Name: a 3-dimensional (3d)-printed template for high throughput zebrafish embryo arraying
Uploaded: 2018-06-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 52 s
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Questo lavoro è stato supportato dal programma "gioventù 1000plan", i fondi di avvio da Università di Tongji e NSFC Grant # 21607115 e 21777116 (Lin).

1. progettazione e fabbricazione di un embrioni di Zebrafish Arraying modello
<ol><li>
Progettazione del modello di arraying con un 12 di 8, 96 pozzetti layout che si adatta una piastra a 96 pozzetti standard. Uso le dimensioni riportate in Figura 1A per l'alloggiamento di allettamento superiore dell'embrione (Vedi anche il File supplementare).
	<ol>
<li>Utilizzare le dimensioni riportate in Figura 1B e 1D per l'allettamento bene.</li>
		<li>Utilizzare le dimensioni in Figura 1 per la camera a vuoto inferiore.</li>
		<li>Utilizzare le dimensioni in Figura 1B per l'aria in / presa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilizzare una stampante 3D (con precisione di 0,1 mm) per stampare il modello; Vedi Tabella materiali per resina consigliata da utilizzare per la stampa. Nota: le stampanti 3D con una precisione di 0,1 mm sono raccomandate per la fabbricazione del modello arraying (Vedi Tabella materiali). Il colore suggerito per la superficie del modello è grigio scuro o nero.</li>
</ol>2. Zebrafish embrione deposizione delle uova
<ol><li>Posizionare due paia di pesce maschio e femmina per accoppiamento scatola un giorno prima della deposizione delle uova. Separati maschi e femmine da un divisorio in plastica trasparente.</li>
	<li>Togliere i divisori al mattino per mescolare pesce maschio e femmina.</li>
	<li>Togliere il pesce maschio e femmina e raccogliere embrioni di zebrafish usando un colino a maglia fine. Lavare gli embrioni con uovo 250 mL di acqua (Vedi Tabella materiali).</li>
	<li>Trasferire gli embrioni raccolti di Petri (diametro 90 mm) con soluzione di Holtfreter (Vedi Tabella materiali) e rimuovere embrioni morti e non fertilizzati usando uno stereomicroscopio.</li>
	<li>Posizionare gli embrioni in un incubatore di 28,5 ° C. A 4 h dopo fertilizzazione (hpf), osservare gli embrioni e rimuovere eventuali embrioni morti e malsane. Gli embrioni sono pronti per il passo successivo.</li>
</ol>3. preparazione di Arraying modello
<ol><li>Lavare il modello 2 – 3 volte con 500 mL di acqua deionizzata e metterlo in forno di essiccazione (45 ° C) per 5 min.</li>
	<li>La camera inferiore con un pezzo di pellicola (Figura 2passaggio 1) di tenuta del nastro.</li>
	<li>Collegare una pompa a vuoto attraverso l'uscita dell'aria nella parte inferiore del modello. Nota: Il vuoto max consigliato per la pompa del vuoto è 0.1 Mpa. Essere consapevole della forza del vuoto utilizzato. Se la pressione negativa è troppo forte, tagliare un buco a forma di croce sulla pellicola sigillante per abbassare la pressione.</li>
</ol>4. arraying embrioni di Zebrafish in una piastra a 96 pozzetti
<ol><li>Utilizzando una pipetta di trasferimento in plastica, inserire circa 150 embrioni nel modello, come dimostrato nella figura 2,, passo 2.</li>
	<li>Collegare la pompa a vuoto per la presa di aria per generare pressione negativa nell'alloggiamento sigillato con la pellicola sigillante in fase 3.3.</li>
	<li>Agitare l'intero modello orizzontalmente fino a quando ognuno ha anche un embrione intrappolato (Figura 2, passo 3). Nota: Se soluzione del Holtfreter si prosciuga prima che gli embrioni sono intrappolati in ciascun pozzetto, aggiungere soluzione di ulteriori Holtfreter nella camera di allettamento e ripetere questo passaggio.</li>
	<li>Scartare di supplementare Holtfreter soluzione e gli embrioni che non vengono intrappolati nei pozzetti (Figura 2, passaggio 4).</li>
	<li>Spegnere e scollegare la pompa del vuoto.</li>
	<li>Capovolgere una piastra a 96 pozzetti standard contro il modello (Figura 2, Step 5) e ruotare entrambi allo stesso tempo (Figura 2, passaggio 6).</li>
	<li>Toccare il fondo del modello o collegare l'aria presa a una spolverata di gas compresso possibile per trasferire gli embrioni tutti intrappolati dal modello per la piastra a 96 pozzetti (Figura 2, passaggio 6).</li>
	<li>Ripetere il passaggio 4.1 a 4,8 per preparare ulteriori piastre multi-pozzetto.</li>
	<li>Rimuovere la pellicola sigillante e lavare il modello 3 volte da cima a fondo con 500 mL di acqua deionizzata per un utilizzo futuro. Nota: Non utilizzare solventi organici, come l'etanolo, per pulire il modello.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li><li>Leslie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+larvae+could+help+to+personalize+cancer+treatments.">Zebrafish larvae could help to personalize cancer treatments.</a> Science. 357 (6353), 745-745 (2017).</li><li>Lin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+Transformation,+Speciation,+and+Hazard+Potential+of+Copper+Particles+in+a+Model+Septic+Tank+System+Using+Zebrafish+to+Monitor+the+Effluent.">Understanding the Transformation, Speciation, and Hazard Potential of Copper Particles in a Model Septic Tank System Using Zebrafish to Monitor the Effluent.</a> ACS Nano. 9 (2), 2038-2048 (2015).</li><li>Lin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspect+ratio+plays+a+role+in+the+hazard+potential+of+ceo2+nanoparticles+in+mouse+lung+and+zebrafish+gastrointestinal+tract.">Aspect ratio plays a role in the hazard potential of ceo2 nanoparticles in mouse lung and zebrafish gastrointestinal tract.</a> ACS Nano. 8 (5), 4450-4464 (2014).</li><li>Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+in+Scn1a+zebrafish+mutant+identifies+clemizole+as+a+potential+Dravet+syndrome+treatment.">Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment.</a> Nature Communications. 4, (2013).</li><li>Lin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+content+screening+in+zebrafish+speeds+up+hazard+ranking+of+transition+metal+oxide+nanoparticles.">High content screening in zebrafish speeds up hazard ranking of transition metal oxide nanoparticles.</a> ACS Nano. 5 (9), 7284-7295 (2011).</li><li>Kuipers, J., Kalicharan, R. D., Wolters, A. H. G., van Ham, T. J., Giepmans, B. N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+Scanning+Transmission+electron+microscopy+(nanotomy)+of+healthy+and+injured+zebrafish+brain.">Large-scale Scanning Transmission electron microscopy (nanotomy) of healthy and injured zebrafish brain.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).</li><li>Liu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Phenotype+Recognition+for+Zebrafish+Embryo+Based+In+vivo+High+Throughput+Toxicity+Screening+of+Engineered+Nano-Materials.">Automated Phenotype Recognition for Zebrafish Embryo Based In vivo High Throughput Toxicity Screening of Engineered Nano-Materials.</a> PLoS One. 7 (4), (2012).</li><li>Tu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+Categorization+and+Scoring+of+Solid,+Part-Solid+and+Non-Solid+Pulmonary+Nodules.">Automatic Categorization and Scoring of Solid, Part-Solid and Non-Solid Pulmonary Nodules.</a> in CT Images with Convolutional Neural Network. Scientific Reports. 7, 8533 (2017).</li><li>Mandrell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+zebrafish+chorion+removal+and+single+embryo+placement:+optimizing+throughput+of+zebrafish+developmental+toxicity+screens.">Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens.</a> Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 66-74 (2012).</li><li>Lin, S., Zhao, Y., Nel, A. E., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+An+in+vivo+model+for+nano+EHS+studies.">Zebrafish: An in vivo model for nano EHS studies.</a> Small. 9 (9-10), 1608-1618 (2013).</li></ol>

Gli autori hanno riempito un brevetto sul modello 3D-stampato descritto.

Ci sono due punti critici in questo protocollo che richiedono particolare attenzione per la corretta implementazione del modello di stampa 3D per arraying embrioni di zebrafish.
Il fattore più importante sul design del modello arraying è l'allettamento. Rende sicuro che c'è un solo embrione intrappolato in ciascun pozzetto, uno dovrebbe prestare particolare attenzione per il diametro e la profondità del pozzo allettamento e il diametro del foro passante. Il diametro consigliato è all'inte...

Come organismo modello popolare, zebrafish è ampiamente usato nei campi della medicina e tossicologia1,2,3,4. Rispetto alle piattaforme in vitro , zebrafish offrono molto maggiore complessità biologica che uno o due tipi di cellule non potevano offrire. Oltre ad essere un intero organismo modello, grande fecondità di zebrafish, rapido e simultaneo dello sviluppo embrionale e organo ad alta traslucenza hanno dato questo vantaggi unici di modello da utilizzarsi per tossicità su larga scala o farmaci/mescola5di screening. Le centinaia di embrioni prodotti da una coppia di zebrafish adulto ogni settimana superano tutti gli altri modelli animali intero e hanno reso adatto per screening su vasta scala.
Una procedura di screening tipica utilizzando zebrafish comporta una notevole quantità di lavoro manuale, ad esempio di zebrafish adulto deposizione delle uova, selezione degli embrioni e arraying embrioni in idonei contenitori dove sono sottoposti all'esposizione attraverso l'immersione in acqua. Lo sviluppo degli embrioni è monitorato e osservabile endpoint come anomalia, la schiusa e la mortalità sono spesso valutati manualmente e utilizzati come le identificazioni preliminari la tossicità di sostanze chimiche o indicazioni sull'efficacia del farmaci o composti. Per velocizzare la procedura di screening, approcci come l'imaging automatici e analisi di immagine computerizzata sono stati esplorati precedentemente. Ad esempio, microscopi ad alto contenuto funzionalità di imaging sono stati adattati per eseguire automatizzato del luminoso-campo o fluorescenza sugli embrioni di zebrafish alle varie fasi di sviluppo da 96/384 pozzetti6. Dispositivi microfluidici accoppiati con microscopi sono stati utilizzati per posizionare le larve di zebrafish tramite manipolazione corrente per l'imaging del cervello neuroni7. Questi approcci potrebbero migliorare sensibilmente l'efficienza delle acquisizioni di immagine rispetto al tradizionale funzionamento manuale. Inoltre, con gran numero di immagini viene generato, strumenti di analisi di immagine sono anche stati sviluppati per velocizzare l'elaborazione di dati, come dimostrato da Liu et al e Tu et al. 8 , 9.
Come aumenta il livello di velocità effettiva di analisi di formazione immagine e l'immagine, è diventato chiaro che il passaggio limitante per lo screening si trova nel processo di preparazione di embrioni di zebrafish per l'esposizione, che in genere significa arraying li in piastre da 96 o 384 pozzetti. Per risolvere questo passaggio di collo di bottiglia, Fixed-based robotics sono stati sviluppati da Mandrell et al. 10 e noi11 in precedenza per sostituire movimentazione manuale ma gli strumenti erano piuttosto sofisticato e c'è una curva di apprendimento profonda per implementare tali tecniche. Di conseguenza, per fornire un approccio easy-to-use diventa un fattore importante per migliorare ulteriormente il livello di velocità effettiva dello zebrafish screening ed è l'obiettivo principale di questo lavoro.
In questo lavoro, abbiamo progettato e fabbricato un embrione arraying modello di stampa 3D. Un modello di questo arraying è stato progettato per intrappolare embrione di pesce zebra in pozzetti che si adattano con una piastra a 96 pozzetti standard. Anziché selezionare embrioni e li arraying in singoli pozzetti uno per uno, uno potrebbe eseguire matrice e l'allettamento di embrione 96 tutti gli embrioni in una piastra a parete multipla in una sola volta. Utilizzando questo modello e il seguente protocollo, uno potrebbe aumentare significativamente l'efficienza di arraying embrioni in lastre multiparete, che a termine Spinta la capacità di screening almeno dieci volte, rispetto al funzionamento manuale. Il protocollo descritto di seguito include un disegno complessivo per la disposizione di modello, la deposizione delle uova di pesce zebra, raccolta degli embrioni e arraying. La figura 1 Mostra il disegno complessivo del modello arraying. La figura 2 Mostra una panoramica del protocollo dettagliata sull'utilizzo del modello descritto nelle parti 3 e 4.

<table><tbody><tr><td>Zebrafish Facility</td><td>Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd.</td><td>Z-A-S5</td><td></td></tr><tr><td>Mating box</td><td>Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wash Bottle, 500 ml</td><td>Sangon Biotech</td><td>F505001-0001</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Vetec</td><td>V900058-500G</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td><td>10016318</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td><td>20011160</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate&amp;nbsp;</td><td>Vetec</td><td>v900182-500G</td><td></td></tr><tr><td>Methylene Blue Hydrate</td><td>TCI</td><td>M0501</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td><td>10011008</td><td></td></tr><tr><td>Sea Salts</td><td>Instant Ocean</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>Pipetter</td><td>Fisherbrand</td><td>13-675M</td><td></td></tr><tr><td>Controlled Drop Pasteur Pipet</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-30</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>OLYMPUS</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Biochemical incubator</td><td>Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd.</td><td>LRH-250</td><td></td></tr><tr><td>3D printer</td><td>UnionTech</td><td>Lite600</td><td></td></tr><tr><td>Photosensitive resin</td><td>UnionTech</td><td>UTR9000</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum pump</td><td>Shanghai Yukang Scientific Instrument Co., Ltd.</td><td>SHB-IIIA</td><td></td></tr><tr><td>Adhesive PCR Plate Seals</td><td>Solarbio</td><td>YA0245</td><td></td></tr><tr><td>96 well plate</td><td>Costar</td><td>3599</td><td></td></tr><tr><td>Multi 8-channel pipette 30 - 300 &amp;mu;l</td><td>Eppendorf</td><td>3122000.051</td><td></td></tr><tr><td>Compressed Gas Duster</td><td>Shanghai Zhantu Chemical Co., Ltd.</td><td>ST1005</td><td></td></tr><tr><td>DI Water</td><td>Thermo</td><td>GenPure Pro UV/UF</td><td></td></tr><tr><td>Drying oven</td><td>Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd.</td><td>BPG-9106A</td><td></td></tr><tr><td>System water</td><td></td><td></td><td>Water out of the facility&amp;rsquo;s water system</td></tr><tr><td>Egg water</td><td></td><td></td><td>Dilute 60mg &amp;ldquo;Instant Ocean&amp;rdquo; sea salts and 0.25 mg/L methylene blue in 1 L DI water</td></tr><tr><td>Holtfreter&amp;rsquo;s solution</td><td></td><td></td><td>Dissolve 7.0 g Sodium chloride (NaCl), 0.4 g Sodium bicarbonate (NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;), 0.1 g Potassium Chloride (KCl), 0.235 g Calcium chloride (CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;.2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O) in 1.9 L DI water. Adjust pH to 7 using HCl and adjust volume to 2 L using Di water</td></tr></tbody></table>

a 3-dimensional (3d)-printed template for high throughput zebrafish embryo arraying

Zebrafish è che un organismo riconosciuto a livello mondiale di acqua dolce frequentemente utilizzato in biologia dello sviluppo, tossicologia ambientale e malattia umana campi di ricerca correlate. Grazie alle sue caratteristiche uniche, tra cui la grande fecondità, traslucidità dell'embrione, sviluppo rapido e simultaneo, ecc., embrioni di zebrafish sono spesso utilizzati per la valutazione della tossicità su larga scala di prodotti chimici e droghe/mescola lo screening. Una procedura di screening tipica prevede la deposizione delle uova di zebrafish adulto, selezione di embrioni e arraying gli embrioni in piastre multi-pozzetto. Da lì, gli embrioni sono sottoposti per l'esposizione e la tossicità del prodotto chimico, o l'efficacia dei farmaci/composti può essere valutato relativamente rapidamente basata su osservazioni fenotipiche. Tra questi processi, embrioni arraying sono uno dei passaggi più molto tempo e laboriosi che limita il livello di velocità effettiva. In questo protocollo, vi presentiamo un approccio innovativo che fa uso di un modello di arraying 3D-stampato accoppiato con manipolazione per accelerare questa laboriosa fase di vuoto. Il protocollo di questo documento descrive il disegno complessivo del modello arraying, una dettagliata messa a punto sperimentale e della procedura, seguita da risultati rappresentativi. Quando implementato, questo approccio dovrebbe rivelarsi vantaggioso in una varietà di applicazioni di ricerca utilizzando embrioni di zebrafish come soggetti di prova.

La figura 3 Mostra un tipico modello di arraying 3D-stampato. Questo modello utilizza resina fotosensibile come materia prima ed è stata fatta da una stampante 3D; per fornire un migliore contrasto con il colore di embrioni è stato applicato uno strato di vernice nera. La posizione di 96 pozzetti (12 da 8) è stata progettata per adattarsi con una piastra a 96 pozzetti standard. Allo stesso modo, un modello di ben (24 x 16) 384 potrebbe anche essere progett...

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A 3-dimensional 3D-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

Qui, presentiamo un protocollo per progettare e fabbricare un embrione di zebrafish arraying modello, seguita da una procedura dettagliata sull'uso di tale modello per throughput elevato zebrafish embrione arraying in una piastra a 96 pozzetti.

Un 3-dimensionale (3D)-stampato modello per High Throughput embrione di pesce zebra Arraying

The zebrafish is a globally recognized fresh water organism frequently used in developmental biology, environmental toxicology, and human disease related ...

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A 3-dimensional (3D)-printed Template for High Throughput Zebrafish Embryo Arraying

6.7K Views.  Tongji University. Qui, presentiamo un protocollo per progettare e fabbricare un embrione di zebrafish arraying modello, seguita da una procedura dettagliata sull'uso di tale modello per throughput elevato zebrafish embrione arraying in una piastra a 96 pozzetti.

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Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning fundamental developmental biology through to large-scale genetic and chemical screens. However, many experiments, especially those related to infection and xenograft models, rely on microinjection and imaging of embryos and larvae, which are laborious techniques that require skill and expertise. To improve the precision and throughput of current microinjection techniques, we developed a series of microstructured devices to orient and stabilize zebrafish embryos at 2 days post fertilization (dpf) in ventral, dorsal, or lateral orientation prior to the procedure. To aid in the imaging of embryos, we also designed a simple device with channels that orient 4 zebrafish laterally in parallel against a glass cover slip. Together, the tools that we present here demonstrate the effectiveness of photolithographic approaches to generate useful devices for the optimization of zebrafish techniques.

Microinjection of zebrafish embryos and larvae is a crucial but challenging technique used in many zebrafish models. Here, we present a range of microscale tools to aid in the stabilization and orientation of zebrafish for both microinjection and imaging.

Dispositivi microstrutturati Microinjection ottimizzata e Imaging delle larve di Zebrafish

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Ricerca

Biologia dello sviluppo

Surgical Size Reduction of Zebrafish for the Study of Embryonic Pattern Scaling

In the developmental process, embryos exhibit a remarkable ability to match their body pattern to their body size; their body proportion is maintained even in embryos that are larger or smaller, within certain limits. Although this phenomenon of scaling has attracted attention for over a century, understanding the underlying mechanisms has been limited, owing in part to a lack of quantitative description of developmental dynamics in embryos of varied sizes. To overcome this limitation, we developed a new technique to surgically reduce the size of zebrafish embryos, which have great advantages for in vivo live imaging. We demonstrate that after balanced removal of cells and yolk at the blastula stage in separate steps, embryos can quickly recover under the right conditions and develop into smaller but otherwise normal embryos. Since this technique does not require special equipment, it is easily adaptable, and can be used to study a wide range of scaling problems, including robustness of morphogen mediated patterning.&#160;

Here, we describe a method for reducing the size of zebrafish embryos without disrupting normal developmental processes. This technique enables the study of pattern scaling and developmental robustness against size change.

Riduzione delle dimensioni chirurgiche di zebrafish per lo studio della scala del modello embrionale

In the developmental process, embryos exhibit a remarkable ability to match their body pattern to their body size; their body proportion is maintained ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues or cells. A difficulty with imaging whole embryo development is that zebrafish embryos grow substantially in length. When mounted as regularly done in 0.3-1% low melt agarose, the agarose imposes growth restriction, leading to distortions in the soft embryo body. Yet, to perform confocal time-lapse microscopy, the embryo must be immobilized. This article describes a layered mounting method for zebrafish embryos that restrict the motility of the embryos while allowing for the unrestricted growth. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations. To demonstrate the usability of this method, whole embryo vascular, neuronal and muscle development was imaged in transgenic fish for 55 consecutive hours. This mounting method can be used for easy, low-cost imaging of whole zebrafish embryos using inverted microscopes without requirements of molds or special equipment.

This article describes a method to mount fragile zebrafish embryos for extended time-lapse confocal microscopy. This low-cost method is easy to perform using regular glass-bottom microscopy dishes for imaging on any inverted microscope. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations.

Un metodo di montaggio a strati per la microscopia confocale Time-Lapse estesa di embrioni di pesci zebra interi

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Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens. 

We demonstrate the application of image-based high-content screening (HCS) methodology to identify small molecules that can modulate the FGF/RAS/MAPK pathway in zebrafish embryos. The zebrafish embryo is an ideal system for in vivo high-content chemical screens. The 1-day old embryo is approximately 1mm in diameter and can be easily arrayed into 96-well plates, a standard format for high throughput screening. During the first day of development, embryos are transparent with most of the major organs present, thus enabling visualization of tissue formation during embryogenesis. The complete automation of zebrafish chemical screens is still a challenge, however, particularly in the development of automated image acquisition and analysis. We previously generated a transgenic reporter line that expresses green fluorescent protein (GFP) under the control of FGF activity and demonstrated their utility in chemical screens 1. To establish methodology for high throughput whole organism screens, we developed a system for automated imaging and analysis of zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in 96-well plates 2. In this video we highlight the procedures for arraying transgenic embryos into multiwell plates at 24hpf and the addition of a small molecule (BCI) that hyperactivates FGF signaling 3. The plates are incubated for 6 hours followed by the addition of tricaine to anesthetize larvae prior to automated imaging on a Molecular Devices ImageXpress Ultra laser scanning confocal HCS reader. Images are processed by Definiens Developer software using a Cognition Network Technology algorithm that we developed to detect and quantify expression of GFP in the heads of transgenic embryos. In this example we highlight the ability of the algorithm to measure dose-dependent effects of BCI on GFP reporter gene expression in treated embryos.

Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.

We report the development of a system for automated imaging and analysis of zebrafish transgenic embryos in multiwell plates. This demonstrates the ability to measure dose dependent effects of a small molecule, BCI, on Fibroblast Growth Factor reporter gene expression and provide technology for establishing high-throughput zebrafish chemical screens.

Sviluppo di imaging automatizzati e analisi chimiche per gli schermi zebrafish.

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A Simple and Effective Transplantation Device for Zebrafish Embryos

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex developmental processes. Zebrafish embryos are ideally suited for these manipulations since they are easily accessible, relatively large in size, and transparent. However, previously developed devices for cell removal and transplantation are cumbersome to use or expensive to purchase. In contrast, the transplantation device presented here is economical, easy to assemble, and simple to use. In this protocol, we first introduce the handling of the transplantation device as well as its assembly from commercially and widely available parts. We then present three applications for its use: generation of ectopic clones to study signal dispersal from localized sources, extirpation of cells to produce size-reduced embryos, and germline transplantation to generate maternal-zygotic mutants. Finally, we show that the tool can also be used for embryological manipulations in other species such as the Japanese rice fish medaka.

Embryological manipulations such as extirpation and transplantation of cells are important tools to study early development. This protocol describes a simple and effective transplantation device to perform these manipulations in zebrafish embryos.

Un dispositivo di trapianto semplice ed efficace per embrioni di zebrafish

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The Zebrafish Tol2 System: A Modular and Flexible Gateway-Based Transgenesis Approach

Fetal alcohol spectrum disorders (FASD) are characterized by a highly variable set of structural defects and cognitive impairments that arise due to prenatal ethanol exposure. Due to the complex pathology of FASD, animal models have proven critical to our current understanding of ethanol-induced developmental defects. Zebrafish have proven to be a powerful model to examine ethanol-induced developmental defects due to the high degree of conservation of both genetics and development between zebrafish and humans. As a model system, zebrafish possess many attributes that make them ideal for developmental studies, including large numbers of externally fertilized embryos that are genetically tractable and translucent. This allows researchers to precisely control the timing and dosage of ethanol exposure in multiple genetic contexts. One important genetic tool available in zebrafish is transgenesis. However, generating transgenic constructs and establishing transgenic lines can be complex and difficult. To address this issue, zebrafish researchers have established the transposon-based Tol2 transgenesis system. This modular system uses a multisite Gateway cloning approach for the quick assembly of complete Tol2 transposon-based transgenic constructs. Here, we describe the flexible Tol2 system toolbox and a protocol for generating transgenic constructs ready for zebrafish transgenesis and their use in ethanol studies.

This work describes a protocol for the modular Tol2 transgenesis system, a gateway-based cloning method to create and inject transgenic constructs into zebrafish embryos.

Il sistema Zebrafish Tol2: un approccio di transgenesi modulare e flessibile basato su gateway

Fetal alcohol spectrum disorders (FASD) are characterized by a highly variable set of structural defects and cognitive impairments that arise due to ...

<meta charset="utf8"></head><body>Protocollo di microscopia a foglio luminoso multiview perfezionato per embrioni di zebrafish

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<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Strategie per il montaggio di embrioni di zebrafish per la microscopia a foglio luminoso multivista ad alta risoluzione - Tecniche per l'ima

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Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are frequently used to identify chemicals that modulate gene expression. Chemical screens that assay fluorescence in live zebrafish often rely on expensive, specialized equipment for high content screening. We describe a procedure using a standard epifluorescence microscope with a motorized stage to automatically image zebrafish embryos and detect tissue-specific fluorescence. Using transgenic zebrafish that report estrogen receptor activity via expression of GFP, we developed a semi-automated procedure to screen for estrogen receptor ligands that activate the reporter in a tissue-specific manner. In this video we describe procedures for arraying zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in a 96-well plate and adding small molecules that bind estrogen receptors. At 72-96 hpf, images of each well from the entire plate are automatically collected and manually inspected for tissue-specific fluorescence. This protocol demonstrates the ability to detect estrogens that activate receptors in heart valves but not in liver.

Described here is a protocol for semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos.

Imaging semi-automatico di fluorescenza tessuto-specifica in embrioni di zebrafish

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

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