La tecnica consente di studiare la funzione e la gamma delle molecole di segnalazione durante l'embriogenesi trapiantando sorgenti di segnalazione ectopica. Facilita anche la generazione efficiente di mutanti germinali. Il protocollo può essere applicato agli embrioni di zebrafish e medaka allo stadio di blastula, e probabilmente anche ad altri stadi embrionali e specie di TDO.
Per assemblare il dispositivo di trapianto, collegare una siringa a tenuta di gas da 25 microlitri a punta di esca a un supporto per micro pipetta utilizzando il raccordo di blocco dell'esca. Quindi montare il dispositivo direttamente su un micropolatore manuale. Per utilizzare il dispositivo di trapianto, posizionare il micropolatore con il dispositivo assemblato accanto a uno stereomicroscopio.
Quindi rimuovere lo stantuffo e inserire l'ago da trapianto. Abbassare l'ago in un piatto riempito con la soluzione di Ringer con un angolo di 45 gradi fino a quando la punta dell'ago è immersa. Inserire lo stantuffo circa a metà strada per scovare le soluzioni del Ringer, lasciando solo un piccolo volume d'acqua nella sottile parte affusolata dell'ago.
Quando si utilizza un ago da trapianto per la prima volta, rivestire l'interno dell'ago estraendo il giogo da un embrione sacrificato ed espellendo completamente il materiale del giogo. Successivamente, utilizzando un ago da trapianto, posizionare delicatamente l'embrione donatore, quindi posizionare l'apertura dell'ago ortogonale sulla superficie dell'embrione e tirare con attenzione lo stantuffo per attirare le cellule nell'ago. Una volta che il numero desiderato di cellule viene aspirato, interrompere l'aspirazione spingendo delicatamente lo stantuffo verso il basso e rimuovere l'ago dall'embrione scuotendo l'ago di lato in un movimento breve e rapido.
Lasciare un po 'di soluzione di Ringer su entrambi i lati della colonna cellulare limitando le cellule all'estremità affusolata dell'ago. Eliminare eventuali tuorli o detriti cellulari rimanenti muovendo lentamente lo stantuffo su e giù e lavando le cellule con la soluzione di Ringer. Quindi, spostare la piastra di trapianto con la mano non dominante per posizionare l'ago ortogonale sulla superficie dell'embrione ospite.
Applicare una leggera pressione sull'embrione schiacciandolo con cura contro le pareti. Quindi, con un rapido movimento brusco, perforare lo strato avvolgente dell'embrione ospite facendo attenzione a non graffiare il tuorlo con l'ago. Una volta che l'ago è all'interno, spingere delicatamente lo stantuffo per estrudere la colonna di cellule nell'embrione e lentamente ritrarre l'ago contemporaneamente.
Per il trapianto di cellule germinali, riempire un piatto di trapianto con la soluzione di Ringer, quindi trasferire la sfera decorionata per gli embrioni di stadio a cupola nel piatto di trapianto e posizionare gli embrioni dell'ospite e del donatore in colonne alternate per trapiantare le cellule da un embrione donatore a sei diversi embrioni ospiti. Per effettuare il trapianto, orientare gli embrioni con il margine verso l'ago del trapianto. Per il trapianto germinale, prelevare le cellule sorgente dal margine e depositarle nella stessa posizione nell'embrione ospite.
Una volta completato il trapianto, lasciare che l'embrione si riprenda nella soluzione di Ringer per 30 minuti a un'ora. Quindi, utilizzando uno stereomicroscopio a fluorescenza, esaminare le cellule trapiantate. Successivamente, trasferire gli embrioni in una piastra rivestita di agarosio a 24 pozzetti con mezzo embrionale che raggruppa tutti gli embrioni ospiti che hanno ricevuto cellule dallo stesso donatore nello stesso pozzo.
Quindi incubare gli embrioni a 28 gradi Celsius fino al giorno successivo. Se necessario, trasferire gli embrioni donatori in strisce PCR etichettate per la genotipizzazione. 30 ore dopo la fecondazione, esaminare gli embrioni ospiti per trapianti germinali di successo sotto uno stereomicroscopio a fluorescenza.
Le cellule germinali dovrebbero essere presenti al solco sopra l'estensione del tuorlo. Coltiva la larva trapiantata con successo in cappuccio adulto secondo le condizioni di allevamento standard. Nei trapianti di successo, l'embrione sembra normale e simile nella forma e nella chiarezza del tuorlo agli embrioni non trapiantati senza grandi lacrime nel blastoderma.
Al contrario, se un embrione è visibilmente danneggiato durante il trapianto, non si svilupperà normalmente. Sebbene il dispositivo di trapianto sia stato utilizzato principalmente su embrioni di zebrafish nelle fasi di blastula, il trapianto e l'estirpazione cellulare possono essere effettuati anche in embrioni di stadio di blastula decorionati del pesce riso giapponese medaka. Nel caso specifico del trapianto germinale, un buon trapianto si traduce in un embrione con una lunga colonna orizzontale di cellule direttamente sopra il margine del tuorlo.
Tuttavia, il successo della procedura può essere valutato solo dopo 24-30 ore di fecondazione quando le cellule germinali sono distinte nella loro fluorescenza dalle cellule somatiche. Le cellule germinali primordiali appariranno come piccole sfere fluorescenti nel solco direttamente sopra l'estensione del tuorlo. La presenza di queste cellule germinali nella posizione corretta indica il successo del trapianto germinale.
Esempi di trapianti non riusciti sono mostrati qui. Nel primo esempio, sebbene le cellule germinali abbiano raggiunto il mesoderma gonadico, poiché l'embrione ospite è gravemente deformato, non si svilupperà normalmente. Nel secondo esempio, le celle fluorescenti vengono rilevate solo al di fuori del solco.
Queste cellule sono cellule somatiche o cellule germinali che non sono riuscite a migrare correttamente. Ed entrambi i tipi di cellule non contribuiranno alla linea germinale dell'embrione. È fondamentale evitare danni alle cellule trapiantate e all'embrione ospite.
Le cellule devono essere estratte lentamente, essere ripulite da qualsiasi tuorlo rimanente ed essere inserite con attenzione. Questo metodo fornisce un modo semplice per trapiantare cellule in embrioni di zebrafish e sarà utile per generare fonti ectopiche e mutanti germinali. Il vantaggio principale di questo dispositivo, è a basso costo, ed è molto e utilizza.
