Ringraziamo Virginia Doherty e Junmei Yao per l&#39;assistenza tecnica. Questa ricerca è stata finanziata dal NIMH (R01 MH084966), e la US Army Research Office e la Defense Advanced Research Projects Agency (concedere W911NF-10-1-0059) per KAG.

Tutti gli esperimenti sono stati fatti usando ratti maschi adulti a lungo Evans. Tutte le procedure sono state in conformità con i National Institutes of Health (NIH) Guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio e sono stati approvati dalla cura e l&#39;uso degli animali Comitato Istituzionale del Massachusetts Institute of Technology e la cura degli animali ed uso Review Ufficio il USAMRMC. 1. Preparazione <ol><li> Heparinise il catetere e la siringa inserendo l&#39;ago schermato in un tubo contenente eparina 500 microlitri (1,000 USP unità / ml) e poi aspirando ed espellendo soluzione di eparina attraverso l&#39;ago. <ol><li> Attaccare un catetere farfalla alla siringa. Mantenere la schermatura sopra l&#39;ago del catetere per proteggere la punta affilata da danni. </li><li> Prelevare un volume di eparina che è leggermente maggiore del volume di sangue che sarà incassato. Staccare la siringa e riempirlo con l&#39;aria. </li><li> Rimontare la siringa al catetere e utilizzare ilaria per espellere soluzione di eparina in eccesso; garantire solo tracce rimangono nel tubo, ago e siringa. </li><li> Posizionare il catetere sterile, con la siringa ancora attaccata, su una superficie sterile. </li></ol></li><li> Garantire rapidamente il topo in un panno pulito assicurando che anteriori e hindpaws sono in una posizione comoda e la respirazione è illimitata. <ol><li> Fissare l&#39;involucro con il gancio e le bandelle; garantire che i genitali esterni non sono ristretti. </li><li> Avere un assistente con dolcezza e fermezza frenare il ratto (addome e alla base della coda) su un piano di lavoro solido con la coda appende fuori del bordo del contatore. </li></ol></li></ol> Campionamento 2. Sangue <ol><li> Immergere la coda in acqua 42 ° C per 40-50 secondi a dilatare i vasi sanguigni e asciugare la coda con un tovagliolo di carta. Individuare la vena della coda per essere dissanguato (ruotare tutto il corpo con la coda per evitare torsioni della coda). Nota: il riscaldamento sufficiente della coda è fondamentale per la rapida collection di un campione di sangue. Se il sistema vascolare è ristretto, il corretto posizionamento del catetere è difficile, e il flusso di sangue viene notevolmente ridotto. Un rilievo di riscaldamento può essere utilizzata come alternativa alla immersione in acqua. </li><li> Identificare il punto di campionamento. Nota: L&#39;arteria si trova lungo l&#39;aspetto metà dorsale della coda; non utilizzare questo per il campionamento. <ol><li> Per oggetto sia le vene posteriori sinistro e destro che si trovano lateralmente all&#39;arteria. Pigmentazione della coda, che varia dalla tensione e aumenta con l&#39;età, può oscurare alcuni della vascolarizzazione. Obiettivo una porzione della vena nella porzione inferiore della coda. </li><li> Pulire l&#39;area di destinazione con il 2% clorexidina soluzione antisettica. </li></ol></li><li> Creare pressione negativa nella siringa e il catetere ritirando lo stantuffo da zero a circa 50 microlitri. </li><li> Tenere la coda delicatamente e saldamente vicino alla punta per mantenere la coda dritta in tutta la raccolta del campione. Assicurarsi che il flusso di sangue non è occluso da una presa troppo stretta.</li><li> Lentamente inserire il catetere nella vena con un angolo basso circa 5 cm dalla punta della coda. Quando la vena è penetrato, il sangue scorrerà nel catetere. Lentamente ritirare lo stantuffo della siringa per raccogliere il volume desiderato ad un tasso costante (~ 20 microlitri per sec). <ol><li> Consultare il personale veterinario per informazioni sul volume massimo di sangue che possono essere raccolte. La quantità massima di sangue che devono essere raccolti dipende dal peso e lo stato di salute del ratto. Non prelevare più del 15% del volume totale del sangue in un periodo di 14 giorni. Nota: Il sangue è molto più difficile da raccogliere da animali che sono stati acutamente sottolineato nel verbale prima del prelievo, perché gli ormoni dello stress restringono la vascolarizzazione. Ad esempio, lo spostamento casa gabbia del topo per una camera romanzo, prendendo diversi minuti per avvolgere l&#39;animale, o ripetuta inserimento del catetere in una vena sono tutti suscettibili di innescare una risposta allo stress acuto. </li><li> Facilitare blood flusso da &#39;mungitura&#39; la vena. Eseguire un dito lungo la lunghezza della vena, dalla base verso la punta della coda, ma rimane superiore a 2 cm dalla punta dell&#39;ago inserito o il catetere possono staccarsi dalla vena. </li><li> Se il sangue non può essere raccolto con successo dal sito iniziale di penetrazione del catetere, reinserire l&#39;ago ulteriormente la vena. Se il sangue è stato raccolto nel sito iniziale, ri-pressurizzare l&#39;ago scollegando e ricollegando il catetere e la siringa prima di reinserimento nella vena. In generale, evitare penetrazioni supplementari. </li><li> Come più penetrazioni possono causare il collasso vena della coda, in cui l&#39;afflusso di sangue alla coda viene interrotta e il tessuto molle coda diventa necrotized, eutanasia il topo se c&#39;è il collasso vena della coda. </li></ol></li><li> Quando un adeguato volume di campione viene raccolto, rilasciare la pressione nella siringa da scollegare e ricollegare il catetere. Aspirare leggermente con lo stantuffo della siringa (~ 50 &amp; #181; l), ed estrarre l&#39;ago dalla vena. Nota: Se l&#39;ago viene ritirato senza prima rilasciare la pressione nella siringa, sangue gocciolerà dall&#39;ago. </li><li> Brevemente applicare pressione al sito di inserimento per fermare l&#39;emorragia, e pulire la zona con soluzione antisettica. Riportare il topo alla sua gabbia casa. </li></ol> 3. Elaborazione del campione di sangue <ol><li> Aria Aspirare a garantire l&#39;assenza di sangue rimane dentro l&#39;ago del catetere, e usare le forbici per tagliare il tubo del catetere appena sopra l&#39;ago. Espellere il sangue in una sterile 1,5 ml provetta. Nota: Se il sangue viene spinto attraverso l&#39;ago, la forza di taglio può causare globuli rossi a rottura che possono interferire con molti saggi a valle. Rimuovere l&#39;ago per evitare emolisi. <ol><li> Per raccogliere il plasma sanguigno, tubi di uso contenenti EDTA come anticoagulante (qui, utilizzare 10 ml di 0,1 M EDTA per 200-400 ml di sangue; garantire la concentrazione di EDTA utilizzato non interferisce won il test a valle) e posto sul ghiaccio. <ol><li> Spin campioni di sangue intero a 2100 xg in una centrifuga refrigerata (4 ° C) per 10 min entro 10 minuti di raccolta. Eluire il plasma, evitando di disturbare gli strati di globuli rossi e bianchi. </li></ol></li><li> Per raccogliere siero del sangue, posto campioni (senza anticoagulante) a temperatura ambiente per un massimo di 30 minuti per consentire la coagulazione. Spin tubi di raccolta in una centrifuga refrigerata (4 ° C) a 2000 x g. Il siero può essere poi eluito. </li></ol></li><li> Utilizzare i campioni immediatamente, o conservare a -80 ° C per un massimo di un anno. </li></ol>

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	<li>Vausort, M., Wagner, D. R., Devaux, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+Noncoding+RNAs+in+Patients+with+Acute+Myocardial+Infarction.">Long Noncoding RNAs in Patients with Acute Myocardial Infarction.</a> Circ Res. 115 (7), 668-677 (2014).</li><li>Shah, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarkers+for+Early+Detection+of+Colorectal+Cancer+and+Polyps:+Systematic+Review.">Biomarkers for Early Detection of Colorectal Cancer and Polyps: Systematic Review.</a> Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 23 (9), 1712-1728 (2014).</li><li>Chan, M. 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G., Yukhananov, R., Crosby, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+impairment+of+acquisition+of+a+spatial+memory+task+following+isoflurane-nitrous+oxide+anesthesia+in+rats.">Long-term impairment of acquisition of a spatial memory task following isoflurane-nitrous oxide anesthesia in rats.</a> Anesthesiology. 100 (2), 309-314 (2004).</li><li>Vahl, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+ACTH+and+corticosterone+sampling+methods+in+rats.">Comparative analysis of ACTH and corticosterone sampling methods in rats.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 289 (5), E823-E828 (2005).</li><li>Kalinichenko, L. S., Koplik, E. V., Pertsov, S. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+norepinephrine+and+epinephrine+concentrations+in+adrenal+gland+of+the+rats+submitted+to+acute+immobilization+stress.">Changes in norepinephrine and epinephrine concentrations in adrenal gland of the rats submitted to acute immobilization stress.</a> Pharmacol Res. 48 (6), 607-613 (2003).</li><li>Meyer, R. M., Burgos-Robles, A., Liu, E., Correia, S. S., Goosens, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ghrelin-growth+hormone+axis+drives+stress-induced+vulnerability+to+enhanced+fear.">A ghrelin-growth hormone axis drives stress-induced vulnerability to enhanced fear.</a> Mol Psychiatry. , (2013).</li><li>Knoll, A. T., Carlezon, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynorphin,+stress,+and+depression.">Dynorphin, stress, and depression.</a> Brain Res. 1314 (56-73), (2010).</li><li>Harvey, B. H., Brand, L., Jeeva, Z., Stein, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical/hippocampal+monoamines,+HPA-axis+changes+and+aversive+behavior+following+stress+and+restress+in+an+animal+model+of+post-traumatic+stress+disorder.">Cortical/hippocampal monoamines, HPA-axis changes and aversive behavior following stress and restress in an animal model of post-traumatic stress disorder.</a> Physiol Behav. 87 (5), 881-890 (2006).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui, si descrive una procedura rapida e semplice per ottenere un campione di sangue da un topo che offre notevoli vantaggi rispetto ad altre tecniche comunemente utilizzate. In primo luogo, non richiede anestesia, in contrasto con il campionamento dalla vena giugulare o del seno retroorbitario. Quando i campioni di sangue sono raccolti circostante procedure comportamentali, la somministrazione di anestetici è indesiderabile perché può interferire con l&#39;apprendimento e la memoria 4,5. In secondo luogo, offre la possibilità di raccogliere volumi sanguigni più grandi rispetto alle altre tecniche di puntura di vena, come la raccolta dalle vene safena pedale o dorsali. Utilizzando la tecnica qui descritta, fino a 1,5 ml di sangue possono essere raccolte da un topo in un singolo punto di tempo, un volume che consente facilmente molteplici test da eseguire in parallelo. Infine, questa procedura riduce al minimo il rischio di danni ai tessuti rispetto alla punta della coda amputazione o sanguinamento retroorbitario. L&#39;uso di questa procedura permette di rispettare l&#39;animale Welfare Act e la guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio, che richiedono riducendo al minimo il dolore e l&#39;angoscia che derivano da procedure di laboratorio sugli animali. Si raccomanda che gli investigatori nuovi a questo metodo pratica le tecniche di immobilizzazione e sanguinamento coda in modo da minimizzare il tempo che gli animali sperimentali vengono immobilizzati. Il sangue raccolto in meno di 3 minuti dall&#39;inizio del contenimento fornisce risultati ottimali. Il protocollo qui descritto può essere utilizzato per il campionamento 1 a 4 volte alla settimana, ma non più di due volte al giorno. Mentre collezioni sangue ripetute possono essere eseguite, devono essere utilizzati differenti siti di campionamento si spostano verso l&#39;alto dalla base della coda, e le vene coda sinistra e destra devono essere alternate come siti di campionamento. Il volume totale del sangue di roditori è 6-7% del loro peso corporeo, e non più del 15% del volume totale del sangue deve essere raccolto in un periodo di 2 settimane. Sieroo plasma comprende circa il 40-60% del volume del campione raccolto. Campionamento del sangue attraverso le vene coda laterali può essere eseguito anche nel topo come descritto qui con alcune piccole modifiche. In primo luogo, possono essere utilizzati solo piccolo calibro (27 G) cateteri. In secondo luogo, si consiglia di utilizzare un dispositivo di immobilizzazione tubo, piuttosto che un involucro, per immobilizzare i topi. Il volume di sangue che può essere ottenuta dal mouse utilizzando venipuntura del fascio vascolare sottomandibolare (200-500 ml) è superiore possono essere raccolti in modo sicuro dalla vena caudale (200 microlitri massimo). Poiché prelievo di sangue dal fascio vascolare sottomandibolare richiede contenimento fisico minimo e può produrre più sangue, questo è il percorso preferito per il campionamento nel topo. La rapidità con cui può essere eseguita questa procedura, insieme con la sua natura minimamente invasiva, minimizza anche il potenziale perturbazione misure base di sangue dalla risposta stress acuto 6. Ilrisposta allo stress acuto può alterare i livelli circolanti di molte molecole, tra cui le interleuchine e di altri fattori immunitari-attivo 7, ormoni dell&#39;asse ipotalamo-ipofisi-surrene 8, ormoni del sistema nervoso simpatico 9, grelina 10, oppioidi endogeni 11, la dopamina, e serotonina 12. Se si desiderano riposo circolanti misure di queste molecole o altri regolate da queste molecole, è importante minimizzare la risposta allo stress, che viene attivato entro meno di un minuto del inizio dell&#39;esposizione stress. Risposte di stress non solo alterano la composizione del sangue, ma rappresentano anche un ostacolo tecnico per il prelievo di sangue a causa della costrizione dei vasi attraverso una maggiore unità dal sistema nervoso simpatico. E diventa sempre più difficile ottenere costante il flusso di sangue da un ratto che sta montando una risposta allo stress acuto. Pertanto, l&#39;angoscia degli animali deve essere minimazata per ottenere rapidamente campioni che riflettono lo stato fisiologico di interesse.

Biomarkers ottenuti da sangue forniscono utili diagnostica predittiva, e stratificando misure in molti contesti clinici, tra cui malattie cardiovascolari 1, scienze cancro 2 e malattia psichiatrica 3. Essi possono essere utilizzati anche in scienza di base per valutare lo &quot;stato&quot; di un organismo, compreso il grado di fame, infiammazione, o stress presenti. Tali misure possono essere influenzati da variabili che possono o non possono essere fondamentali per la questione degli interessi, compreso il tempo del giorno in cui si ottiene il campione e il sesso dei soggetti. Essa può anche essere influenzato dalla sollecitazione indotta durante le procedure di campionamento si sangue. Gli ormoni dello stress e la percezione del dolore possono rapidamente modificare la composizione del sangue. Roditori sono il laboratorio animale più comunemente usati, e diversi metodi sono stati sviluppati per la raccolta di sangue. Il metodo ideale di prelievo di sangue deve avere Physiologica minimol impatto sull&#39;animale, non richiedono l&#39;anestesia, permettono campionamento rapida e ripetuta, e fornire una sufficiente quantità di sangue per numerose applicazioni a valle. Tecniche popolari per la raccolta del sangue, come cateterizzazione della giugulare amputazione punta vena o della coda non soddisfano questi criteri. Lo scopo di questo protocollo è quello di descrivere una tecnica di campionamento del sangue per uso in ratti che è minimamente stressante, non richiede anestesia, permette molteplici collezioni sangue all&#39;interno di un singolo soggetto, e fornisce un volume relativamente grande di esempio tale analisi multiple possono essere eseguite su un singolo campione. L&#39;obiettivo di questo metodo è quello di ottenere campioni di sangue che sono minimamente influenzati dalla risposta stress acuto.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium heparin (1000 USP units/ml)</td>
			<td>Patternson Veterinary Supply</td>
			<td>25021040010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>JT Taylor</td>
			<td>JT2020-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dermachlor Rinse-Chlorhexadine</td>
			<td>Butler Schein</td>
			<td>6356</td>
			<td>Topical antiseptic solution, 2% chlorhexidine gluconate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SURFLO Winged Infusion Sets, Terumo, butterfly catheters</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>TESV25BLK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Tuberculin 1cc syringes</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>BD309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>89202-682</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 &#956;l microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>21150-330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, stainless steel, 5&#34;</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>82027-586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500ml plastic beaker</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>414004-149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean cloth wrap</td>
			<td>Butler Schein</td>
			<td>2993</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Velcro tape, .75&#34; width</td>
			<td>Monoprice</td>
			<td>B004AF9II6</td>
			<td>Hook and loop tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>62344-641</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sampling blood from the lateral tail vein of the rat

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, proteins, and glucose, yet the composition of the blood is dynamically regulated and easily perturbed. One factor that can change the blood composition is the stress response triggered by the sampling procedure, which can contribute to variability in the measures of interest. Here we describe a procedure for blood sampling from the lateral tail vein in the rat. This procedure offers significant advantages over other more commonly used techniques. It permits rapid sampling with minimal pain or invasiveness, without anesthesia or analgesia. Additionally, it can be used to obtain large volume samples (upwards of 1 ml in some rats), and it may be used repeatedly across experimental days. By minimizing the stress response and pain resulting from blood sampling, measures can more accurately reflect the true basal state of the animal, with minimal influence from the sampling procedure itself.

Plasma di sangue prelevati dalla vena caudale laterale come descritto nel protocollo dà un campione di plasma che era traslucido e giallo pallido in apparenza. Come mostrato in Figura 1, emolisi nel campione conferisce una tinta rossa plasma. La risposta allo stress acuto può rapidamente modificare la composizione del sangue. Ad esempio, concentrazione circolante corticosterone può notevolmente aumentare entro 10 minuti di esposizione di stress, come mostrato nella Figura 2. I bassi livelli basali di corticosterone ottenuti con questo metodo prima stressanti dell&#39;esposizione rivelano che la procedura di campionamento per sé non è una fonte significativa di stress. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52766/52766fig1.jpg" /> Figura 1: viene mostrato l&#39;aspetto del campione (A) Un campione emolizzato.. Dopo centrifugazione, il plasma o il livello nel siero (superficiale indicato dalla ar nerafila) appare tinge di rosa o rosso. Tinte più scuri indicano maggiori livelli di emolisi. (B) Dopo centrifugazione, un campione correttamente raccolti avrà una chiara, aspetto giallastra della banda superiore (superficie indicata dalla freccia nera), che corrisponde al plasma non emolizzati o siero. Quando si rimuove questo strato, è importante non disturbare il sangue intero sottostante, sia spingendo la punta della pipetta in tutto lo strato sangue o aspirando parte del sangue intero nella punta. Qualsiasi plasma o siero contaminati da sangue intero devono essere eliminate. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52766/52766fig2.jpg" /> Figura 2: corticosterone plasma sta rapidamente elevato a seguito di una esperienza stressante Il sangue è stato prelevato dalla vena della coda laterale femmine adulte ratti lungo Evans prima e 10 minuti dopo l&#39;esposizione a 4 toni (10 sec, 2 kHz, 85 dB) co-terminazione. con footshocks (1 sec, 350 μA). Corticosterone plasma sanguigno al basale (290,4 ± 138,8 pg / ml) è risultata significativamente inferiore ai livelli osservati 10 minuti dopo la presentazione dello stress footshock (2204,8 ± 454,5 pg / ml, p = 0,02, n = 4), come determinato da paired t -test. *, P &lt;0,05

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Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat

Blood samples are useful for assessing biomarkers of physiological states or disease in vivo. Here we describe the methodology to sample blood from the lateral tail vein in the rat. This method provides rapid samples with minimal pain and invasiveness.

Prelievo di sangue dalla vena della coda laterale del Topo

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, ...

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Research

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Biology

102.1K Views.  Massachusetts Institute of Technology. Blood samples are useful for assessing biomarkers of physiological states or disease in vivo. Here we describe the methodology to sample blood from the lateral tail vein in the rat. This method provides rapid samples with minimal pain and invasiveness.

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Drawing Blood from Rats through the Saphenous Vein and by Cardiac Puncture

Drawing blood from rodents is necessary for a large number of both in vitro and in vivo studies. Sites of blood draws are numerous in rodents: retro-orbital sinus, jugular vein, maxillary vein, saphenous vein, heart. Each technique has its advantages and disadvantages, and some are not approved any more in some countries (e.g., retro-orbital draws in Holland). A discussion of different techniques for drawing blood are available 1-3.
Here, we present two techniques for drawing blood from rats, each with its specific applications.
Blood draw from the saphenous vein, provided it is done properly, induces minimal distress in animals and does not require anesthesia. This technique allows repeated draws of small amounts of blood, such as needed for pharmacokinetic studies 4,5, determining plasma chemistry, or blood counts 6.
Cardiac puncture allows the collection of large amounts of blood from a single animal (up to 10 ml of blood can be drawn from a 150 g rat). This technique is therefore very useful as a terminal procedure when drawing blood from the saphenous would not provide a large enough sample. We use cardiac puncture when we need sufficient amounts of serum from a specific strain of rats to grow T lymphocyte lines in vitro 4-9.

Blood draws are necessary in a large number of studies, for example to study the pharmacokinetics profile of a compound. Here, we demonstrate how to draw blood from rats using two techniques: blood draw from the saphenous vein or by cardiac puncture.

Disegno di sangue di ratti attraverso la vena safena e da puntura cardiaca

Drawing blood from rodents is necessary for a large number of both in vitro and in vivo studies. Sites of blood draws are numerous in rodents: ...

Ricerca

Biologia

Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region

Micro-dissection of rat brain into various regions is extremely important for the study of different neurodegenerative diseases. This video demonstrates micro-dissection of four major brain regions include olfactory bulb, frontal cortex, striatum and hippocampus in fresh rat brain tissue. Useful tips for quick removal of respective regions to avoid RNA and protein degradation of the tissue are given.

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Micro-dissezione del cervello di ratto per estrazione RNA o proteine ​​da Regione specifiche del cervello

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Enrichment of NK Cells from Human Blood with the RosetteSep Kit from StemCell Technologies

Natural killer (NK) cells are large granular cytotoxic lymphocytes that belong to the innate immune system and play major roles in fighting against cancer and infections, but are also implicated in the early stages of pregnancy and transplant rejection. These cells are present in peripheral blood, from which they can be isolated. Cells can be isolated using either positive or negative selection. For positive selection we use antibodies directed to a surface marker present only on the cells of interest whereas for negative selection we use cocktails of antibodies targeted to surface markers present on all cells but the cells of interest. This latter technique presents the advantage of leaving the cells of interest free of antibodies, thereby reducing the risk of unwanted cell activation or differenciation. In this video-protocol we demonstrate how to separate NK cells from human blood by negative selection, using the RosetteSep kit from StemCell technologies. The procedure involves obtaining human peripheral blood (under an institutional review board-approved protocol to protect the human subjects) and mixing it with a cocktail of antibodies that will bind to markers absent on NK cells, but present on all other mononuclear cells present in peripheral blood (e.g., T lymphocytes, monocytes...). The antibodies present in the cocktail are conjugated to antibodies directed to glycophorin A on erythrocytes. All unwanted cells and red blood cells will therefore be trapped in complexes. The mix of blood and antibody cocktail is then diluted, overlayed on a Histopaque gradient, and centrifuged. NK cells (&gt;80% pure) can be collected at the interface between the Histopaque and the diluted plasma. Similar cocktails are available for enrichment of other cell populations, such as human T lymphocytes.

Natural killer cells are a small population of lymphocytes. Here we show how to isolate these cells from human blood by negative selection, using a kit from StemCell Technologies. The cells obtained are viable and untouched by antibodies, and therefore ready to be used for a number of procedures.

Arricchimento di cellule NK dal sangue umano con il kit RosetteSep Technologies StemCell

Natural killer (NK) cells are large granular cytotoxic lymphocytes that belong to the innate immune system and play major roles in fighting against cancer ...

Blood Collection from the American Horseshoe Crab, Limulus Polyphemus

The horseshoe crab has the best-characterized immune system of any long-lived invertebrate. The study of immunity in horseshoe crabs has been facilitated by the ease in collecting large volumes of blood and from the simplicity of the blood. Horseshoe crabs show only a single cell type in the general circulation, the granular amebocyte. The plasma has the salt content of sea water and only three abundant proteins, hemocyanin, the respiratory protein, the C-reactive proteins, which function in the cytolytic destruction of foreign cells, including bacterial cells, and &alpha;2-macroglobulin, which inhibits the proteases of invading pathogens. Blood is collected by direct cardiac puncture under conditions that minimize contamination by lipopolysaccharide (a.k.a., endotoxin, LPS), a product of the Gram-negative bacteria. A large animal can yield 200 - 400 mL of blood. For the study of the plasma, blood cells are immediately removed from the plasma by centrifugation and the plasma can then be fractionated into its constituent proteins. The blood cells are conveniently studied microscopically by collecting small volumes of blood into LPS-free isotonic saline (0.5 M NaCl) under conditions that permit direct microscopic examination by placing one of more LPS-free coverglasses on the culture dish surface, then mounting those coverglasses in simple observation chambers following cell attachment. A second preparation for direct observation is to collect 3 - 5 mL of blood in a LPS-free embryo dish and then explanting fragments of aggregated amebocytes to a chamber that sandwiches the tissue between a slide and a coverglass. In this preparation, the motile amebocytes migrate onto the coverglass surface, where they can readily be observed. The blood clotting system involves aggregation of amebocytes and the formation of an extracellular clot of a protein, coagulin, which is released from the secretory granules of the blood cells. Biochemical analysis of washed blood cells requires that aggregation and degranulation does not occur, which can be accomplished by collecting blood into 0.1 volumes of 2% Tween-20, 0.5 M LPS-free NaCl, followed by centrifugation of the cells and washing with 0.5 M NaCl.

The American horseshoe crab, Limulus polyphemus, is arguably the most convenient source for large quantities of blood of any invertebrate. The blood is simple in composition, with only one cell-type in the general circulation, the granular amebocyte, and only three abundant proteins in the plasma, hemocyanin, the C-reactive proteins, and &alpha;2-macroglobulin. Blood is collected from the heart and the blood cells and plasma are separated by centrifugation.

Raccolta di sangue dal Granchio Ferro di Cavallo Americano, Limulus Polifemo

The horseshoe crab has the best-characterized immune system of any long-lived invertebrate.  The study of immunity in horseshoe crabs has been facilitated ...

Preparation of Rat Tail Tendons for Biomechanical and Mechanobiological Studies

Rat tail tendons (RTTs) are a common biological model used in experimental in vitro studies in the fields of tendon physiology and tendinopathy. Working with those tissues is challenging because they are very fragile, and until now there was no rigorously detailed protocol for their isolation.
Faced with these challenges, we have developed methods and instruments to facilitate manipulation of RTTs and control tissue viability, sterility and integrity. This article describes the experimental procedures used to prepare RTTs for biomechanical and mechanobiological studies. Our work is divided into four main steps: extraction, cross-sectional area measurement, rinsing and loading into the bioreactor chamber.
At each step, all procedures, materials and manipulations are presented in detail so that they can be easily reproduced. Moreover, the specific instruments developed are presented: a manipulation plate used to segregate RTTs, an optic micrometer to position the tissue during the cross-sectional area measurement and an anchoring system to attach the RTTs onto a bioreactor.
Finally, we describe the results obtained after multiple tests to validate our methods. The viability, sterility and integrity evaluations demonstrate that our procedures are sufficiently rigorous for manipulations of fragile tissues such as rat tail tendons.

This article describes the experimental procedures used to prepare rat tail tendons for biomechanical and mechanobiological studies. Several features of the main steps in preparation are demonstrated, beginning with extraction, cross-sectional area measurement, rinsing and loading into the bioreactor chamber.

Preparazione dei tendini coda di topo per studi di biomeccanica e Mechanobiological

Rat tail tendons (RTTs) are a common biological model used in experimental in vitro studies in the fields of tendon physiology and tendinopathy. Working ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

Isolamento e la coltura di cellule endoteliali polmonari da topi neonati

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with real time imaging, it becomes feasible to determine permeability changes in individual pulmonary microvessels. Herein we describe steps to isolate rat lungs and perfuse them with autologous blood. Then, we outline steps to infuse fluorophores or agents via a microcatheter into a small lung region. Using these procedures described, we determined permeability increases in rat lung microvessels in response to infusions of bacterial lipopolysaccharide. The data revealed that lipopolysaccharide increased fluid leak across both venular and capillary microvessel segments. Thus, this method makes it possible to compare permeability responses among vascular segments and thus, define any heterogeneity in the response. While commonly used methods to define lung permeability require postprocessing of lung tissue samples, the use of real time imaging obviates this requirement as evident from the present method. Thus, the isolated lung preparation combined with real time imaging offers several advantages over traditional methods to determine lung microvascular permeability, yet is a straightforward method to develop and implement.

The isolated blood-perfused lung preparation makes it feasible to visualize microvessel networks on the lung surface. Here we describe an approach to quantify permeability of single microvessels in isolated lungs using real time fluorescence imaging.

Quantificare singolo microvasi Permeabilità in Isolata Blood-perfusione Rat Lung Preparazione

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Non-Terminal Blood Sampling Techniques in Guinea Pigs

Guinea pigs possess several biological similarities to humans and are validated experimental animal models1-3. However, the use of guinea pigs currently represents a relatively narrow area of research and descriptive data on specific methodology is correspondingly scarce. The anatomical features of guinea pigs are slightly different from other rodent models, hence modulation of sampling techniques to accommodate for species-specific differences, e.g., compared to mice and rats, are necessary to obtain sufficient and high quality samples. As both long and short term in vivo studies often require repeated blood sampling the choice of technique should be well considered in order to reduce stress and discomfort in the animals but also to ensure survival as well as compliance with requirements of sample size and accessibility. Venous blood samples can be obtained at a number of sites in guinea pigs e.g., the saphenous and jugular veins, each technique containing both advantages and disadvantages4,5. Here, we present four different blood sampling techniques for either conscious or anaesthetized guinea pigs. The procedures are all non-terminal procedures provided that sample volumes and number of samples do not exceed guidelines for blood collection in laboratory animals6. All the described methods have been thoroughly tested and applied for repeated in vivo blood sampling in studies within our research facility.

Though a known model, the guinea pig currently represents a niche in experimental animal sciences and limited data is available on the execution of most procedures. Here we present four different approaches to non-terminal in vivo blood sampling techniques in either conscious or anaesthetized guinea pigs.

Non terminale Tecniche di prelievo di sangue in Guinea Pigs

Guinea pigs possess several biological similarities to humans and are validated experimental animal models1-3. However, the use of guinea pigs currently ...

Efficient iPS Cell Generation from Blood Using Episomes and HDAC Inhibitors

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using episomal plasmids and histone deacetylase (HDAC) inhibitors. The advantages of this approach include: (1) the use of a minimal amount of peripheral blood as a source material; (2) nonintegrating reprogramming vectors; (3) a cost effective method for generating vector free iPSCs; (4) a single transfection; and (5) the use of small molecules to facilitate epigenetic reprogramming. Briefly, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are isolated from routine phlebotomy samples and then cultured in defined growth factors to yield a highly proliferative erythrocyte progenitor cell population that is remarkably amenable to reprogramming. Nonintegrating, nontransmissible episomal plasmids expressing OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, LIN28A, and a p53 short hairpin (sh)RNA are introduced into the derived erythroblasts via a single nucleofection. Cotransfection of an episome that expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) allows for easy identification of transfected cells. A separate replication-deficient plasmid expressing Epstein-Barr nuclear antigen 1 (EBNA1) is also added to the reaction mixture for increased expression of episomal proteins. Transfected cells are then plated onto a layer of irradiated mouse embryonic fibroblasts (iMEFs) for continued reprogramming. As soon as iPSC-like colonies appear at about twelve days after nucleofection, HDAC inhibitors are added to the medium to facilitate epigenetic remodeling. We have found that the inclusion of HDAC inhibitors routinely increases the generation of fully reprogrammed iPSC colonies by 2 fold. Once iPSC colonies exhibit typical human embryonic stem cell (hESC) morphology, they are gently transferred to individual iMEF-coated tissue culture plates for continued growth and expansion.

Here we describe a protocol for generating human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using an episome based reprogramming strategy and histone deacetylase inhibitors.

Generazione efficiente delle cellule iPS da Blood Utilizzando episomi e HDAC inibitori

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using ...

Detecting Establishment of Shared Blood Supply in Parabiotic Mice by Caudal Vein Glucose Injection

Parabiosis is an experimental method for surgically combining two parallel animals along the longitudinal axis of the body. We present a protocol for detecting the successful establishment of blood chimerism in parabionts by a caudal vein injection of glucose. Parabiotic mice were constructed. Glucose was injected into the donor mouse through the tail vein, and the fluctuation of blood glucose level was measured in both mice using a blood glucometer at different time points. Our results showed that after glucose injection, the blood glucose level in donor mice increased sharply after 1 min and decreased slowly thereafter. Meanwhile, the blood glucose level of the recipient mice peaked 15 min after injection. Similar results were obtained with Evans blue, used as a positive control for glucose. The synchronous fluctuation of blood glucose levels indicates that blood flow between the two mice was established successfully.

Here we describe a new method of detecting successful establishment of shared blood circulation of two parabionts through a caudal vein injection of glucose, which causes minimal damage and is not fatal to the parabionts.

Rilevare l'istituzione dell'afflusso di sangue condiviso nei topi parabiotici da Caudal Vein Glucose Injection

Parabiosis is an experimental method for surgically combining two parallel animals along the longitudinal axis of the body. We present a protocol for ...