Gli autori ringraziano la d. ssa Jennifer Yang e Kauffman Alexander (Sasha) per assistenza tecnica con questa tecnica, come pure numerose discussioni utili e critiche. Analisi dell'ormone del siero sono state effettuate da Yang et al., 2017 presso The University of Virginia Center for Research in riproduzione Ligand Assay e analisi Core, supportato da Eunice Kennedy Shriver NICHD/NIH (NCTRI) Grant P50-HD28934.
Fonti di sostegno alla ricerca: R01 NICHD 86100 (KMB), RBM è stata sostenuta da T32 NICHD 007203.

Il metodo qui descritto è in accordo con gli istituti nazionali di salute Animal Care e linee guida sull'uso e sono state autorizzate dal comitato di impiego presso l'Università di California, San Diego e istituzionali Animal Care.
1. acclimatazione alla movimentazione
<ol><li>Procedura di gestione dei<ol>
<li>Del mouse posto gabbie nella cappa di biosicurezza. Rimuovere il primo mouse dalla gabbia e posto su una superficie idonea (ad es. un coperchio gabbia pulita) all'interno della cappa di biosicurezza.</li>
		<li>Frenare dolcemente il mouse sul piano di lavoro tenendo la base della coda con il dito indice e il pollice di una mano. Quindi, saldamente corsa la superficie ventrale della coda, dalla base fino alla punta della coda, con l'indice e il pollice di altra mano. Ripetere l'operazione che segna 6 volte (cioè 1 insieme) e tornare il mouse alla sua gabbia.</li>
		<li>Attendere 6 min e ripetere il punto 1.1.2. Nota: In totale, passo 1.1.2 verrà ripetuto 4 volte per topo (cioè 4 gruppi di 6 colpi), così che ogni mouse riceverà un totale di 24 colpi di coda ogni giorno di trattamento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>La frequenza di maneggiamento quotidiano<ol>
<li>Da cinque fino a due settimane prima del giorno di raccolta di sangue prevista, è necessario gestire topi come descritto al punto 1.1, cinque giorni alla settimana (topi non vengono gestiti il sabato o la domenica fino alle ultime due settimane di acclimatazione).</li>
		<li>Se il trattamento sperimentale durante il periodo di campionamento includerà qualsiasi movimentazione aggiuntiva (ad esempio scruffing o iniezione intraperitoneale), acclimatare i topi a questa attività di manipolazione durante ogni sessione di trattamento. Nota: Per l'acclimatazione alle procedure di iniezione, utilizzare un ago smussato per eseguire una finta iniezione.</li>
		<li>Durante le due settimane prima del giorno di raccolta di sangue prevista, è necessario gestire topi come descritto in 1.1, sette giorni alla settimana.</li>
		<li>Almeno due settimane prima del giorno di raccolta di sangue prevista, casa topi a coppie per minimizzare le interruzioni ai topi durante il campionamento.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparazione di provette per prelievo ematico
<ol><li>Preparare il tampone di dosaggio ultrasensibile LH in bottiglia di vetro: 0,2% di albumina di siero bovino e 0.05% Tween-20 in PBS [0,2 g KCl, 8 g NaCl, 1,44 g Na2HPO4 (anidro), 0,24 g KH2PO4, acqua ultrapura a 1 L, pH 7.4, filtro e autoclave] , conservare a 4° C. 1 Nota: Volume di tampone di dosaggio ultrasensibile LH essere preparati può essere calcolato basato sul numero di campioni e il volume per esempio come indicato di seguito (2.2 & discussione)</li>
	<li>Preparare le provette per prelievo ematico (microcentrifuga 0,6 mL). Tubi e tampone aliquota etichette (57 µ l di tampone per tubo; notare, questo volume può variare a seconda del volume di sangue prelevato o il rapporto del sangue per il buffer desiderato). Tubi può essere preparato giorni prima del campionamento, conservare a 4 ° C.</li>
</ol>3. prelievo sangue
<ol><li>Preparazione di materiali di raccolta del sangue.<ol>
<li>Preparare il gabinetto di biosicurezza per l'uso e organizzare i seguenti materiali nella cappa o su un carrello è vicino a: 10 µ l (set di 3 µ l o volume di raccolta di sangue desiderata), puntali di pipetta, Pattumiera per puntali usati, timer, stampa con numero di animali e campione numeri ( per le note relative ai problemi di campionamento o animale), ghiaccio secchio con tubi di raccolta sangue, forbici e piccola garza (2 "x 2"). Nota: Il "contare" funzione su un timer di laboratorio è utile perché non ha un allarme acustico che potrebbe disturbare i topi</li>
		<li>Utilizzare un pennarello per segnare la coda di ogni mouse (vicino alla base) per semplificare l'identificazione rapida del mouse corretto durante il campionamento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ritaglio della preparazione coda e pre-sangue raccolta.<ol>
<li>A 45 min prima dell'inizio della raccolta sangue, rimuovere il primo mouse dalla sua gabbia e posto su una superficie adatta (un coperchio gabbia pulita funziona bene) all'interno della biosicurezza armadietto.</li>
		<li>Usare le forbici taglienti, sterile per rimuovere 1-2 mm della punta della coda di topo, seguendo la preparazione asettica (cioè strofinare con alcol e betadine). Nota: Questo può essere ottenuto in animali svegli con dolce fermo o nell'ambito dell'anestesia isoflurano.  Inoltre, l'analgesia essere effettuato seguendo la raccomandazione del IACUC locale.</li>
		<li>Corsa con attenzione la coda del mouse, come descritto in precedenza (1.1.2; 1-2 colpi sono generalmente sufficienti) fino a quando la goccia di forme di sangue sulla punta della coda.</li>
		<li>Utilizzare una pipetta con punta pulita per raccogliere 3 µ l di sangue dalla punta della coda ed eliminare il puntale della pipetta con sangue.</li>
		<li>Prima di restituire il mouse alla sua gabbia, garantire che il flusso di sangue è stata interrotta. Se necessario, applicare una leggera pressione con una garza sterile.</li>
		<li>Ripetere i passaggi 3.2.1 - 3.2.5 per tutti i topi. Campioni di sangue successive possono essere raccolti da saldamente carezze coda di topo fino a una gocciolina di forme di sangue sulla punta della coda. Nota: Se una gocciolina di sangue non forma dopo colpi di fermi, la coda può essere tamponò con una garza imbevuta di soluzione fisiologica. I grumi sono più propensi a forma durante il campionamento meno frequente (cioè > intervalli di 15 min). Una volta che il coagulo è cancellato dalla vena, il campionamento può continuare.</li>
		<li>Continuare a raccogliere 3 µ l di sangue da ogni mouse come descritto sopra ogni 6 min per circa 45 min durante questo periodo di preparazione del pre-sangue raccolta. Eliminare la punta di sangue e pipetta.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prelievo di sangue<ol>
<li>Raccogliere 3 µ l di sangue dalla punta della coda come descritto sopra. Prendere le dovute precauzioni per assicurare che l'intero campione di 3 µ l si tenga la punta della pipetta (senza bolle o contaminazione di biancheria da letto). Espellere il campione di sangue nel tampone in una provetta etichettata. Mescolare per inversione e tornare il tubo al ghiaccio.</li>
		<li>Prima di restituire il mouse alla sua gabbia, garantire che il flusso sanguigno ha smesso. Se necessario, applicare una leggera pressione con una garza sterile.</li>
		<li>Ripetere i passaggi 3.3.1 - 3.3.2 per ogni mouse, ogni 6 min, per la durata di campionamento predeterminati. Monitorare ogni animale per segni di sofferenza (per esempio parzialmente chiuse le palpebre, posizione ricurva [non causato da altro trattamento] o mancanza di risposta al trattamento) e terminare il campionamento, se necessario. Nota: Disagio comportamentale o altre complicazioni che richiedono la risoluzione di campionamento si presentano estremamente raramente nel nostro laboratorio.</li>
		<li>Se gli animali non sono euthanized dopo prelievo di sangue, è necessario garantire che il flusso di sangue dalla punta della coda è interrotto completamente. Pulire qualsiasi sangue versato dall'interno di ogni animale in gabbia (o cambiamento gabbie) e restituire le gabbie degli animali alla cremagliera di alloggiamento.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. l'elaborazione e l'analisi del campione
<ol><li>Conservare i campioni di sangue a-20 ° C fino all'analisi. Nota: Il LH è analizzata in campioni di sangue intero diluiti in tampone del saggio; Nessuna separazione del siero o del plasma è necessaria prima del deposito o analisi.</li>
	<li>I campioni di sangue di dosaggio ultrasensibile Elisa come descritto in precedenza i valori1 e relazione in ng/mL di sangue intero dopo la correzione per la diluizione del volume campione nel tampone.</li>
	<li>Identificare gli impulsi LH nel set di dati. Calcolare e confrontare Ampiezza impulso media e frequenza dell'impulso (o intervallo di Inter-impulso) come appropriato per il set di dati. Nota: Criteri pubblicati13,14 e programmi, sono disponibili15,16 per il rilevamento di impulsi di LH.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Steyn, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+methodology+for+and+assessment+of+pulsatile+luteinizing+hormone+secretion+in+juvenile+and+adult+male+mice.">Development of a methodology for and assessment of pulsatile luteinizing hormone secretion in juvenile and adult male mice.</a> Endocrinology. 154 (12), 4939-4945 (2013).</li><li>McArdle, C. A., Roberson, M. S., Plant, T. M., Zeleznik, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Knobil and Neill's Physiology of Reproduction. , (2015).</li><li>Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+sample+collection+in+small+laboratory+animals.">Blood sample collection in small laboratory animals.</a> Journal of Pharmacology and Pharmacotherapy. 1 (2), 87-93 (2010).</li><li>Steiner, R. A., Bremner, W. J., Clifton, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+luteinizing+hormone+pulse+frequency+and+amplitude+by+testosterone+in+the+adult+male+rat.">Regulation of luteinizing hormone pulse frequency and amplitude by testosterone in the adult male rat.</a> Endocrinology. 111 (6), 2055-2061 (1982).</li><li>Moore, A. M., Prescott, M., Marshall, C. J., Yip, S. H., Campbell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+a+robust+arcuate+GABAergic+input+to+gonadotropin-releasing+hormone+neurons+in+a+model+of+polycystic+ovarian+syndrome.">Enhancement of a robust arcuate GABAergic input to gonadotropin-releasing hormone neurons in a model of polycystic ovarian syndrome.</a> Proceedings of National Academy of Science U S A. 112 (2), 596-601 (2015).</li><li>Czieselsky, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulse+and+Surge+Profiles+of+Luteinizing+Hormone+Secretion+in+the+Mouse.">Pulse and Surge Profiles of Luteinizing Hormone Secretion in the Mouse.</a> Endocrinology. 157 (12), 4794-4802 (2016).</li><li>Campos, P., Herbison, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+activation+of+GnRH+neurons+reveals+minimal+requirements+for+pulsatile+luteinizing+hormone+secretion.">Optogenetic activation of GnRH neurons reveals minimal requirements for pulsatile luteinizing hormone secretion.</a> Proceedings of National Academy of Science U S A. 111 (51), 18387-18392 (2014).</li><li>Yang, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Psychosocial+Stress+Inhibits+LH+Pulsatility+and+Kiss1+Neuronal+Activation+in+Female+Mice.">Acute Psychosocial Stress Inhibits LH Pulsatility and Kiss1 Neuronal Activation in Female Mice.</a> Endocrinology. 158 (11), 3716-3723 (2017).</li><li>Clarkson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definition+of+the+hypothalamic+GnRH+pulse+generator+in+mice.">Definition of the hypothalamic GnRH pulse generator in mice.</a> Proceedings of National Academy of Science U S A. 114 (47), E10216-E10223 (2017).</li><li>Lewis, V. J., Thacker, W. L., Mitchell, S. H., Baer, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+technic+for+obtaining+blood+from+mice.">A new technic for obtaining blood from mice.</a> Laboratory Animal Science. 26 (2 Pt 1), 211-213 (1976).</li><li>Abatan, O. I., Welch, K. B., Nemzek, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+saphenous+venipuncture+and+modified+tail-clip+blood+collection+in+mice.">Evaluation of saphenous venipuncture and modified tail-clip blood collection in mice.</a> Journal of the American Association of Laboratory Animal Science. 47 (3), 8-15 (2008).</li><li>Durschlag, M., Wurbel, H., Stauffacher, M., Von Holst, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeated+blood+collection+in+the+laboratory+mouse+by+tail+incision--modification+of+an+old+technique.">Repeated blood collection in the laboratory mouse by tail incision--modification of an old technique.</a> Physiology and Behavior. 60 (6), 1565-1568 (1996).</li><li>Goodman, R. L., Karsch, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulsatile+secretion+of+luteinizing+hormone:+differential+suppression+by+ovarian+steroids.">Pulsatile secretion of luteinizing hormone: differential suppression by ovarian steroids.</a> Endocrinology. 107 (5), 1286-1290 (1980).</li><li>Clarke, I. J., Cummins, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+gonadotropin-releasing+hormone+pulse+frequency+associated+with+estrogen-induced+luteinizing+hormone+surges+in+ovariectomized+ewes.">Increased gonadotropin-releasing hormone pulse frequency associated with estrogen-induced luteinizing hormone surges in ovariectomized ewes.</a> Endocrinology. 116 (6), 2376-2383 (1985).</li><li>Vidal, A., Zhang, Q., Medigue, C., Fabre, S., Clement, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DynPeak:+an+algorithm+for+pulse+detection+and+frequency+analysis+in+hormonal+time+series.">DynPeak: an algorithm for pulse detection and frequency analysis in hormonal time series.</a> PLoS One. 7 (7), e39001 (2012).</li><li>Merriam, G. R., Wachter, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Algorithms+for+the+study+of+episodic+hormone+secretion.">Algorithms for the study of episodic hormone secretion.</a> American Journal of Physiology. 243 (4), E310-E318 (1982).</li><li>Xie, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Deletion+of+Ghrelin-O-Acyltransferase+on+the+Pulsatile+Release+of+Growth+Hormone+in+Mice.">Effect of Deletion of Ghrelin-O-Acyltransferase on the Pulsatile Release of Growth Hormone in Mice.</a> Journal of Neuroendocrinology. 27 (12), 872-886 (2015).</li><li>Koch, C. E., Leinweber, B., Drengberg, B. C., Blaum, C., Oster, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+circadian+rhythms+and+stress.">Interaction between circadian rhythms and stress.</a> Neurobiology of Stress. 6, 57-67 (2017).</li><li>Tuli, J. S., Smith, J. A., Morton, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corticosterone,+adrenal+and+spleen+weight+in+mice+after+tail+bleeding,+and+its+effect+on+nearby+animals.">Corticosterone, adrenal and spleen weight in mice after tail bleeding, and its effect on nearby animals.</a> Laboratory Animal. 29 (1), 90-95 (1995).</li><li>. Animal Welfare Inspection Guide Available from: <a target="_blank" href="https://www.aphis.usda.gov/animal_welfare/downloads/Animal-Care-Inspection-Guide.pdf">https://www.aphis.usda.gov/animal_welfare/downloads/Animal-Care-Inspection-Guide.pdf</a> (2017)</li><li>Steyn, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+method+for+the+determination+of+pulsatile+growth+hormone+secretion+in+mice.">Development of a method for the determination of pulsatile growth hormone secretion in mice.</a> Endocrinology. 152 (8), 3165-3171 (2011).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Qui descriviamo un protocollo per la raccolta di sangue frequenti tutta la punta della coda dei campioni di sangue per la valutazione della secrezione pulsatile di LH in topi. Questo protocollo consente il prelievo di campioni per il rilevamento di cambiamenti acuti nella pulsatile secrezione del LH dopo esposizione a stress psicosociale ed è particolarmente adatto per la valutazione degli impulsi LH sotto altre manipolazioni acute o croniche.
Un componente critico di questo protocollo per la...

Funzione della gonade in mammiferi dipende dalla secrezione della gonadotropina, ormone luteinizzante (LH) e follicolo-stimolante ormone, da parte della ghiandola pituitaria. Le gonadotropine sono secernute in entrambi un motivo pulsatile o sovratensioni in risposta alla secrezione ipotalamica di GnRH (GnRH). La sintesi e la secrezione di LH e di FSH sono regolati tramite azione endocrini, paracrini e autocrini da una varietà di molecole tra cui GnRH ipotalamico, ormoni steroidi gonadici e il sistema di activina-inhibin-follistatina, come pure una miriade di condizioni fisiologiche tra cui lo stress e del bilancio energetico. 2
Il modello pulsatile di LH nel sangue nasce da uno scarico piuttosto brusco di LH nel sangue periferico, seguita da circa esponenziale eliminazione. Importanti caratteristiche del modello includono la frequenza di ogni scarico di LH e l'ampiezza della risposta LH, entrambi i quali sono dettati, in parte, dal rilascio di GnRH. dovuta alla difficoltà nel raccogliere il sangue portale ipotalamo-ipofisario per la misura di GnRH pulsante, il campionamento e la misurazione di LH è usata come un proxy GnRH regolazione dell'asse ipotalamo-ipofisi-gonadi. Di conseguenza, le informazioni critiche sono codificate nella frequenza e l'ampiezza degli impulsi di LH, che non può essere determinata da un singolo campione.
Analisi della secrezione pulsatile di LH sono stato storicamente limitato ai grandi mammiferi (esseri umani, primati e pecore) a causa del loro sangue grande volume e tolleranza per la raccolta del campione di sangue frequenti. Nei roditori, prelievo di sangue frequenti era limitato al ratto e raggiunto tramite indwelling catetere atriale. 3 , 4 il relativamente basso costo e la disponibilità di genetica (ad es. cre-lox, CRISPR) e manipolazioni complesse circuito neurale (per esempio optogenetica, chemogenetics) rendono topi un organismo modello attraente; Tuttavia, realizzazione di campioni di sangue frequenti e successiva analisi delle concentrazioni di LH è fino a recentemente, dimostrato sfuggente. Tale compito monumentale è stata introdotta da Steyn e colleghi di lavoro. 1 da allora, diversi laboratori hanno iniziato a utilizzare frequenti prelievi e analisi di LH ultra-sensibili per valutare pulsatile secrezione del LH in una varietà di paradigmi sperimentali. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 si noti che il perseguimento di un metodo pratico di raccogliere più campioni di sangue dai topi è stato in corso per almeno 40 anni10 con più perfezionamenti fatto lungo la strada. 11 , 12
Valutazione dei modelli di impulso del LH (cioè frequenza e ampiezza) rappresenta un importante affinamento in monitoraggio secrezione della gonadotropina basale in questo modello animale geneticamente trattabile. Tradizionalmente, le concentrazioni di LH in topi sono state determinate in un campione di sangue. Una debolezza di singolo-punto campioni è un set di dati altamente variabile perché le concentrazioni di LH sono naturalmente fluttuanti durante ogni impulso. Un altro punto debole è che misure isolate perdere intrinsecamente critiche informazioni veicolate dai pattern di secrezione di impulso del LH. Così, un metodo per la raccolta di campioni di sangue frequenti a comportarsi liberamente, topi sfrenati (ad eccezione di manipolazione delicata durante il campionamento) fornirà informazioni avanzate e rivelarsi utili per molti laboratori indagando la regolazione dell'ormone pulsatile.
Qui, descriviamo un protocollo per la raccolta di frequente (ogni 6 min) campioni dai topi svegli, sfrenati di sangue. D'importanza, includiamo una gestione protocollo di acclimatazione che consente per rilevamento affidabile e continuo della secrezione pulsatile di LH in campioni di sangue intero raccolti nel corso di un periodo di tempo in cui pre- e Post-assesment ad una sfida acuta può essere determinato, come la risposta allo stress psicosociale di immobilizzazione e contenimento. Un dosaggio efficace per le concentrazioni di LH da campioni di sangue intero è stato descritto in precedenza; 1 il presente protocollo è focalizzato su un metodo per raccogliere i campioni di sangue per la misura di impulso del LH.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="638">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Biosaftey cabinet</td>
			<td style="width:121px;">Lab Products Inc</td>
			<td style="width:119px;">L/F-B</td>
			<td style="width:183px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A5403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2HPO4 (anhydrous)</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultrapure water</td>
			<td style="width:121px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Purified and filtered water</td>
		</tr>
		<tr height="92">
			<td height="92" style="height:92px;width:216px;">Broome Rodent Restraint Device</td>
			<td style="width:121px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:119px;">52-0460</td>
			<td style="width:183px;">Not necessary for blood collection, but were used in the collection of representative data.</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:216px;">DynPeak</td>
			<td style="width:121px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td style="width:183px;">http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0039001</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

frequent tail-tip blood sampling in mice for the assessment of pulsatile luteinizing hormone secretion

In molti sistemi endocrini, ormoni o fattori circolanti non vengono rilasciati continuamente, ma sono secreti come impulsi discreti in risposta ad un fattore di rilascio. Singolo punto di campionamento misure non siano sufficienti comprendere appieno il significato biologico di modello secretivo di ormoni pulsatile o in condizioni fisiologiche normali, o anche durante condizioni della disregolazione. Ormone luteinizzante (LH) è sintetizzata dalle cellule gonadotrope pituitaria anteriore e secreta in un modello pulsatile che richiede frequente raccolta di campioni di sangue per la valutazione del polso. Questo non è stato possibile nei topi fino a recentemente, a causa dello sviluppo di un dosaggio di LH di alto-sensibilità e avanzamento in una tecnica per frequente campionario a basso volume, inizialmente descritto da Steyn e colleghi. 1 qui descriviamo un protocollo per la raccolta del campione di sangue periferico frequenti da topi con sufficiente acclimatazione di movimentazione per rilevare pulsatile secrezione di LH. L'attuale protocollo i dettagli di un periodo di acclimatazione espanso che permette la valutazione di impulsi robusti e continui di LH nel corso di più ore. In questo protocollo, la punta della coda viene ritagliata e sangue raccolti dalla coda utilizzando una pipetta tenuto in mano. Per la valutazione di LH pulsatile in topi gonadectomized, campioni di serie sono raccolti ogni 5-6 minuti per un minimo di 90-180 d'importanza, la raccolta di sangue e misurazione di impulsi robusti di LH può essere realizzati in topi svegli, liberamente si comporta, dati adeguata manipolazione acclimatazione e lo sforzo per ridurre al minimo i fattori di stress ambientale. Sufficiente acclimatazione può essere raggiunto entro 4-5 settimane prima della raccolta del sangue. Questo protocollo evidenzia progressi nella metodologia per garantire la raccolta di campioni di sangue intero per la valutazione dei pattern di secrezione LH pulsatile sopra più ore nel topo, un potente modello animale per la ricerca della neuroendocrina.

Rappresentante modelli impulso del LH 4 topi sono illustrati nella Figura 1 (dati ristampati da Yang et al., 2017). LH è stata misurata in campioni di sangue frequenti per determinare la risposta ad una sfida sforzo psicosociale acuto. Topi C57/Bl6 femminili adulti erano ovariectomizzati e gestiti come dettagliate nel presente protocollo per la raccolta del sangue frequenti. I campioni di sangue sono stati raccolti per i primi 90 min in tutti gli an...

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Frequent Tail-tip Blood Sampling in Mice for the Assessment of Pulsatile Luteinizing Hormone Secretion

Qui presentiamo un protocollo di campionamento di sangue punta della coda per la raccolta del campione di frequente nei topi sfrenati. Questo metodo è utile per la valutazione dei modelli di secrezione pulsatile dell'ormone luteinizzante e potrebbe essere adattato per l'analisi di altri fattori circolanti.

Frequenti prelievi di punta della coda in topi per la valutazione della secrezione Pulsatile dell'ormone luteinizzante

In many endocrine systems, circulating factors or hormones are not released continuously, but are secreted as a discrete pulse in response to a releasing ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.6K Views.  University of California, San Diego School of Medicine. Qui presentiamo un protocollo di campionamento di sangue punta della coda per la raccolta del campione di frequente nei topi sfrenati. Questo metodo è utile per la valutazione dei modelli di secrezione pulsatile dell'ormone luteinizzante e potrebbe essere adattato per l'analisi di altri fattori circolanti.

Video: Frequent Tail-tip Blood Sampling in Mice for the Assessment of Pulsatile Luteinizing Hormone Secretion

Assessment of Motor Balance and Coordination in Mice using the Balance Beam

Brain injury, genetic manipulations, and pharmacological treatments can result in alterations of motor skills in mice. Fine motor coordination and balance can be assessed by the beam walking assay. The goal of this test is for the mouse to stay upright and walk across an elevated narrow beam to a safe platform. This test takes place over 3 consecutive days: 2 days of training and 1 day of testing. Performance on the beam is quantified by measuring the time it takes for the mouse to traverse the beam and the number of paw slips that occur in the process. Here we report the protocol used in our laboratory, and representative results from a cohort of C57BL/6 mice. This task is particularly useful for detecting subtle deficits in motor skills and balance that may not be detected by other motor tests, such as the Rotarod.

Deficits in fine motor coordination can be assessed with the balance beam test. Performance on the beam is quantified by the speed at which the beam is traversed and the number of times the mouse slips on the beam.

Valutazione del bilanciamento del motore e di coordinamento nei topi utilizzando la Balance Beam

Brain injury, genetic manipulations, and pharmacological treatments can result in alterations of motor skills in mice.  Fine motor coordination and ...

Ricerca

Neuroscienze

Assessment of Dendritic Arborization in the Dentate Gyrus of the Hippocampal Region in Mice

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity and extent of dendritic arborization correlates well with the synaptic plasticity in these cells. A reliable method for assessment of dendritic arborization is needed to characterize the deleterious effects of neurological disorders on these structures and to determine the effects of therapeutic interventions. However, quantification of these structures has proven to be a formidable task given their complex and dynamic nature. Fortunately, sophisticated imaging techniques can be paired with conventional staining methods to assess the state of dendritic arborization, providing a more reliable and expeditious means of assessment. Below is an example of how these imaging techniques were paired with staining methods to characterize the dendritic arborization in wild type mice. These complementary imaging methods can be used to qualitatively and quantitatively assess dendritic arborization that span a rather wide area within the hippocampal region.

We describe two methods for visualization and quantification of dendritic arborization in the hippocampus of mouse models: real-time and extended depth of field imaging. While the former method allows sophisticated topographical tracing and quantification of the extent of branching, the latter allows speedy visualization of the dendritic tree.

Valutazione della dendritiche arborizzazione nel giro dentato della Regione ippocampale nei topi

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity ...

Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching variations of the neuronal dendrites within the hippocampus are implicated in cognition and memory formation. There are several approaches to Golgi staining, all of which have been useful for determining the morphological characteristics of dendritic arbors and produce a clear background. The present Golgi-Cox method, (a slight variation of the protocol that is provided with a commercial Golgi staining kit), was designed to assess how a relatively low dose of the chemotherapeutic drug 5-flurouracil (5-Fu) would affect dendritic morphology, the number of spines, and the complexity of arborization within the hippocampus. The 5-Fu significantly modulated the dendritic complexity and decreased the spine density throughout the hippocampus in a region-specific manner. The data presented show that the Golgi staining method effectively stained the mature neurons in the CA1, the CA3, and the dentate gyrus (DG) of the hippocampus. This protocol reports the details for each step so that other researchers can reliably stain tissue throughout the brain with high quality results and minimal troubleshooting.

Here we present a Golgi-Cox protocol in extensive detail. This reliable tissue stain method allows for a high-quality assessment of the cytoarchitecture in the hippocampus, and throughout the entire brain, with minimal troubleshooting.

Valutazione della complessità dendritica ippocampale nei topi invecchiati utilizzando il metodo Golgi-Cox

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching ...

Assessment of Dopaminergic Homeostasis in Mice by Use of High-performance Liquid Chromatography Analysis and Synaptosomal Dopamine Uptake

Dopamine (DA) is a modulatory neurotransmitter controlling motor activity, reward processes and cognitive function. Impairment of dopaminergic (DAergic) neurotransmission is strongly associated with several central nervous system-associated diseases such as Parkinson&#39;s disease, attention-deficit-hyperactivity disorder and drug addiction1,2,3,4. Delineating disease mechanisms involving DA imbalance is critically dependent on animal models to mimic aspects of the diseases, and thus protocols that assess specific parts of the DA homeostasis are important to provide novel insights and possible therapeutic targets for these diseases.
Here, we present two useful experimental protocols that when combined provide a functional read-out of the DAergic system in mice. Biochemical and functional parameters on DA homeostasis are obtained through assessment of DA levels and dopamine transporter (DAT) functionality5. When investigating the DA system, the ability to reliably measure endogenous levels of DA from adult brain is essential. Therefore, we present how to perform high-performance liquid chromatography (HPLC) on brain tissue from mice to determine levels of DA. We perform the experiment on tissue from dorsal striatum (dStr) and nucleus accumbens (NAc), but the method is also suitable for other DA-innervated brain areas.
DAT is essential for reuptake of DA into the presynaptic terminal, thereby controlling the temporal and spatial activity of released DA. Knowing the levels and functionality of DAT in the striatum is of major importance when assessing DA homeostasis. Here, we provide a protocol that allows to simultaneously deduce information on surface levels and function using a synaptosomal6 DA uptake assay.
Current methods combined with standard immunoblotting protocols provide the researcher with relevant tools to characterize the DAergic system.

Synaptosomal dopamine uptake and high-performance liquid chromatography analysis represent experimental tools to investigate dopamine homeostasis in mice by assessing the function of the dopamine transporter and levels of dopamine in striatal tissue, respectively. Here we present protocols to measure dopamine tissue content and assess the functionality of the dopamine transporter.

Valutazione dell'omeostasi dopaminergici in topi tramite l'uso di analisi di cromatografia liquida ad alte prestazioni e assorbimento della dopamina sinaptosomiali

Dopamine (DA) is a modulatory neurotransmitter controlling motor activity, reward processes and cognitive function. Impairment of dopaminergic (DAergic) ...

Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease

Disruption of blood-brain barrier (BBB) integrity is a common feature for different neurological and neurodegenerative diseases. Although the interplay between perturbed BBB homeostasis and the pathogenesis of brain disorders needs further investigation, the development and validation of a reliable procedure to accurately detect BBB alterations may be crucial and represent a useful tool for potentially predicting disease progression and developing targeted therapeutic strategies.
Here, we present an easy and efficient procedure for evaluating BBB leakage in a neurodegenerative condition like that occurring in a preclinical mouse model of Huntington disease, in which defects in the permeability of BBB are clearly detectable precociously in the disease. Specifically, the high molecular weight fluorescein isothiocyanate labelled (FITC)-albumin, which is able to cross the BBB only when the latter is impaired, is acutely infused into a mouse jugular vein and its distribution in the vascular or parenchymal districts is then determined by fluorescence microscopy.
Accumulation of green fluorescent-albumin in the brain parenchyma functions as an index of aberrant BBB permeability and, when quantitated by using Image J processing software, is reported as Green Fluorescence Intensity.

In this study, we present an easy and efficient procedure for evaluating the disruption of the blood-brain barrier under neurodegenerative conditions. To achieve our objective, we infused high molecular weight fluorescein isothiocyanate labelled (FITC)-albumin into mouse jugular vein and evaluated its leakage into the brain parenchyma by fluorescence microscopy.

Valutazione della permeabilità della barriera emato - encefalica dall'infusione endovenosa di albumina FITC-labeled in un modello murino di malattia di Neurodegenerative

Disruption of blood-brain barrier (BBB) integrity is a common feature for different neurological and neurodegenerative diseases. Although the interplay ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains brain homeostasis. The principal sites of the barrier are endothelial cells of the brain capillaries whose barrier function results from tight intercellular junctions and efflux transporters expressed on the plasma membrane. This function is regulated by pericytes and astrocytes that together form the neurovascular unit (NVU). Several neurological diseases such as stroke, Alzheimer&#39;s disease (AD), brain tumors are associated with an impaired BBB function. Assessment of the BBB permeability is therefore crucial in evaluating the severity of the neurological disease and the success of the treatment strategies employed.
We present here a simple yet robust permeability assay that have been successfully applied to several mouse models both, genetic and experimental. The method is highly quantitative and objective in comparison to the tracer fluorescence analysis by microscopy that is commonly applied. In this method, mice are injected intraperitoneally with a mix of aqueous inert fluorescent tracers followed by anesthetizing the mice. Cardiac perfusion of the animals is performed prior to harvesting brain, kidneys or other organs. Organs are homogenized and centrifuged followed by fluorescence measurement from the supernatant. Blood drawn from the cardiac puncture just before perfusion serves for normalization purpose to the vascular compartment. The tissue fluorescence is normalized to the wet weight and serum fluorescence to obtain a quantitative tracer permeability index. For additional confirmation, the contralateral hemi-brain preserved for immunohistochemistry can be utilized for tracer fluorescence visualization purposes.

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Here we present a mouse brain vascular permeability assay using intraperitoneal injection of fluorescent tracers followed by perfusion that is applicable to animal models of blood-brain barrier dysfunction. One hemi-brain is used for assessing permeability quantitatively and the other for tracer visualization/immunostaining. The procedure takes 5 - 6 h for 10 mice.

In Vivo barriera emato - encefalica permeabilità saggio nei topi utilizzando fluorescente etichettati traccianti

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier (BBB). Rats with induced ischemic stroke were established and used as in vivo models to investigate the functional integrity of the BBB. Spectrophotometric detection of Evans blue (EB) in the brain samples with ischemic injury could provide reliable justification for the research and development of novel therapeutic modalities. This method generates reproducible results, and is applicable in any laboratory without a need for special equipment. Here, we present a visualized and technical guideline on the detection of the extravasation of EB following induction of ischemic stroke in rats.

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

The overall goal of this procedure is to provide a highly reproducible technique for in vivo assessment of the blood-brain barrier disruption in rat models of ischemic stroke.

Una valutazione In Vivo di rottura della barriera emato - encefalica in un modello del ratto del colpo ischemico

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Due-fotone Imaging dei neuroni corticali in topi neonatali

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

The Power of Interstimulus Interval for the Assessment of Temporal Processing in Rodents

Temporal processing deficits have been implicated as a potential elemental dimension of higher-level cognitive processes, commonly observed in neurocognitive disorders. Despite the popularization of prepulse inhibition (PPI) in recent years, many current protocols promote using a percent of control measure, thereby precluding the assessment of temporal processing. The present study used cross-modal PPI and gap prepulse inhibition (gap-PPI) to demonstrate the benefits of employing a range of interstimulus intervals (ISIs) to delineate effects of sensory modality, psychostimulant exposure, and age. Assessment of sensory modality, psychostimulant exposure, and age reveals the utility of an approach varying the interstimulus interval (ISI) to establish the shape of the ISI function, including increases (sharper curve inflections) or decreases (flattening of the response amplitude curve) in startle amplitude. Additionally, shifts in peak response inhibition, suggestive of a differential sensitivity to the manipulation of ISI, are often revealed. Thus, the systematic manipulation of ISI affords a critical opportunity to evaluate temporal processing, which may reveal the underlying neural mechanisms involved in neurocognitive disorders.

Temporal processing, a preattentive process, may underlie deficits in higher-level cognitive processes, including attention, commonly observed in neurocognitive disorders. Using prepulse inhibition as an exemplar paradigm, we present a protocol for manipulating interstimulus interval (ISI) to establish the shape of the ISI function to provide an assessment of temporal processing.

Il potere di Interstimulus intervallo per la valutazione di elaborazione temporale in roditori

Temporal processing deficits have been implicated as a potential elemental dimension of higher-level cognitive processes, commonly observed in ...

Double Direct Injection of Blood into the Cisterna Magna as a Model of Subarachnoid Hemorrhage

Among strokes, subarachnoid hemorrhage (SAH) consecutive to the rupture of a cerebral arterial aneurysm represents 5-9% but is responsible for about 30% of the total stroke-related mortality with an important morbidity in terms of neurological outcome. A delayed cerebral vasospasm (CVS) may occur most often in association with a delayed cerebral ischemia. Different animal models of SAH are now being used including endovascular perforation and direct injection of blood into the cisterna magna or even the prechiasmatic cistern, each exhibiting distinct advantages and disadvantages. In this article, a standardized mouse model of SAH by double direct injection of determined volumes of autologous whole blood into the cisterna magna is presented. Briefly, mice were weighed and then anesthetized by isoflurane inhalation. Then, the animal was placed in a reclining position on a heated blanket maintaining a rectal temperature of 37 &#176;C and positioned in a stereotactic frame with a cervical bend of about 30&#176;. Once in place, the tip of an elongated glass micropipette filled with the homologous arterial blood taken from carotid artery of another mouse of the same age and gender (C57Bl/6J) was positioned at a right angle in contact with the atlanto-occipital membrane by means of a micromanipulator. Then 60 &#181;L of blood was injected in the cisterna magna followed by a 30&#176; downward tilt of the animal for 2 minutes. The second infusion of 30 &#181;L of blood into the cisterna magna was performed 24 h after the first one. The individual follow-up of each animal is carried out daily (careful evaluation of weight and well-being). This procedure allows a predictable and highly reproducible distribution of blood, likely accompanied by intracranial pressure elevation that can be mimicked by an equivalent injection of an artificial cerebral spinal fluid (CSF), and represents an acute to mild-model of SAH inducing low mortality.

We described in this protocol a standardized subarachnoid hemorrhage (SAH) mouse model by a double injection of autologous whole-blood into the cisterna magna. The high degree of standardization of the double-injection procedure represents a middle-to-acute model of SAH with relative safety regarding mortality.

Doppia iniezione diretta di sangue nella Cisterna Magna come modello di emorragia subarachnoide

Among strokes, subarachnoid hemorrhage (SAH) consecutive to the rupture of a cerebral arterial aneurysm represents 5-9% but is responsible for about 30% ...