</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

detection of signaling effector-complexes downstream of bmp4 using in situ pla, a proximity ligation assay

BMP sono responsabili di una vasta gamma di effetti sullo sviluppo e biologici. Attivare i recettori BMP (fosforilare) la Smad1/5/8 effettori, che poi, formano un complesso con Smad4 e traslocare al nucleo dove funzionano come fattori di trascrizione di avviare BMP effetti specifici a valle 1. Tradizionali tecniche di immunofluorescenza con anticorpi anti-fosfo Smad peptidi mostrano bassa sensibilità, elevato background e offrono quantificazione lordo si basano sulla intensità del segnale degli anticorpi in particolare se questa è fotosensibile fluorescenti. Inoltre, fosfo-Smads non possono essere tutti in complesso con Smad4 e impegnati nella trascrizione attivo. In situ PLA è una tecnologia in grado di rilevare le interazioni proteina con elevata specificità e sensibilità 2-4. Questa nuova tecnologia di riconoscimento coppie di anticorpi con l&#39;amplificazione del DNA surrogato della proteina. Si genera un localizzata, segnale discreto in una forma di macchie rivelare l&#39;esatta posizione dell&#39;evento riconoscimento. Il numero di segnali possono essere contate e confrontate fornendo una misurazione. Abbiamo applicato in situ PLA, utilizzando il kit Duolink, con una combinazione di anticorpi, che consente il rilevamento degli effettori segnalazione BMP phospho-Smad1/5/8 e Smad4 solo quando questi si trovano in prossimità cioè in un complesso, che si verifica solo con segnalazione attivazione. Questo ha permesso per la prima volta, la visualizzazione e la misurazione del endogene BMP segnalazione con alta specificità e sensibilità in un esperimento in corso a tempo stimolazione BMP4.

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Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay

Qui si mostrano come utilizzare Ligation analisi di prossimità (PLA), con una combinazione di anticorpi per visualizzare proteina morfogenetica dell&#39;osso (BMP) di segnalazione nelle cellule fisso. Questa tecnica ci ha permesso di seguire l&#39;accumulo nucleare di BMP endogene attivate effettore complessi e quantificare i loro livelli nel corso del tempo sotto BMP4 stimolazione.

Rilevazione di segnalazione Effettistica-Complessi valle di BMP4 utilizzo In situ PLA, una legatura di prossimità Assay

BMPs are responsible for a wide range of developmental and biological effects. BMP receptors activate (phosphorylate) the Smad1/5/8 effectors, which then, ...

detection-signaling-effector-complexes-downstream-bmp4-using-situ-pla

Research

JoVE Journal

Biology

Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay

31.6K Views.  Imperial College, Hammersmith Hospital. Qui si mostrano come utilizzare Ligation analisi di prossimità (PLA), con una combinazione di anticorpi per visualizzare proteina morfogenetica dell'osso (BMP) di segnalazione nelle cellule fisso. Questa tecnica ci ha permesso di seguire l'accumulo nucleare di BMP endogene attivate effettore complessi e quantificare i loro livelli nel corso del tempo sotto BMP4 stimolazione.

Video: Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

Rapida rilevazione omogenea dei saggi biologici Utilizzando Magnetic biopercezione sistema di modulazione

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Ricerca

Biologia

Chromosomics: Detection of Numerical and Structural Alterations in All 24 Human Chromosomes Simultaneously Using a Novel OctoChrome FISH Assay

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique that allows specific DNA sequences to be detected on metaphase or interphase chromosomes in cell nuclei1. The technique uses DNA probes with unique sequences that hybridize to whole chromosomes or specific chromosomal regions, and serves as a powerful adjunct to classic cytogenetics. For instance, many earlier studies reported the frequent detection of increased chromosome aberrations in leukemia patients related with benzene exposure, benzene-poisoning patients, and healthy workers exposed to benzene, using classic cytogenetic analysis2. Using FISH, leukemia-specific chromosomal alterations have been observed to be elevated in apparently healthy workers exposed to benzene3-6, indicating the critical roles of cytogentic changes in benzene-induced leukemogenesis. 
Generally, a single FISH assay examines only one or a few whole chromosomes or specific loci per slide, so multiple hybridizations need to be conducted on multiple slides to cover all of the human chromosomes. Spectral karyotyping (SKY) allows visualization of the whole genome simultaneously, but the requirement for special software and equipment limits its application7. Here, we describe a novel FISH assay, OctoChrome-FISH, which can be applied for Chromosomics, which we define here as the simultaneous analysis of all 24 human chromosomes on one slide in human studies, such as chromosome-wide aneuploidy study (CWAS)8. The basis of the method, marketed by Cytocell as the Chromoprobe Multiprobe System, is an OctoChrome device that is divided into 8 squares, each of which carries three different whole chromosome painting probes (Figure 1). Each of the three probes is directly labeled with a different colored fluorophore, green (FITC), red (Texas Red), and blue (Coumarin). The arrangement of chromosome combinations on the OctoChrome device has been designed to facilitate the identification of the non-random structural chromosome alterations (translocations) found in the most common leukemias and lymphomas, for instance t(9;22), t(15;17), t(8;21), t(14;18)9. Moreover, numerical changes (aneuploidy) in chromosomes can be detected concurrently. The corresponding template slide is also divided into 8 squares onto which metaphase spreads are bound (Figure 2), and is positioned over the OctoChrome device. The probes and target DNA are denatured at high-temperature and hybridized in a humid chamber, and then all 24 human chromosomes can be visualized simultaneously. 
OctoChrome FISH is a promising technique for the clinical diagnosis of leukemia and lymphoma and for detection of aneuploidies in all chromosomes. We have applied this new Chromosomic approach in a CWAS study of benzene-exposed Chinese workers8,10.

A novel fluorescence in situ hybridization (FISH) method that simultaneously examines both numerical and structural chromosome alterations, particularly the specific chromosomal translocations associated with leukemia and lymphoma, of all 24 human chromosomes on a single device in one hybridization, is described.

Chromosomics: Rilevamento delle alterazioni numeriche e strutturali in tutti i 24 cromosomi umani simultaneamente utilizzando un nuovo metodo di analisi FISH OctoChrome

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique that allows specific DNA sequences to be detected on metaphase or interphase chromosomes in cell ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

Rilevamento di RNA virale per fluorescenza<em&gt; In situ</em&gt; Hybridization (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

Misurazione del tasso metabolico in<em&gt; Drosophila</em&gt; Utilizzando respirometria

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

Rilevamento e analisi del danno al DNA nel muscolo scheletrico mouse<em&gt; In Situ</em&gt; Utilizzo del metodo TUNEL

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.

In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.

Un protocollo per lentivirali trasduzione e analisi valle di intestinale organoidi

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth ...

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an array of hundreds of queried 3&#8217;UTRs. Target identification is based on the dual-luciferase assay, which detects binding at the mRNA level by measuring translational output, giving a functional readout of miRNA targeting. 3&#8217;LIFE uses non-proprietary buffers and reagents, and publically available reporter libraries, making genome-wide screens feasible and cost-effective. 3&#8217;LIFE can be performed either in a standard lab setting or scaled up using liquid handling robots and other high-throughput instrumentation. We illustrate the approach using a dataset of human 3&#8217;UTRs cloned in 96-well plates, and two test miRNAs, let-7c and miR-10b. We demonstrate how to perform DNA preparation, transfection, cell culture and luciferase assays in 96-well format, and provide tools for data analysis. In conclusion 3&#39;LIFE is highly reproducible, rapid, systematic, and identifies high confidence targets.

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3&#039;LIFE Assay

Luminescent identification of functional elements in 3&#8217; untranslated regions (3&#8217;UTRs) (3&#8217;LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3&#8217;UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.

Rivelazione di bersagli miRNA in high-throughput usando il saggio 3&#39;LIFE

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), are crucial hubs for cellular signaling and cell fate. Particularly, these inter-organelle contact sites allow the transfer of calcium from the ER to mitochondria through the voltage-dependent anion channel (VDAC)/glucose-regulated protein 75 (GRP75)/inositol 1,4,5-triphosphate receptor (IP3R) calcium channeling complex. While this subcellular compartment is under intense investigation in both physiological and pathological conditions, no simple and sensitive method exists to quantify the endogenous amount of ER-mitochondria contact in cells. Similarly, MAMs are highly dynamic structures, and there is no suitable approach to follow modifications of ER-mitochondria interactions without protein overexpression. Here, we report an optimized protocol based on the use of an in situ proximity ligation assay to visualize and quantify endogenous ER-mitochondria interactions in fixed cells by using the close proximity between proteins of the outer mitochondrial membrane (VDAC1) and of the ER membrane (IP3R1) at the MAM interface. Similar in situ proximity ligation experiments can also be performed with the GRP75/IP3R1 and cyclophilin D/IP3R1 pairs of antibodies. This assay provides several advantages over other imaging procedures, as it is highly specific, sensitive, and suitable to multiple-condition testing. Therefore, the use of this in situ proximity ligation assay should be helpful to better understand the physiological regulations of ER-mitochondria interactions, as well as their role in pathological contexts.

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

Here, we describe a procedure to visualize and quantify with high sensitivity the endogenous interactions between the endoplasmic reticulum and mitochondria in fixed cells. The protocol features an optimized in situ proximity ligation assay targeting the inositol 1,4,5-triphosphate receptor/glucose-regulated protein 75/voltage-dependent anion channel/cyclophilin D complex at the mitochondria-associated membrane interface.

Studio del reticolo endoplasmatico e mitocondri interazioni<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity Assay legatura in cellule fissate

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), ...

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires careful and in-depth analyses and quantification to capture as much information about the underlying events as possible. Spatial, temporal and intensity parameters intrinsic to Ca2+ signals such as frequency, duration, propagation, velocity and amplitude may provide some biological information required for intracellular signalling. High-resolution Ca2+ imaging typically results in the acquisition of large data files that are time consuming to process in terms of translating the imaging information into quantifiable data, and this process can be susceptible to human error and bias. Analysis of Ca2+ signals from cells in situ typically relies on simple intensity measurements from arbitrarily selected regions of interest (ROI) within a field of view (FOV). This approach ignores much of the important signaling information contained in the FOV. Thus, in order to maximize recovery of information from such high-resolution recordings obtained with Ca2+dyes or optogenetic Ca2+ imaging, appropriate spatial and temporal analysis of the Ca2+ signals is required. The protocols outlined in this paper will describe how a high volume of data can be obtained from Ca2+ imaging recordings to facilitate more complete analysis and quantification of Ca2+ signals recorded from cells using a combination of spatiotemporal map (STM)-based analysis and particle-based analysis. The protocols also describe how different patterns of Ca2+ signaling observed in different cell populations in situ can be analyzed appropriately. For illustration, the method will examine Ca2+ signaling in a specialized population of cells in the small intestine, interstitial cells of Cajal (ICC), using GECIs.

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Genetically encoded Ca2+ indicators (GECIs) have radically changed how in situ Ca2+ imaging is performed. To maximize data recovery from such recordings, appropriate analysis of Ca2+ signals is required. The protocols in this paper facilitate the quantification of Ca2+ signals recorded in situ using spatiotemporal mapping and particle-based analysis.

Applicazioni di mappatura spazio-temporale e tecniche di analisi delle particelle per quantificare la segnalazione intracellulare Ca2 + In Situ

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires ...

Detection of Plasmodium Sporozoites in Anopheles Mosquitoes using an Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Plasmodium sporozoites are the infective stage of malaria parasites that infect humans. The sporozoites residing in the salivary glands of female Anopheles mosquitoes are transmitted to humans via mosquito bites during blood feeding. The presence of sporozoites in the mosquito salivary glands thus defines mosquito infectiousness. To determine whether an Anopheles mosquito carries Plasmodium sporozoites, the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method has been the standard tool to detect the Plasmodium circumsporozoite protein (CSP), the major surface protein of the sporozoites. In this method, the head along with the thorax of each mosquito is separated from the abdomen, homogenized, and subjected to a sandwich ELISA to detect the presence of CSP specific to Plasmodium falciparum and each of the two subtypes, VK210 and VK247, of Plasmodium vivax.This method has been used to study malaria transmission, including the seasonal dynamics of mosquito infection and the species of the major malaria vectors in the study sites.

Detection of Plasmodium Sporozoites in Anopheles Mosquitoes using an Enzyme-linked Immunosorbent Assay

This protocol describes a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay to detect salivary gland sporozoites in mosquitoes. Using easily available monoclonal antibodies, the method enables cost-effective, high-throughput detection of mosquitoes carrying Plasmodium falciparum or Plasmodium vivax. The method is suitable for malaria transmission research, including vector surveys.