Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della riproduzione. E l'endocrinologia. E sono applicabili allo studio della sindrome dell'ovaio policistico o PCOS e iperandrogenismo.
Il vantaggio di questa tecnica è che facilita un rilascio coerente, uniforme e a lungo termine di ormoni in modo costoso ed efficace. JHUs che tratta la procedura sarà Ping Xue, un tecnico del mio laboratorio. Per la preparazione del pellet diidrotestosterone o DHT, utilizzare una lama di rasoio per tagliare un pezzo di tubi in silicone da 15 millimetri.
E utilizzare una siringa da tre millilitri dotata di un ago smussato calibro 20 per iniettare silicone adesivo medicale da due a cinque millimetri in un'estremità del tubo. Lasciare asciugare i tubi durante la notte. E controlla la presenza di bolle d'aria sull'estremità sigillata.
Indossare l'attrezzatura di protezione individuale appropriata versare polvere DHT in una barca di plastica nella scorrenza. Imprimere l'estremità aperta del tubo chiuso adesivo nella polvere. Utilizzando una grande graffetta raddrizzata, domare la polvere nel tubo, fino a quando il DHT raggiunge l'appropriata profondità sperimentale.
Quindi sigillare il lato aperto del tubo con silicone durante la notte. La mattina seguente, tagliare ogni lato sigillato per ottenere una lunghezza di due millimetri di silicone su entrambi i lati del DHT e nessun pellet di controllo DHT. Quindi conservare i pellet nel tubo conico da 50 millilitri avvolto con un foglio a temperatura ambiente per un massimo di tre mesi.
Per la generazione di modelli di mouse PCOS equilibrare fino a 20 DHT o controllare pellet in tubi conici separati da 50 millilitri contenenti 30 millilitri dello 0,9% di soluzione salina per 24 ore a 37 gradi Celsius. Il giorno dopo, conferma la mancanza di risposta al dito del dito in un topo femmina anestetizzato di due mesi e usa una garza sterile per somministrare povidone-iodio sequenziale e scrub di etynol al 70% nell'area chirurgica. Quindi, fai un'incisione di cinque millimetri attraverso la pelle vicino al collo.
E usa un trocar calibro dieci per fare un tunnel di 15 millimetri in direzione rostrale. Utilizzare il trocar per inserire un pellet dorsalmente nel tunnel e sigillare l'incisione con l'adesivo chirurgico. Approssimare manualmente i bordi della ferita con le forcep e utilizzare tratti di spazzolatura delicati per applicare tre sottili strati di pellicola di adesivo liquido a un centimetro di distanza da ciascun lato dei bordi della ferita opposti.
Quindi posizionare il mouse da solo in una gabbia su un dissipatore di calore con monitoraggio fino alla piena rimossipanza. Sostituzione del pellet ogni quattro settimane per mantenere un livello costante di esposizione agli androgeni. Tre giorni dopo l'inserimento del pellet, utilizzare una pipetta p10 per spruzzare dieci microlitri di soluzione salina sterile nella cavità vaginale e utilizzare la punta della pipetta per recuperare immediatamente la soluzione salina.
Stendere il campione salino della cellula vaginale su uno scivolo etichettato. E lasciare asciugare la salina a temperatura ambiente. Fissare le diapositive essiccate in un contenitore di etynolo al 100% per almeno cinque minuti.
Quindi macchiare le diapositive per un minuto ciascuna nel buffer B e nel buffer C da un kit di colorazione dif-quick. Alla fine del tampone C l'incubazione lavare gli scivoli con acqua del rubinetto per tre secondi e asciugarli a temperatura ambiente. Per determinare la ciclicità estrosa vedere le diapositive sotto l'obiettivo dieci volte di un microscopio a luce.
Contare i giorni in ogni fase e dividere per il numero totale di giorni per calcolare il tempo percentuale in ogni fase. Per testare la tolleranza al glucosio, 20 giorni di inserimento DHT, digiunare i topi durante la notte. Pesare i topi la mattina successiva e utilizzare un glucometro e strisce di prova per misurare il livello di glucosio basilico nel sangue della vena della coda.
Iniettare ai topi due grammi per chilogrammo di peso corporeo del 20% di destrosio. Quindi misurare il livello di glucosio dei campioni di sangue delle vene della coda a 15, 30, 60, 90, 120 minuti dopo la somministrazione di destrosio. Per acquisire la prole femminile dalle dame inserite da DHT, spostare il topo femmina per testarlo nella gabbia con un maschio fertile comprovato al giorno 15, dopo l'inserimento del pellet.
Documentare il peso corporeo delle dame ogni settimana per determinare se il topo è incinta. Il settimo giorno postnatale, immergere una punta di lancetta nella pasta per tatuaggi e contrassegnare ogni cucciolo con un tatuaggio sulla punta. Pesare i topi marcati ogni sette giorni fino a 70 giorni di età.
Tra la data postnatale 12 e il 16, l'orecchio colpisce i topi per numerarli secondo il sistema come illustrato nella figura. Per distinguere il sesso, esaminare il lato ventrale di ogni mouse taggato. Le femmine avranno capezzoli visibili.
Per raccogliere campioni di sangue per varie analisi a valle utilizzare una lancetta per raccogliere il volume sperimentale approssimativo di sangue tra le nove e le dieci del mattino per sanguinamento gestulare submandibolare. E centrifugare i campioni per consentire la raccolta del siero. Quindi conservare i campioni di sieri in tubi di micro-centrifuga da 1,5 millilitri a meno 80 gradi Celsius fino alla loro analisi.
Per valutare la pubertà nella prole femminile del DHT, ogni giorno dopo lo svezzamento al giorno post-natale 21, controllare l'apertura vaginale mediante ispezione visiva. E usa i calibri per misurare la distanza ano-genitale. Sebbene i valori assoluti del siero DHT siano diversi tra la spettrometria di massa e l'analisi di Elisa, il cambiamento popolare relativo dell'inserimento DHT rispetto a quello no-DHT è simile sia dai saggi che dagli esperimenti.
I livelli di DHT sono significativamente aumentati dal pre-concepimento attraverso la gravidanza sia in DHT che in nessun topo DHT. Tuttavia, i livelli di DHT sono due volte più alti nei topi DHT rispetto a nessun topo DHT sia nei punti di tempo pre-concepizionali che gestazionali. Le figlie DHT adulte mostrano differenze nella funzione riproduttiva.
Ad esempio, la ciclicità estrosa interrotta rispetto alle figlie adulte non DHT che sperimentano tempi significativamente più lunghi nel metestrus diestrus e meno tempo in pro-esterous e esterous. Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare di incubare i pellet per 24 ore prima che siano utilizzati per il rilascio uniforme dell'ormone. Seguendo questa procedura, possono essere esaminate anche le conseguenze riproduttive e metaboliche dell'esposizione al DHT.
Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'endrocrocrologia e delle interazioni fetali materne per studiare il PCOS e l'impatto dell'iperandrogenismo di basso livello nei topi femmine. Non dimenticare che lavorare con DHT può essere estremamente pericoloso e le precauzioni come indossare guanti, una maschera e occhiali e lavorare in un cappuccio di bio-sicurezza, dovrebbero sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.
