Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health: R21 NIH EB021870-01A1 e da NSF Research Project Grant: 1517110.

1. mappatura Fastq file
Nota: Profondo software così come molti programmi di bioinformatica è possibile utilizzare dati di sequenza di DNA in cui è stato mappato ogni sequenza leggere per la sua posizione in riferimento del DNA. Una varietà di programmi di mappatura può essere utilizzata per questo, tra cui l'interfaccia di MAPster qui che utilizza il programma di HISTAT2 per produrre file. Sam utilizzati nei passaggi successivi.
<ol><li>Mappare i dati di sequenza alla versione corretta del genoma. Per le librerie Y2H di origine del mouse, usare il genoma di mm10 UCSC; per coloro che utilizzano geni umani, usare il genoma di riferimento di hg38 UCSC, per geni di Saccharomyces cerevisiae , usare il genoma di riferimento UCSC SacCer3.</li>
	<li>
Installare MAPster.
	<ol>
<li>Scarica il software MAPster e installare. Il software può essere trovato utilizzando un browser web al seguente: https://github.com/emptyewer/MAPster/releases. HISAT2 gira su sistemi basati su Unix come un Apple Macintosh. Per questo motivo, il programma di MAPster verrà eseguito solo su sistemi compatibili come Apple Macintosh e linux. Nota: Requisiti di sistema per un Apple Mac sono: OSX 10.10 +, > 4 Gb di RAM, > 500 Gb di spazio su disco e accesso a internet per scaricare il genoma di riferimento. Agli utenti potrebbero essere necessario consultare con un istituzionale persona se loro impresa dispone di protocolli di sicurezza che limita autorizzazioni e diritti di amministratore.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Inserire i file necessari e parametri tramite la scheda "Main" (Figura 1). Selezionare il pulsante "Pairwise" appropriato per inserire file o come coppie o spaiati con FASTQ come il formato di file predefinito.
	<ol>
<li>Per l'analisi del profondo, attivare l'opzione "Pairwise" su "Off" per eseguire in formato di sola lettura.</li>
		<li>Caricare i file in MAPster semplicemente con drag-and-drop nella finestra appropriata.</li>
		<li>Selezionare un fonte di DNA/genoma che corrisponde all'origine degli inserti Y2H preda biblioteca di riferimento. Genomi indicizzati da diversi organismi di modello sono elencati nella finestra di "Genoma" e possono essere scaricati automaticamente da Johns Hopkins University Center for Computational Biology. Genomi di riferimento saranno conservati localmente per un uso successivo.</li>
		<li>Indicare il numero di processi del computer per essere dedicato al programma di mapping sotto la casella di "Discussioni", poiché HISAT2 supporta multi-threading. MAPster sarà cercare il computer e suggerire il numero massimo di processori disponibili per impostazione predefinita.</li>
		<li>Specificare un nome di file di output. Questo nome di file verrà utilizzato durante tutto il processo di profondo quindi è consigliato un nome breve ma descrittivo senza spazi o caratteri speciali. Specificare una cartella per i file mappati utilizzando il pulsante "Open Directory di Output" di uscita.</li>
		<li>Dopo aver selezionati i file appropriati e parametri, è possibile aggiungere il processo di mapping alla coda lavori utilizzando il pulsante "Aggiungi a coda". I nomi di file nella finestra principale possono essere eliminati e sostituiti con i file corrispondenti a un nuovo campione e possono essere aggiunti alla coda dopo aver fornito un nome di file di output corrispondente.</li>
		<li>Una volta che tutti i lavori vengono inseriti nella coda di lavoro, fare clic sul pulsante di "Coda di esecuzione". Nota: Una volta un lavoro di mappatura è stato posizionato nella coda, selezionando tale processo fa sì che le impostazioni dei parametri da visualizzare nella finestra "Parametri di lavoro" e l'istruzione di riga di comando con tutti gli argomenti da visualizzare nella finestra "Comando Job". Le opzioni di output includono dirigendo se a tenere letture che non riescono ad allineare e specificando il numero di allineamenti primari ammessi per ogni lettura. Il file di output predefinito da MAPster è nel formato di SAM (ad es. un file '. Sam'). Esso conterrà tutte le letture di sequenza dai file fastq specificato per quel campione compresi quelli che erano (mappato) e non erano (non mappati) correttamente mappate per il geome specificato.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Bioinformatic elaborazione utilizzando profondo Software
Nota: Software di profondo attualmente è compilato per l'uso con preda librerie contenenti sequenze di cDNA di mouse, sequenze di cDNA umano o sequenze di DNA genomic di S. cerevisiae . PROFONDO accetta il formato di file standard. Sam e può accettare un file SAM (Sam) contenente letture sia mappate e non mappate o file separati per ogni della legge non mappati e mappate.
<ol><li>Scarica il software di profondo e installare. Il software può essere trovato utilizzando un browser web al seguente: https://github.com/emptyewer/DEEPN/releases. Selezionare quale versione corrisponde la piattaforma informatica e il download. Per installare, aprire il pacchetto di installazione scaricato. Nota: Le versioni di profondo sono disponibili per impianti di PC, Mac e Linux. Sistemi Mac e PC dovrebbero avere > 500 Gb di spazio su disco rigido e > 4 Gb di RAM.</li>
	<li>
Aprire il software di profondo. Dalla finestra principale (Figura 2) selezionare le informazioni della libreria preda corrispondente dalla casella di selezione superiore. Selezionare una cartella dove i file elaborati possono andare facendo clic sul pulsante "Cartella di lavoro" e navigare alla cartella/directory. Se necessario, si può creare una nuova cartella/directory. Una volta selezionata una "cartella di lavoro", profondo creerà tre sottocartelle intitolato unmapped_sam_files, mapped_sam_files e sam_files.
	<ol>
<li>Se utilizzando file. Sam contenenti letture sia mappate e non mappate come quelle prodotte con le impostazioni predefinite del programma MAPster, inserirli nella cartella 'sam_files'. In caso contrario posto. Sam file in unmapped_sam_files e mapped_sam_files di conseguenza.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Avviare elaborazione facendo clic sul pulsante "Gene Count + Junction Make". Nota: L'elaborazione inizierà con il modulo di conteggio di Gene che utilizzerà posizioni di mappatura per contare quanti letture corrispondono a ogni gene. Giunzione Make estrarrà quindi sequenze di giunzione (le sequenze fuso direttamente a valle da Gal4-attivazione del dominio) dalle letture e identificarli utilizzando l'algoritmo di Blast. Questo creerà un insieme completo di cartelle raffigurato in Figura 3. Tempo di elaborazione dipende la dimensione e il numero di file di dati di sequenza e velocità di elaborazione del computer utilizzato. Tempi tipici vanno da 12 – 30 h per un set di dati sperimentali di 250 milioni di legge. La procedura di conteggio di Gene e la procedura di Junction_Make può essere avviati singolarmente cliccando il tasto "Gene Count" o il pulsante "Make di giunzione".</li>
	<li>
Scaricare e installare Stat_Maker (https://github.com/emptyewer/DEEPN/releases). Si tratta di un pacchetto di analisi statistica progettato per i DataSet di profondo che attualmente funziona solo su sistemi Unix Mac.
	<ol>
<li>Aprire Stat_Maker e fare clic sul pulsante "Verifica dell'installazione" (Figura 4). Se si esegue per la prima volta, Stat_Maker installerà automaticamente R, INTACCATURE e Bioconductor tirando queste risorse da internet. Una volta R, INTACCATURE e Bioconductor vengono rilevati, Stat_Maker diventerà attivo e consentono un ulteriore input dell'utente.</li>
		<li>Fare clic sul pulsante "Scegli cartella" per passare alla cartella di lavoro che profondo elaborato. Stat_Maker automaticamente trovare e l'elenco dei file per l'analisi statistica nella finestra.</li>
		<li>Trascinare e rilasciare i file appropriati dalla finestra di elenco di file sopra in windows il file qui di seguito per ogni set di dati vettoriali ed esca e per ogni condizioni di crescita: non selezionati (suo + media) e selezionato (suo - media). D'importanza, Stat_Maker richiede due campioni di selezionati e set di dati duplicati per vuoto vettore da solo, due campioni di popolazioni non selezionate. Questo dà una stima della variabilità all'interno dell'esperimento.</li>
		<li>Fare clic sul pulsante "Esegui". A seconda della velocità del computer, calcolo impiegherà tra 5 – 15 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Risultati del riesame dall'output di Stat_Maker, che sono collocati in una nuova sottocartella all'interno della cartella di lavoro principale con l'etichetta "Stat_Maker risultati". Nota: I risultati si trovano in un file CSV (valori separati da virgola) che può essere aperto in comune con programmi di calcolo. Stat_Maker di grado hits di gene che sono probabili essere differenzialmente arricchita sulla selezione con l'esca di interesse sopra il vuoto pTEF-GBD (Figura 5). Anche tabulati è la percentuale di letture per ogni set di dati dove l'inserto di gene si trova a Monte, a valle, o all'interno di open reading frame del e se il gene si trova anche all'interno della cornice di lettura corretta traslazionale. Spesso, profondo catturerà robusto Y2H interazioni di un esca con porzioni di un cDNA dato che sono fuori della cornice di lettura corretta della proteina corrispondente o a una porzione del cDNA che è a valle del relativo telaio aperto-lettura corrispondente. Scansione l'output combinato da Stat_Maker semplifica il rilevamento e l'eliminazione di questi colpi irrilevanti.</li>
	<li>
Per esaminare i dati su ogni potenziale candidato, aprire il software di profondo, selezionare le corrispondenti informazioni di libreria di preda e quindi la corretta cartella di lavoro utilizzando la "cartella di lavoro".
	<ol>
<li>Fare clic sul pulsante "Query Blast". Questo carica una nuova finestra (Figura 6). Nella casella di testo in alto, digitare il nome del gene o il numero di GenBank NM per selezionare il gene candidato di interesse. Questi nomi di gene corrispondano ai nomi elencati nel file di output di StatMaker. Tipo di invio o return, che avvia il recupero del gene di interesse.</li>
		<li>Selezionare quali set di dati verranno utilizzate per l'analisi utilizzando i menu "Selezionare Dataset". In genere, questi includono il vettore solo ed esca campioni allevati in condizioni non-selettivo e il campione di esca coltivate in condizioni di selezione. Inizialmente, i set di dati avrà qualche istante per il caricamento, tuttavia, la query successiva dei DataSet stesso con diversi geni andrà rapidamente. Blast_Query verranno visualizzati i punti di fusione lungo la sequenza di interesse e come abbondanti ogni punto di fusione è. Questo può essere visualizzato sia in un formato di tabella utilizzando la scheda "Risultati" o in un formato grafico utilizzando la scheda di "Trama". Questi risultati possono essere esportati in un file CSV facendo clic sul pulsante "Salva CSV" in alto a destra.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Verifica dei candidati identificati da profondo
Nota: Lo scopo del profondo e Stat_Maker è per identificare geni candidati che dare una positiva interazione Y2H. Verificare tali interazioni di Y2H può essere fatto utilizzando un formato binario tradizionale di Y2H utilizzando il plasmide esca di interesse accoppiato con il plasmide di dominio 'prey' Gal4-attivazione vuoto come pure accoppiato con il plasmide della preda che trasportano il frammento di gene/cDNA di interesse. Non è possibile isolare il plasmide effettivo di interesse all'interno della miscela di DNA isolato dalla popolazione lievito sottoposta a selezione Y2H. Tuttavia, informaticamente uno può ricostruire quello che è il frammento di gene/cDNA che produce l'interazione Y2H, disegnare primers per 5' e 3' estremità del frammento e amplificare quel frammento dal DNA isolato dalla popolazione lievito. In questa sezione viene descritto come trovare l'estremità 5' e 3' del frammento preda candidato.
<ol><li>Aprire il software di profondo e scegliere i parametri "Selezionare il parametro" e la cartella di lavoro corrispondente al progetto "Seleziona cartella di lavoro". Avviare il modulo di Blast_Query facendo clic sul pulsante "Query Blast".</li>
	<li>
Digitare il nome del gene di interesse o di sua GenBank "NM" numero nella casella di testo in alto. Selezionare dal menu pull-down il dataset che corrisponde alla popolazione di lieviti selezionati per l'esca di interesse per recuperare la tabella delle posizioni di giunzione sotto la scheda 'Risultati'. Per impostazione predefinita, Blast_Query ordinerà le diverse posizioni secondo la loro abbondanza nel dataset, quantificato mediante il ppm del numero totale di nodi trovati all'interno del database.
	<ol>
<li>Trovare il più abbondante la posizione che è "In ORF" e "nel Frame". Il valore per la posizione corrisponde alla posizione del nucleotide del gene con la sequenza di Riferimento NCBI (numero 'NM') trovata nella casella di testo in alto. Questa sequenza può essere Estratto da GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/) o copiata dalla casella di testo inferiore nella finestra Blast_Query. Nota: Un esempio può essere trovato nella Figura 6, pannello centrale. Nel dataset centro, i 'risultati' mostrano come la giunzione più abbondante: «Posizione»: 867; '#Junctions': 20033.821; 'Query Start', 1; CDS: In ORF; e 'Frame': nella cornice. Nucleotide 867 della sequenza di Riferimento NCBI GenBank NM_019648 è l'inizio del frammento preda.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Se la Query iniziare è 1, progettare l'estremità 5' del primer per includere il nucleotide corrispondente al numero di posizione ed estendere 25 nucleotidi a valle da quella posizione (Figura 7). Se avviare Query è maggiore di 1, indica che ci sono nucleotidi supplementari tra il dominio di attivazione Gal4 e la sequenza di preda di interesse e che il primer dovrebbe iniziare ulteriore a valle in base al valore di Start Query.</li>
	<li>Dalla finestra di profondo fare clic sul pulsante "Lettura profondità" sotto "Analisi dei dati". Una volta aperta la finestra di lettura profondità, digitare il nome di Riferimento NCBI sequenza (NM) numero o gene nella casella di testo in alto. Utilizzare il menu pull-down per selezionare il set di dati pertinenti che contiene il gene arricchito di interesse. Utilizzare la tabella a sinistra e la grafica visualizzata sulla destra per determinare quante letture sono state trovate nei dati che corrispondono al gene di interesse (Figura 7B).</li>
	<li>Progettare un primer di estremità 3' che cattura la sequenza del frammento gene calcolato da profondità di lettura. Se l'abbondanza di letture va oltre l'ORF e codone di arresto, progettare il primer in modo che esso comprende il codone di arresto e la regione appena a Monte del codone di arresto. Se le sequenze per il gene di non oltrepassare il codone di stop, è possibile utilizzare la tabella di risultati per trovare la più lontana regione 3' che può essere rilevata e utilizzare questa posizione come il più lontano 3' posizione in cui inserire il primer. Nota: Il programma di lettura profondità analizza in intervalli per trovare sequenze corrispondenti specificato gene/cDNA di interesse. Questo aiuta a prevedere dove estremità 5' e 3' del frammento preda più abbondante è per quel gene nel campione. Fluttuazioni nella lettura profondità lungo la lunghezza della sequenza sono normali, come si può vedere nella Figura 7. Se la profondità di lettura è chiaramente passato il codone di stop, indica che il frammento di preda si estende oltre il codone di arresto e così il primer 3' semplicemente può corrispondere la regione intorno al codone di arresto.</li>
	<li>
Eseguire una reazione di PCR di 50 µ l a gene. Ogni reazione contiene 25 pmoli di ciascun primer forward e reverse, il plasmide preda-biblioteca di corrispondenza (Vedi tabella materiali). Reazioni anche contengano 25 µ l di x PCR ad alta fedeltà 2 Master Mix, 5 µ g di campione di DNA e l'acqua fino a 50 µ l.
	<ol>
<li>Amplificare le reazioni per 25 cicli con tempi di estensione di 3 min a 72 ° C, ricottura temperatura di 55 ° C per 30 s e denaturare a 98 ° C per 10 s. Precede in bicicletta da una denaturazione 30 s a 98 ° C e seguire con un'incubazione di 5 min a 72 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Fields, S., Song, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+genetic+system+to+detect+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A novel genetic system to detect protein-protein interactions.</a> Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).</li>
<li>Rajagopala, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+Protein-Protein+Interactome+Networks+Using+Yeast+Two-Hybrid+Screens%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Mapping the Protein-Protein Interactome Networks Using Yeast Two-Hybrid Screens.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 883, 187-214 (2015).</li>
<li>Weimann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Y2H-seq+approach+defines+the+human+protein+methyltransferase+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A Y2H-seq approach defines the human protein methyltransferase interactome.</a> Nature Methods. 10 (4), 339-342 (2013).</li>
<li>Yachie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pooled-matrix+protein+interaction+screens+using+Barcode+Fusion+Genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Pooled-matrix protein interaction screens using Barcode Fusion Genetics.</a> Molecular Systems Biology. 12 (4), 863(2016).</li>
<li>Trigg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CrY2H-seq%3A+a+massively+multiplexed+assay+for+deep-coverage+interactome+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CrY2H-seq: a massively multiplexed assay for deep-coverage interactome mapping.</a> Nature Methods. , (2017).</li>
<li>Pashkova, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DEEPN+as+an+Approach+for+Batch+Processing+of+Yeast+2-Hybrid+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">DEEPN as an Approach for Batch Processing of Yeast 2-Hybrid Interactions.</a> Cell Reports. 17 (1), 303-315 (2016).</li>
<li>Kim, D., Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HISAT%3A+a+fast+spliced+aligner+with+low+memory+requirements%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">HISAT: a fast spliced aligner with low memory requirements.</a> Nature Methods. 12 (4), 357-360 (2015).</li>
<li>Reinert, K., Langmead, B., Weese, D., Evers, D. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25939052">Alignment of Next-Generation Sequencing Reads.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 16, 133-151 (2015).</li>
<li>Pertea, M., Kim, D., Pertea, G. M., Leek, J. T., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcript-level+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+HISAT%2C+StringTie+and+Ballgown%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Transcript-level expression analysis of RNA-seq experiments with HISAT, StringTie and Ballgown.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1650-1667 (2016).</li>
<li>Conesa, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26813401">A survey of best practices for RNA-seq data analysis.</a> Genome Biology. 17, 13(2016).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare

La suite di software qui descritta permette completamente elaborare e analizzare dati di sequenziamento del DNA di throughput elevato da un esperimento di profondo. Il primo programma utilizzato è MAPster, che prende le letture di sequenza di DNA nei file fastq standard e mappe loro posizione su un DNA di riferimento per l'elaborazione a valle da tutta una serie di programmi di informatica compreso il software di profondo. L'utilità dell'interfaccia MAPster e la sua capacità di coda processi multipli, di combinare fil...

Un approccio per scoprire le interazioni della proteina è il dosaggio di lievito 2-ibrido (Y2H), quali exploit ingegnerizzato cellule di lievito che crescono solo quando una proteina di interesse viene associato a un frammento di un partner interagenti1. Rilevamento di interazioni multiple Y2H ora può avvenire con l'aiuto di sequenziamento massivo di high throughput parallelo. Diversi formati sono stati descritti2,3,4,5 , tra cui uno che abbiamo sviluppato dove popolazioni vengono coltivati in batch in condizioni tali da selezionare per lievito contenente plasmidi che producono un positivo di interazione Y2H6. Il flusso di lavoro abbiamo sviluppato, chiamato profondo (arricchimento dinamico per la valutazione della proteina reti), identifica differenziale Interattomi dalle stesse librerie di preda per identificare le proteine che interagiscono con una proteina (o dominio) vs. un'altra proteina o un dominio mutante conformazionalmente distinto. Uno dei passi più importanti in questo flusso di lavoro è di consentire una corretta elaborazione e analisi dei dati di sequenziamento del DNA. Alcune informazioni possono essere raccolte solo contando il numero di letture per ogni gene sia prima che dopo la selezione di Y2H interazioni in modo analogo a un esperimento di RNA-seq. Tuttavia, per maggiori informazioni possono essere estratti da tali set di dati comprese le informazioni sul sottodominio di una data proteina che è in grado di produrre un'interazione Y2H. Inoltre, considerando che l'approccio profondo è prezioso, analizzando molte repliche del campione può essere ingombrante e costoso. Questo problema è risolta utilizzando un modello statistico che è stato sviluppato specificamente per i DataSet profondo dove il numero delle ripetizioni è limitato6. Per rendere l'elaborazione e l'analisi di set di dati di sequenziamento del DNA affidabile, completo, affidabile e accessibile per gli investigatori senza competenze di bioinformatica, abbiamo sviluppato una suite di programmi software che coprono tutte le fasi dell'analisi.
Questa suite di programmi di software stand-alone che girano su computer desktop include MAPster, profondo e Stat_Maker. MAPster è un'interfaccia grafica che permette che ogni file fastq in coda per la mappatura al genoma utilizzando il programma HISAT27, producendo un file standard. Sam per l'utilizzo in applicazioni a valle. PROFONDO ha diversi moduli. Assegna e conta letture corrispondente al gene particolare simile a una quantificazione di tipo RNA-seq utilizzando il modulo 'Gene Count'. Inoltre estrae le sequenze corrispondenti alla giunzione tra il dominio di transcriptional Gal4 e la sequenza di preda e raccoglie la posizione di tali giunzioni per consentire l'ispezione di tabelle comparative e grafici (utilizzando il modulo 'Junction_Make') Il modulo 'Blast_Query' permette facile ispezione, quantificazione e confronto tra le sequenze di giunzione Gal4 di giunzione. Stat_Maker valuta le letture al gene arricchimento dati statisticamente come un modo di priorità probabile Y2H hits. Qui, descriviamo come utilizzare questi programmi software e completamente analizzare la sequenza di DNA, dei dati da un profondo Y2H sperimentare. Versioni di profondo sono disponibili per l'esecuzione su sistemi PC, Mac e Linux. Altri programmi, ad esempio il programma di mappatura MAPster e il modulo di statistiche di profondo Stat_Maker si basano su subroutine che vengono eseguiti sotto Unix e sono disponibili solo su sistemi Mac e linux.

<table><tbody><tr><td>Mapster</td><td></td><td></td><td>https://github.com/emptyewer/MAPster/releases</td></tr><tr><td>DEEPN software</td><td></td><td></td><td>https://github.com/emptyewer/DEEPN/releases</td></tr><tr><td>Statmaker</td><td></td><td></td><td>https://github.com/emptyewer/DEEPN/releases</td></tr><tr><td>Minimum computer system</td><td>Apple</td><td></td><td>Mac Intel Core i5 or better</td></tr><tr><td></td><td>-</td><td></td><td>4 Gb RAM or better</td></tr><tr><td></td><td>-</td><td></td><td>500 Gb Disk spce or better</td></tr><tr><td></td><td>-</td><td></td><td>OS 10.10 or higher</td></tr><tr><td></td><td>Dell</td><td></td><td>Intel i5-7400 or better</td></tr><tr><td></td><td>-</td><td></td><td>4 Gb RAM or better</td></tr><tr><td></td><td>-</td><td></td><td>500 Gb Disk spce or better</td></tr><tr><td></td><td>-</td><td></td><td>Windows 7 or higher</td></tr></tbody></table>

informatic analysis of sequence data from batch yeast 2-hybrid screens

Abbiamo adattato il dosaggio di 2-ibrido del lievito per scoprire contemporaneamente decine di interazioni proteina transitoria e statica in una sola schermata utilizzando il sequenziamento del DNA di alto-rendimento breve lettura. I set di dati di sequenza risultante può non solo tenere traccia di quali geni in una popolazione che si arricchiscono durante la selezione per le interazioni di 2-ibrido del lievito positivo, ma anche dare informazioni dettagliate circa i relativi sottodomini di proteine sufficienti per l'interazione. Qui, descriviamo una suite completa di programmi di software stand-alone che consentono di non-esperti eseguire tutti i bioinformatica e statistiche passaggi per elaborare e analizzare file fastq di sequenze di DNA da un dosaggio di 2-ibrido del lievito batch. Le fasi di lavorazione coperte da questi software includono: 1) mappatura e conteggio letture di sequenza corrispondente ad ogni proteina candidato codificato all'interno di una libreria di preda 2-ibrido del lievito; 2) un programma di analisi statistica che valuta i profili di arricchimento; e 3) strumenti per esaminare il telaio traslazionale e posizione all'interno della regione di codificazione di ogni plasmide arricchito che codifica le proteine interagenti di interesse.

Mapping dei dati fastq: il primo passo In praticamente tutte le applicazioni di NGS compreso profondo l'output iniziale è un file di letture brevi sequenze che devono essere mappati dall'allineamento di genomica, trascrittomica, o altro riferimento DNA8. Recentemente, il programma di allineamento di HISAT2 è stato sviluppato che utilizza algoritmi di indicizzazione di state-of-the-art per aumentare drammaticamente la mappatura velocità<sup cl...

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Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

Sequenziamento profondo delle popolazioni di lieviti selezionati per le interazioni di lievito positivo 2-ibrido potenzialmente produce una ricchezza di informazioni su proteine partner interagenti. Qui, descriviamo il funzionamento di strumenti bioinformatici specifico e personalizzato aggiornato il software per analizzare i dati di sequenza da questi schermi.

Informatica analisi dei dati di sequenza da Batch lievito ibrido 2 schermi

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

informatic-analysis-of-sequence-data-from-batch-yeast-2-hybrid-screens

Research

JoVE Journal

Genetics

7.1K Views.  University of Iowa. Sequenziamento profondo delle popolazioni di lieviti selezionati per le interazioni di lievito positivo 2-ibrido potenzialmente produce una ricchezza di informazioni su proteine partner interagenti. Qui, descriviamo il funzionamento di strumenti bioinformatici specifico e personalizzato aggiornato il software per analizzare i dati di sequenza da questi schermi.

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A Modified Yeast-one Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies

Over the years, the yeast one-hybrid assay has proven to be an important technique for the identification and validation of physical interactions between proteins such as transcription factors (TFs) and their DNA target. The method presented here utilizes the underlying concept of the Y1H but is modified further to study and validate protein complexes binding to their target DNA. Hence, it is referred to as the modified yeast one-hybrid (Y1.5H) assay. This assay is cost effective and can be easily performed in a regular laboratory setting. Albeit using a heterologous system, the described method could be a valuable tool to test and validate the heteromeric protein complex binding to their DNA target(s) for functional genomics in any system of study, especially plant genomics.

The modified yeast one-hybrid assay described here is an extension of the classical yeast one-hybrid (Y1H) assay to study and validate the heteromeric protein complex-DNA interaction in a heterologous system for any functional genomics study.

Un lievito modificato - un sistema ibrido per studi di interazione tra DNA e proteine ​​eteromeriche

Over the years, the yeast one-hybrid assay has proven to be an important technique for the identification and validation of physical interactions between ...

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A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the discovery of high-affinity interactors that are highly enriched in the library of interacting candidates. In a traditional format, the yeast 2-hybrid assay can yield too many colonies to analyze when conducted at low stringency where low affinity interactors might be found. Moreover, without a comprehensive and complete interrogation of the same library against different bait plasmids, a comparative analysis cannot be achieved. Although some of these problems can be addressed using arrayed prey libraries, the cost and infrastructure required to operate such screens can be prohibitive. As an alternative, we have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing a strategy termed DEEPN (Dynamic Enrichment for Evaluation of Protein Networks), which incorporates high-throughput DNA sequencing and computation to follow the evolution of a population of plasmids that encode interacting partners. Here, we describe customized reagents and protocols that allow a DEEPN screen to be executed easily and cost-effectively.

Batch processing of yeast 2-hybrid screens allows for direct comparison of the interaction profiles of multiple bait proteins with a highly complex set of prey fusion proteins. Here, we describe refined methods, new reagents, and how to implement their use for such screens.

Una schermata di 2-ibrido del lievito in Batch per confrontare interazioni proteina

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the ...

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely related biochemical pathways. Previous methods such as the Synthetic Genetic Array (SGA) analysis, and random mutagenesis techniques using ultraviolet (UV) or chemicals like ethyl methanesulfonate (EMS) or N-ethyl-N- nitrosourea (ENU), have been widely used but are often costly and laborious. Also, these mutagen-based screening methods are frequently associated with severe side effects on the organism, inducing multiple mutations that add to the complexity of isolating the suppressors. Here, we present a simple and effective protocol to identify suppressor mutations in mutants which confer a growth defect in Schizosaccharomyces pombe. The fitness of cells with a growth deficiency in standard rich liquid media or synthetic liquid media can be monitored for recovery using an automated 96-well plate reader over an extended period. Once a cell acquires a suppressor mutation in the culture, its descendants outcompete those of the parental cells. The recovered cells that have a competitive growth advantage over the parental cells can then be isolated and backcrossed with the parental cells. The suppressor mutations are then identified using whole-genome sequencing. Using this approach, we have successfully isolated multiple suppressors that alleviate the severe growth defects caused by loss of Elf1, an AAA+ family ATPase that is important in nuclear mRNA transport and maintenance of genomic stability. There are currently over 400 genes in S. pombe with mutants conferring a growth defect. As many of these genes are uncharacterized, we propose that our method will hasten the identification of novel functional interactions with this user-friendly, high-throughput approach.

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

We present a simple suppressor screen protocol in fission yeast. This method is efficient, mutagen-free, and&#160; selective&#160; for&#160; mutations that&#160; often&#160; occur at&#160; &#160;a&#160; single&#160; genomic&#160; locus.&#160; The protocol is suitable for isolating suppressors that alleviate growth defects in liquid culture that are caused by a mutation or a drug.

Una schermata di soppressore Deep-sequenziamento-assistita, spontanea nel lievito a fissione Schizosaccharomyces pombe

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely ...

Genetica

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and computational approaches. One such method is the yeast one-hybrid (Y1H) assay, in which interactions between TFs and DNA regions are tested in the milieu of the yeast nucleus using reporter genes. Y1H assays involve two components: a &#8216;DNA-bait&#8217; (e.g., promoters, enhancers, silencers, etc.) and a &#8216;TF-prey,&#8217; which can be screened for reporter gene activation. Most published protocols for performing Y1H screens are based on transforming TF-prey libraries or arrays into DNA-bait yeast strains. Here, we describe a pipeline, called enhanced Y1H (eY1H) assays, where TF-DNA interactions are interrogated by mating DNA-bait strains with an arrayed collection of TF-prey strains using a high density array (HDA) robotic platform that allows screening in a 1,536 colony format. This allows for a dramatic increase in throughput (60 DNA-bait sequences against &#62;1,000 TFs takes two weeks per researcher) and reproducibility. We illustrate the different types of expected results by testing human promoter sequences against an array of 1,086 human TFs, as well as examples of issues that can arise during screens and how to troubleshoot them.

Here, we present an enhanced yeast one-hybrid screening protocol to identify the transcription factors (TFs) that can bind to a human DNA region of interest. This method uses a high-throughput screening pipeline that can interrogate the binding of &#62;1,000 TFs in a single experiment.

Schermi di monoibrido lievito avanzata per identificare il fattore di trascrizione associazione a sequenze di DNA umano

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the strength of linkage and association mapping methods, which trace the relationship between DNA sequence variants and phenotype across recombinant progeny from matings between individuals of a species. These approaches, although powerful, are not well suited to trait differences between reproductively isolated species. Here we describe a new method for genome-wide dissection of natural trait variation that can be readily applied to incompatible species. Our strategy, RH-seq, is a genome-wide implementation of the reciprocal hemizygote test. We harnessed it to identify the genes responsible for the striking high temperature growth of the yeast Saccharomyces cerevisiae relative to its sister species S. paradoxus. RH-seq utilizes transposon mutagenesis to create a pool of reciprocal hemizygotes, which are then tracked through a high-temperature competition via high-throughput sequencing. Our RH-seq workflow as laid out here provides a rigorous, unbiased way to dissect ancient, complex traits in the budding yeast clade, with the caveat that resource-intensive deep sequencing is needed to ensure genomic coverage for genetic mapping. As sequencing costs drop, this approach holds great promise for future use across eukaryotes.

Genetic Mapping of Thermotolerance Differences Between Species of Saccharomyces Yeast via Genome-Wide Reciprocal Hemizygosity Analysis

Reciprocal hemizygosity via sequencing (RH-seq) is a powerful new method to map the genetic basis of a trait difference between species. Pools of hemizygotes are generated by transposon mutagenesis and their fitness is tracked through competitive growth using high-throughout sequencing. Analysis of the resulting data pinpoints genes underlying the trait.

Mappatura genetica delle differenze di termotolleranza tra le specie di Saccamici Yeast tramite l'analisi dell'emizigosità reciproca genomica

A central goal of modern genetics is to understand how and why organisms in the wild differ in phenotype. To date, the field has advanced largely on the ...

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput identification of protein-protein interactions (PPI) for full-length transmembrane proteins. To this end, our lab developed the split-ubiquitin based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) system. This technology allows for the sensitive detection of transient and stable protein interactions using Saccharomyces cerevisiae as a host organism. MYTH takes advantage of the observation that ubiquitin can be separated into two stable moieties: the C-terminal half of yeast ubiquitin (Cub) and the N-terminal half of the ubiquitin moiety (Nub). In MYTH, this principle is adapted for use as a 'sensor' of protein-protein interactions. Briefly, the integral membrane bait protein is fused to Cub which is linked to an artificial transcription factor. Prey proteins, either in individual or library format, are fused to the Nub moiety. Protein interaction between the bait and prey leads to reconstitution of the ubiquitin moieties, forming a full-length 'pseudo-ubiquitin' molecule. This molecule is in turn recognized by cytosolic deubiquitinating enzymes, resulting in cleavage of the transcription factor, and subsequent induction of reporter gene expression. The system is highly adaptable, and is particularly well-suited to high-throughput screening. It has been successfully employed to investigate interactions using integral membrane proteins from both yeast and other organisms.

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid MYTH System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

MYTH allows the sensitive detection of transient and stable interactions between proteins that are expressed in the model organism Saccharomyces cerevisiae. It has been successfully applied to study exogenous and yeast integral membrane proteins in order to identify their interacting partners in a high throughput manner.

Split-Ubiquitina membrana a base di lievito Due-Hybrid (MITO) Sistema: un potente strumento per identificare interazioni proteina-proteina

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput ...

Biologia

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria have evolved different strategies to manipulate their host metabolism for their own benefit. This bacterial manipulation is often coupled with severe symptom development or the death of the affected plants. Determining the specific bacterial molecules responsible for the host manipulation has become an important field in microbiological research. After the identification of these bacterial molecules, called &#34;effectors,&#34; it is important to elucidate their function. A straightforward approach to determine the function of an effector is to identify its proteinaceous binding partner in its natural host via a yeast two-hybrid (Y2H) screen. Normally the host harbors numerous potential binding partners that cannot be predicted sufficiently by any in silico algorithm. It is thus the best choice to perform a screen with the hypothetical effector against a whole library of expressed host proteins. It is especially challenging if the causative agent is uncultivable like phytoplasma. This protocol provides step-by-step instructions for DNA purification from a phytoplasma-infected woody host plant, the amplification of the potential effector, and the subsequent identification of the plant&#39;s molecular interaction partner with a Y2H screen. Even though Y2H screens are commonly used, there is a trend to outsource this technique to biotech companies that offer the Y2H service at a cost. This protocol provides instructions on how to perform a Y2H in any decently equipped molecular biology laboratory using standard lab techniques.

Bacterial effector proteins are important for establishing successful infections. This protocol describes the experimental identification of proteinaceous binding partners of a bacterial effector protein in its natural plant host. Identifying these effector interactions via yeast two-hybrid screens has become an important tool in unravelling molecular pathogenicity strategies.

Svelare la funzione di un batterica Effector da un non-coltivabili fitopatogeni Utilizzando un lievito schermo doppio ibrido

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

Immunologia e infezioni

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

Schermi competitivo genomica delle Biblioteche di lievito con codice a barre

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

Rapida identificazione dei chimici genetici Interactions in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Studi di interazione biomolecolare utilizzando la tecnica dei due ibridi di lievito 

Isolating Interaction-Null&#47;Impaired Mutants Using the Yeast Two-Hybrid Assay

Protein-protein interactions are one of the most basic processes that underlie biological phenomena. One of the simplest and best ways to understand the role(s) and function(s) of a specific protein-protein interaction is to compare the phenotype of the wild-type (with the relevant protein-protein interaction) and those of mutants that lack the relevant interaction. Therefore, if such mutants can be isolated, they will help to elucidate the related biological processes. The yeast two-hybrid (Y2H) procedure is a powerful approach not only to detect protein-protein interactions but also to isolate interaction-null/impaired mutants. In this article, a protocol is presented to isolate interaction-null/impaired mutants using Y2H technology. First, a mutation library is constructed by combining the polymerase chain reaction and efficient seamless cloning technology, which efficiently excludes the empty vector from the library. Second, interaction-null/impaired mutants are screened by the Y2H assay. Because of a trick in the Y2H vector, undesired mutants, such as those with frameshift and nonsense mutations, are efficiently eliminated from the screening process. This strategy is simple and can, therefore, be applied to any combination of proteins whose interaction can be detected by the two-hybrid system.

Autore in primo piano: Isolamento migliorato di mutanti nulli di interazione nel lievito

The interactions of biomolecules, such as protein-protein interactions, are the molecular basis of biological functions. If interaction-null/impaired mutants that specifically lack the relevant interaction can be isolated, they will greatly help to understand the function(s) of this interaction. This article presents an efficient way to isolate interaction-null/impaired mutants.

Isolamento di mutanti nulli/alterati di interazione utilizzando il saggio a due ibridi di lievito

Protein-protein interactions are one of the most basic processes that underlie biological phenomena. One of the simplest and best ways to understand the ...

Informatica analisi dei dati di sequenza da Batch lievito ibrido 2 schermi

Riepilogo

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Un lievito modificato - un sistema ibrido per studi di interazione tra DNA e proteine eteromeriche

Una schermata di 2-ibrido del lievito in Batch per confrontare interazioni proteina

Una schermata di soppressore Deep-sequenziamento-assistita, spontanea nel lievito a fissione Schizosaccharomyces pombe

Schermi di monoibrido lievito avanzata per identificare il fattore di trascrizione associazione a sequenze di DNA umano

Mappatura genetica delle differenze di termotolleranza tra le specie di Saccamici Yeast tramite l'analisi dell'emizigosità reciproca genomica

Split-Ubiquitina membrana a base di lievito Due-Hybrid (MITO) Sistema: un potente strumento per identificare interazioni proteina-proteina

Svelare la funzione di un batterica Effector da un non-coltivabili fitopatogeni Utilizzando un lievito schermo doppio ibrido

Schermi competitivo genomica delle Biblioteche di lievito con codice a barre

Rapida identificazione dei chimici genetici Interactions in

Isolamento di mutanti nulli/alterati di interazione utilizzando il saggio a due ibridi di lievito

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