Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della ricerca sulle neuroscienze su come il trasporto del substrato di trasduzione del segnale e una clearance dei rifiuti si verificano negli spazi extracellulari cerebrali. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente il campionamento e la quantificazione di grandi molecole extracellulari nel fluido interstiziale o ISF di animali svegli che si muovono liberamente. Dopo aver confermato una mancanza di risposta al dito del piedi, rimuovere i capelli dal cranio di un topo anestetizzato e utilizzare le barre dell'orecchio e un morsetto per fissare saldamente l'animale su un adattatore.
Applicare un unguento agli occhi dell'animale e posizionare l'adattatore sull'apparato stereotassico. Utilizzare un bisturi per fare un'incisione cutanea sul cranio e attaccare un trapano al manipolatore del telaio stereotassico. Abbassare il trapano fino a toccare delicatamente lambda e ripristinare a zero la coordinata DV del trapano.
Quindi, spostare il trapano in bregma per ripristinare le coordinate AP e ML su zero. Spostate il trapano dal bregma alla coordinata verticale. Abbassate il trapano al cranio e impostate nuovamente la coordinata DV su zero.
Dopo aver ripetuto la procedura per una terza coordinata, praticare attentamente un foro di bava alla coordinata bersaglio, seguito da un secondo foro sul lato conlaterale dell'osso parietale. Inserire una vite ossea nel secondo foro e posizionare il pezzo di bloccaggio da un coperchio del tubo a microcentrifugo da 1,5 millilitri sul cranio in modo che i fori di bava siano all'interno del cerchio. Quindi, posizionare una cannula guida sul braccio più corto dell'adattatore stereotassico e fissare la cannula con un dado del cappuccio.
Impostare il braccio più lungo dell'adattatore stereotassico sul morsetto dell'elettrodo e fissare il braccio sul manipolatore dell'apparato stereotassico. Ruotare l'assieme stereotassico DV sul braccio del manipolatore di 12 gradi e spostare la cannula guida nel foro di bava. Quindi, abbassare lentamente la cannula guida di 1,2 millimetri nel cervello.
Aggiungere il cemento dentale alla corona fino a quando la parte metallica della cannula guida, la vite ossea e qualsiasi cranio esposto sono coperti e fissati e consentono al cemento di asciugarsi. Dopo 12-20 minuti, rimuovere l'adattatore stereotassico dal morsetto dell'elettrodo, rimuovere il dado del cappuccio e sostituire l'adattatore stereotassico con una sonda fittizia. Quindi, affinare il dado del cappuccio, rilasciare il mouse dall'apparato stereotassico e ospitare il mouse da solo in una singola gabbia.
Prima di impostare la microdialisi, riempire una siringa usa e getta da un millilitro con acqua distillata e utilizzare un tubo viton per collegare la siringa all'uscita di una sonda di microdialisi. Coprire manualmente i fori di sfiato e deprimere delicatamente lo stantuffo della siringa per infondere acqua alla sonda. Verificare che l'acqua appaia nell'ingresso della sonda e che vi sia una perdita sulla superficie della membrana di microdialisi.
Per attivare la sonda, immergere le membrane della sonda nel 70-100% di etanolo per due secondi, seguite da una seconda infusione di acqua distillata. Collegare un ago di connessione a una linea di ingresso e una linea di uscita e caricare una siringa monouso da tre millilitri con tampone perfusione preparato al momento. Collegare una siringa dotata di un ago con estremità smussata all'estremità di ingresso del tubo e utilizzare una pompa per siringhe per riempire l'intero tubo con tampone perfusione.
Quando il tubo è pieno, sostituire l'ago di connessione tra le linee di ingresso e uscita con la sonda di microdialisi attivata e il dado del cappuccio e montare un tubo a rulli nei tubi di uscita su una pompa a rulli. Avviare la pompa della siringa a 10 microlitri al minuto e la pompa a rulli a 9,5-9,8 microlitri al minuto. Ora posiziona il collare intorno al collo dell'animale impiantato di cannula guida anestetizzato e rimuovi il dado del cappuccio e la sonda fittizia.
Inserire lentamente la sonda di microdialisi attraverso la cannula guida e fissare il dado del cappuccio. Quindi, posizionare il mouse in una gabbia collegata a un sistema in movimento libero e collegare il mouse con il colletto. Dopo almeno un'ora, arrestare in sequenza la pompa a rulli e la pompa della siringa, riavviando le pompe con la pompa della siringa impostata al 20% più velocemente della pompa a rulli e posizionare l'estremità libera dei tubi di uscita su un raccoglitore di frazioni refrigerate per raccogliere l'ISF cerebrale.
Una volta ottenuto il volume sperimentale appropriato, rimuovere la sonda e gestire il recupero del mouse come appena dimostrato. Coerentemente con le osservazioni precedenti, quando la picrotossine micromolare viene somministrata tramite microdialisi inversa, come dimostrato nei topi C57B6J svegli, si osserva un aumento dei livelli di tau endogeni interstiziali rispetto ai livelli misurati negli animali trattati con un controllo del veicolo. Oltre alle somministrazioni di farmaci, la microdialisi può essere combinata con altri metodi in vivo come la registrazione EEG o l'optogenetica per rispondere a domande aggiuntive su come l'attività neuronale influenza la concentrazione del substrato in ISF.
