Ringraziamo Ella Weinert, Michelle Helms e Marlis Badusche per l'eccellente assistenza tecnica, Jessica Börstler per analisi di zanzare Culex , Norbert Becker e Björn Pluskota per la fornitura di Aedes albopictus uova e Olli Vapalahti per fornendo lo stock di virus. ML è stato sostenuto dall'associazione Leibniz; concessione numero SAW-2014-SGN-3.

1. preparare le zanzare femmina
<ol><li>Raccogliere le zanzare da una gabbia grande utilizzando un aspiratore (circa 400 zanzare per grande gabbia).</li>
	<li>Anestetizzare le zanzare con l'anidride carbonica (CO2) per 7 s.</li>
	<li>Ordinare 20 femmine per flaconcino in plastica (Ø 50 mm × 100 mm). Nota: Se le zanzare si svegliano, utilizzare un altro 3 s di CO2.
</li>
	<li>Morire di fame le zanzare durante la notte.</li>
</ol>2. artificiale farine di sangue
Nota: Tutti i passaggi vengono eseguiti in condizioni di BSL-3.
<ol><li>
Preparare il pasto di sangue infettivo.
	<ol>
<li>Diluire lo stock di virus alla concentrazione di 1 x 108 placca formando unità (PFU) / mL. Nota: La concentrazione di magazzino è stata determinata eseguendo il metodo di coltura del tessuto infezione dose 50 (TCID50) e calcolata da Spearman & Kärber algoritmo10,11.</li>
		<li>Mix scaduto sangue umano (conservazione del sangue) dalla banca del sangue (non adatto per umano piu ', ma utile per le zanzare) con fruttosio (soluzione all'8%), filtrato siero bovino (FBS) e soluzione di lavoro dello stock virus (umano sangue: fruttosio: FBS è scaduto: soluzione di lavoro = 5:3:1:1). Nota: Abbiamo scelto il sangue umano, perché questo è l'ospite mammifero naturale noto di ZIKV.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Congelare 140 µ l di miscela di farine di sangue per ulteriori analisi tramite TCID50.</li>
	<li>
Eseguire la nutrizione artificiale utilizzando diversi metodi di alimentazione, a seconda della specie:
	<ol>
<li>
Aedes aegypti: utilizzare una membrana sistema di alimentazione per 30 min (1 mL / alimentatore).</li>
		<li>
Culex spp.: fornire il sangue infettivo tramite un bastoncino di cotone durante la notte e non riscaldare il sangue (300 µ l per flaconcino).</li>
		<li>
Aedes albopictus: mettere due gocce (50 µ l) del mix di farine di sangue nella fiala di plastica e lasciare che le zanzare feed per 2 h. Non riscaldare il sangue. Nota: Le zanzare confluiranno nel primo 15 min. Il tempo di incubazione prolungata è necessario per ragioni di sicurezza. Le goccioline di sangue vengono drenate dopo 2 h, che così si riduce il rischio di contaminazione durante l'ordinamento di alimentato le zanzare.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Anestetizzare le zanzare con CO2 per 7 s. Nota: Se le zanzare si svegliano, utilizzare un altro 3 s di CO2.</li>
	<li>Ordinamento e totali completamente gonfio le zanzare in un nuovo flacone.</li>
	<li>Aggiungere un batuffolo di cotone, saturato di fruttosio (8% soluzione) tra il flaconcino e una spina.</li>
	<li>Mantenere le zanzare alla temperatura di 18 ° C o di 27 ° C dell'umidità dell'80% designata per 14 o 21 giorni.</li>
	<li>Nutrire le zanzare con tamponi di cotone saturato di fruttosio. Ricostituire ogni 72h con 1,5 mL di fruttosio (8% soluzione) per flaconcino (fino a 20 zanzare, a seconda l'alimentazione frequenza, vedere passaggio 2.5).</li>
</ol>3. costretto salivazione saggio il giorno 14 o 21
Nota: Tutti i passaggi vengono eseguiti in condizioni di BSL-3.
<ol><li>2 x 104 cellule Vero di semi / per pozzetto in un 96 bene piastra con 200 µ l di terreno di coltura (Dulbecco´s modificato supplementato eagle (DMEM) con 3% FBS, 100 U/mL di penicillina, 100 mg/mL di streptomicina, 5 µ g/mL anfotericina B, 2 mM L-Glutammina 1% non essenziali aminoacidi (NEAA), piruvato di sodio 1%).</li>
	<li>
Preparare il dispositivo di salivazione:
	<ol>
<li>Posizionare una lastra di vetro quadrato (20 × 20 cm) sul banco in un angolo di 30°. Nota: Questa è necessaria a causa di depressione nel laboratorio di sicurezza. Se la piastra è orizzontale o verticale, sarà perdita di liquido.</li>
		<li>Posizionare il nastro biadesivo sulla parte superiore della lastra di vetro.</li>
		<li>Ruolo l'argilla di modellistica fino a quando raggiunge un diametro di 0,5 cm e attaccarlo in orizzontale 1 cm di distanza il nastro adesivo su due lati.</li>
		<li>Tagliare i primi 0,3 cm della punta di una punta di filtro 10 µ l. Nota: Si consiglia di preparare questo prima di iniziare l'esperimento di fuori del laboratorio di biosicurezza.</li>
		<li>Riempire i puntali con filtro con 10 µ l di tampone fosfato salino (PBS, pH 7.4).</li>
		<li>Posizionare i puntali con filtro sull'argilla di modellistica con la punta verso il nastro adesivo.</li>
		<li>Fissare le punte di filtro con una leggera pressione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparare le zanzare:
	<ol>
<li>Anestetizzare le zanzare con CO2.</li>
		<li>Rimuovere le gambe e le ali per immobilizzare le zanzare.</li>
		<li>Difficoltà la zanzara vivente corpi sul nastro appiccicoso sopra una punta di filtro.</li>
		<li>Inserire delicatamente la proboscide la punta del filtro.</li>
		<li>Eseguire il test di salivazione per 30 min.</li>
		<li>Rimuovere i puntali con filtro ed eliminare l'argilla e il nastro.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. elaborazione della Saliva
Nota: Passaggi 4.1 – 4.6.2 vengono eseguiti in condizioni di BSL-3.
<ol><li>Espellere il contenuto nelle provette di reazione contenente 10 µ l di PBS.</li>
	<li>Mescolare delicatamente e trasferire il contenuto nei pozzetti della piastra ben 96 preparati utilizzando un pozzetto per campione.</li>
	<li>Incubare la piastra per 7 giorni a 37 ° C con 5% CO2.</li>
	<li>Utilizzare il binocolo per controllare le cellule per la presenza di effetto citopatico (CPE).</li>
	<li>Se il pozzo è positivo per CPE, raccogliere il surnatante di pipettaggio 140 µ l in una provetta di reazione per l'estrazione di RNA.</li>
	<li>
Purificare il RNA utilizzando un kit di estrazione di RNA.
	<ol>
<li>Mix 140 µ l del surnatante con 560 µ l di AVL buffer (buffer di lisi virale) e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.</li>
		<li>560 µ l di etanolo (96%) e vortexare il campione. Nota: I campioni sono inattivati dopo questo passaggio e possono essere scaricati dal laboratorio BSL-3.</li>
		<li>Dispensare 630 µ l del campione su una colonna e la centrifuga con 6.000 x g per 1 min.</li>
		<li>Scartare il filtrato, dispensare il restante µ l 630 sulla colonna, quindi ripetere la centrifugazione.</li>
		<li>Lavare il RNA, associato alla membrana della colonna, aggiungendo 500 µ l di tampone 1 per la colonna e la centrifuga di lavaggio a 6.000 x g per 1 min.</li>
		<li>Gettare la provetta di raccolta e posizionare la colonna in una nuova provetta di raccolta. Aggiungere 500 µ l di tampone di lavaggio 2 e centrifugare a 12.500 x g per 3 min.</li>
		<li>Gettare la provetta di raccolta e posizionare la colonna in una provetta di reazione di 1,5 mL.</li>
		<li>Aggiungere 50 µ l di tampone di eluizione e incubare per 1 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Centrifugare a 6.000 x g per 1 min e poi scartare la colonna.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analizzare i campioni per ZIKV RNA tramite RT-qPCR.</li>
</ol>5. il trattamento dei corpi di zanzara
Nota: Passaggi 5.1 – 5.5 vengono eseguiti in condizioni di BSL-3.
<ol><li>Rimuovere i corpi della zanzara e collocare ogni corpo in una provetta di reazione. Nota: È possibile mettere in pausa l'esperimento a questo punto e conservare i campioni a-80 ° C.</li>
	<li>Aggiungere 500 µ l di media di omogeneizzazione (DMEM senza eventuali supplementi) nella provetta di reazione.</li>
	<li>Omogeneizzare il corpo usando motore sbattitore e utilizzare un pistillo nuovo per ogni campione.</li>
	<li>Aggiungere 200 µ l di omogenato in una piastra a 96 pozzetti per la purificazione. Nota: È possibile mettere in pausa l'esperimento a questo punto e conservare i campioni a-80 ° C.</li>
	<li>Inattivare la piastra mediante incubazione per 60 min a 60 ° C.</li>
	<li>Purificare il RNA da purificazione automatizzata degli acidi nucleici. Nota: È possibile mettere in pausa l'esperimento a questo punto e conservare i campioni a-80 ° C.</li>
</ol>6. analisi
<ol><li>Quantificare le copie di RNA virale usando RT-qPCR. Nota: Le copie di RNA erano una media sopra tutti i corpi di zanzara ZIKV-positiva e senza includere le zanzare ZIKV-negativi.</li>
	<li>Calcolare l'IR, definito come il numero di corpi di zanzara ZIKV-positivo per il numero di femmine nutrite.</li>
	<li>Calcolare il TR, definito come il numero di zanzare con la saliva ZIKV-positivo per il numero di corpi di zanzara ZIKV-positivi. Impossibile calcolare la velocità di trasmissione per combinazioni di specie e temperatura con nessun corpo ZIKV-positivi.</li>
</ol>

<ol><li>Musso, D., Gubler, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Zika Virus.</a> Clinical Microbiology Reviews. (3), 487-524 (2016).</li>
<li>World Health Organization Regional Office for Europpe (WHO/Europe). No Title. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.euro.who.int/en/health-topics/emergencies/zika-virus/technical-reports-and-guidelines-on-zika-virus/zika-virus-technical-report.-interim-risk-assessment-for-who-european-region">http://www.euro.who.int/en/health-topics/emergencies/zika-virus/technical-reports-and-guidelines-on-zika-virus/zika-virus-technical-report.-interim-risk-assessment-for-who-european-region</a> (2016).</li>
<li>Epelboin, Y., Talaga, S., Epelboin, L., Dusfour, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus%3A+An+updated+review+of+competent+or+naturally+infected+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Zika virus: An updated review of competent or naturally infected mosquitoes.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 11 (11), e0005933(2017).</li>
<li>Aliota, M. T., Peinado, S. A., Osorio, J. E., Bartholomay, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culex+pipiens+and+Aedes+triseriatus+Mosquito+Susceptibility+to+Zika+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Culex pipiens and Aedes triseriatus Mosquito Susceptibility to Zika Virus.</a> Emerging Infectious Diseases. (10), 1857-1859 (2016).</li>
<li>Turell, M. J., Linthicum, K. J., Patrican, L. A., Davies, F. G., Kairo, A., Bailey, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector+competence+of+selected+African+mosquito+%28Diptera%3A+Culicidae%29+species+for+Rift+Valley+fever+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Vector competence of selected African mosquito (Diptera: Culicidae) species for Rift Valley fever virus.</a> Journal of Medical Entomology. 45 (1), 102-108 (2008).</li>
<li>Cornel, A. J., Jupp, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+three+methods+for+determining+transmission+rates+in+vector+competence+studies+with+Culex+univittatus+and+West+Nile+and+Sindbis+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Mosquito+Control+Association%22%5BJournal%5D)">Comparison of three methods for determining transmission rates in vector competence studies with Culex univittatus and West Nile and Sindbis viruses.</a> Journal of the American Mosquito Control Association. 5 (1), 70-72 (1989).</li>
<li>Hurlbut, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito+salivation+and+virus+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Mosquito salivation and virus transmission.</a> The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 15 (6), 989-993 (1966).</li>
<li>Anderson, S. L., Richards, S. L., Smartt, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+determining+arbovirus+transmission+in+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Mosquito+Control+Association%22%5BJournal%5D)">A simple method for determining arbovirus transmission in mosquitoes.</a> Journal of the American Mosquito Control Association. 26 (1), 108-111 (2010).</li>
<li>Heitmann, A., Jansen, S., Lühken, R., Leggewie, M., Badusche, M., Pluskota, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+transmission+of+Zika+virus+by+mosquitoes+from+central+Europe%5BTitle%5D)+AND+%22Eurovsurveillance%22%5BJournal%5D)">Experimental transmission of Zika virus by mosquitoes from central Europe.</a> Eurovsurveillance. 22 (2), (2017).</li>
<li>Hierholzer, J. C., Killington, R. A. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780124653306500038">Virus Isolation and Quantitation - Virology methods manual</a>. , (1996).</li>
<li>Horzinek, R. W., Marian, C. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/j.1439-0442.1985.tb01965.x">Kompendium der allgemeinen Virologie.</a> Zentralblatt für Veterinärmedizin R A. 32 (1-10), 480(2010).</li>
<li>Richard, V., Paoaafaite, T., Cao-Lormeau, V. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector+Competence+of+French+Polynesian+Aedes+aegypti+and+Aedes+polynesiensis+for+Zika+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Vector Competence of French Polynesian Aedes aegypti and Aedes polynesiensis for Zika Virus.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (9), (2016).</li>
<li>Fortuna, C., Remoli, M. E., Di Luca, M., Severini, F., Toma, L., Benedetti, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+studies+on+comparison+of+the+vector+competence+of+four+Italian+Culex+pipiens+populations+for+West+Nile+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+%26+Vectors%22%5BJournal%5D)">Experimental studies on comparison of the vector competence of four Italian Culex pipiens populations for West Nile virus.</a> Parasites & Vectors. 8, 463(2015).</li>
<li>Weger-Lucarelli, J., Rückert, C., Chotiwan, N., Nguyen, C., Garcia Luna, S. M., et al. Vector Competence of American Mosquitoes for Three Strains of Zika Virus. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeger-Lucarelli%2C+J+%22PLOS+Neglected+Tropical+Diseases%22">PLOS Neglected Tropical Diseases</a>. Turell, M. J. 10 (10), (2016).</li>
<li>Dubrulle, M., Mousson, L., Moutailler, S., Vazeille, M., Failloux, A. -B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chikungunya+virus+and+Aedes+mosquitoes%3A+saliva+is+infectious+as+soon+as+two+days+after+oral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Chikungunya virus and Aedes mosquitoes: saliva is infectious as soon as two days after oral infection.</a> PLOS ONE. 4 (6), e5895(2009).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Precedentemente è stato indicato che i risultati ottenuti con salivazione forzata sono in linea con la classica rialimentazione esperimenti6. Tuttavia, ri-alimentazione esperimenti sia in nostro metodo presentato della salivazione forzata, è Impossibile direttamente prova attività salivazione o monitorare il rilascio di saliva. Per dimostrare l'attività di salivazione, campioni potrebbero essere testati per altri componenti presentano nella saliva (ad es., proteine, carboidrati, ecc.). Inoltre, ulteriori qPCRs dovrebbe consentire il rilevamento di copie di RNA virale. Questo, tuttavia, richiede frazionamento dei campioni di saliva per varie analisi, che possono limitare la sensibilità nell'analisi della cultura delle cellule in caso di numeri di particelle molto basso. A sua volta, questo potrebbe portare ad una sottovalutazione dei tassi di trasmissione determinato.
Per ottenere risultati riproducibili, è necessario garantire che tutte le zanzare rimanere in vita fino alla fine dell'esperimento. Questo è controllato controllando visivamente l'attività di movimento del corpo delle zanzare. Inoltre, l'uso del principio del dosaggio salivazione per una specie di zanzara dato deve essere testato alimentando virus di controllo, che sono conosciuti per essere trasmesso da questa specie di zanzara specifici. Viceversa, ogni virus introdotti in un esperimento deve essere testato in una zanzara suscettibile.
Saggi di salivazione forzata hanno molti vantaggi. Un numero elevato di zanzare possa essere testato contemporaneamente su un singolo esemplare base in condizioni standardizzate controllate senza entrare in conflitto con norme di benessere degli animali9.
Il metodo è utilizzato da diversi laboratori. Tuttavia, messe a punto esatti può variare, che può portare a differenze nei risultati tra i laboratori. Un componente critico è il capillare per raccogliere la saliva, che può essere fatto di vetro14 o plastica15. Per rispettare le norme di sicurezza ad alta di un insectary di livello 3 di biosicurezza, abbiamo usato plastica puntali con filtro invece di tubi capillari in vetro, riducendo così il rischio di lesioni. Inoltre, puntali con filtro hanno il vantaggio che il liquido raccolto possa essere trasferito facilmente utilizzando una pipetta.
L'installazione del dosaggio salivazione forzata qui presentato è basato su due ricercatori lavorano insieme e la condivisione di compiti. Smobilitazione della zanzara viene eseguita da una sola persona, mentre l'altro prepara simultaneamente l'installazione forzata salivazione. Ciò notevolmente riduce i tempi di movimentazione e minimizza il rischio di campione di commutazione come cambiare tra la smobilitazione-luogo di lavoro e la salivazione-piastra non è necessario. Inoltre, esso consente di posizionare le zanzare sul dispositivo salivazione forzato immediatamente dopo la smobilitazione. Questa zanzara piuttosto breve tempo di trattamento è essenziale per il successo salivazione forzata. Infine, le zanzare possono essere controllate direttamente per motilità in tutta l'intero esperimento.
Il dosaggio di salivazione presentato qui è usato per avere una chiara comprensione del potenziale vettoriale di specie di zanzare. Tuttavia, per rispondere a domande specifiche (ad es., i numeri di punture di zanzare che sono necessari per infettano i vertebrati), animale esperimenti potrebbero essere ancora necessari.

Nel 2015, virus di Zika (ZIKV), un virus zanzara (mobovirus), appartenente alla famiglia dei Flaviviridae, emerse in Colombia e in Brasile e si diffuse rapidamente in tutta l'America e i Caraibi, causando un'epidemia con un notevole numero di associati casi clinici di microcefalia e sindrome di Guillain-Barré1. Le zanzare della specie Aedes aegypti e Aedes albopictus sono considerate i vettori primari e secondari di ZIKV2, ma altre specie del genere Aedes hanno anche dimostrato di avere competenza vettoriale sperimentale3 . A differenza delle specie Aedes , la maggior parte della specie Culex testato finora non sono in grado di trasmettere il virus4. Semplicemente, i dati per Culex quinquefasciatus fornito risultati inconcludenti3. Allo stato attuale, manca un'informazione su competenza vettoriale zanzara per ZIKV in condizioni di temperatura moderata (< 20 ° C). Tuttavia, queste informazioni sono notevole per le valutazioni del rischio di spread possibili alle regioni con clima temperato come l'Europa centrale.
Un vettore competente per ZIKV è in grado di acquisire, mantenere, amplificare e infine trasmettere il virus. Di conseguenza, test zanzara corpi o parti di corpi, tra le gambe, del midgut, testa o ghiandole salivari, per ZIKV non è sufficiente per determinare la competenza vettoriale. È obbligatorio per verificare per particelle virali infettive all'interno della saliva rilasciata. Per valutare la competenza vettoriale, sia il tasso di infezione (IR, numero di corpi di zanzara ZIKV-positivo per il numero di zanzare gonfio) e velocità di trasmissione (TR, numero di zanzare con la saliva ZIKV-positivo per il numero di corpi di zanzara ZIKV-positivi), devono essere determinato. IRs di zanzare possono essere facilmente analizzati dalle zanzare semplicemente omogeneizzazione, seguite da una reazione a catena d'inversione-transcriptase della polimerasi in tempo reale (RT-qPCR) ZIKV di targeting. Inoltre, l'infezione può essere ulteriormente caratterizzato determinando i numeri di copia virale per zanzare. Al contrario, l'analisi dei tassi di trasmissione si basa sulla rilevazione delle particelle di virus vitale nella saliva delle zanzare individuali. Ciò può essere ottenuto alimentandosi di zanzare infette su animali ospite suscettibile, seguiti dall'analisi della viremia in host5. Tuttavia, questo metodo si basa sugli organismi di modello adatto ed è costoso e limitato dalle norme di benessere degli animali. Per evitare l'uso degli animali da laboratorio per l'analisi dei tassi di trasmissione e di ridurre i costi, ri-sistemi di alimentazione artificiale usando il sangue le goccioline sono stati descritti6. Tuttavia, test su scala individuale combinato con un elevato numero di individui è difficile e richiede tempo. La prima descrizione di un dosaggio di salivazione su scala individuale è stata pubblicata nel 19667 e durante gli anni recenti, salivazione forzata esperimenti sono diventati il metodo di scelta per valutare la competenza di vettore di zanzare3,8 .
Basato sul nostro studio di competenza vettoriale di Europa centrale le zanzare recentemente pubblicato9, descriviamo forzata salivazione, come riportato da Anderson et al. 8 con alcune modifiche. Questo metodo consente a resa elevata standardizzata esperimenti in condizioni di biosicurezza alto livello (BSL-3) e include l'identificazione del virus attivo di cultura basata su cellule saggi. Gli esperimenti descritti qui includono 856 zanzare. Sono stati infettati con ZIKV da farine di sangue artificiale e successivamente analizzati per la presenza di particelle virali infettive nella saliva. Le zanzare introdotte in esperimenti comprendeva due laboratorio consolidata popolazioni di biotipo Ae. aegypti e Culex pipiens pipiens molestus (Cx. p. molestus), come pure il campo catturato Culex pipiens pipiens biotipo pipiens (Cx. p. pipiens), Culex torrentium (Cx. torrentium) e due popolazioni di Ae. albopictus . Con l'eccezione di una delle due popolazioni Ae. albopictus , che è stato raccolto in Italia, tutte le zanzare sono stati raccolte in Germania.

<table><tbody><tr><td>Inject+matic Sleeper</td><td>Inject+matic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bugdorm-1 Insect Rearing Cage</td><td>BugDorm Store</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drosophila cultivation tubes</td><td>carl roth</td><td>PK11.2</td><td>plastic vial for mosquitoes</td></tr><tr><td>Plug for drosophila cultivation tubes</td><td>carl roth</td><td>PK15.1</td><td></td></tr><tr><td>Constant climate chamber</td><td>Binder</td><td>KBF-240</td><td></td></tr><tr><td>Blood</td><td></td><td></td><td>banked human blood, expired, not usable for medical application</td></tr><tr><td>Dumont-Pincette Electronic SS</td><td>Dumont</td><td>B40c</td><td></td></tr><tr><td>Vero cells</td><td>BNITM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flash light aspirator</td><td>Bioquip</td><td>2809</td><td></td></tr><tr><td>double-sided adhesive tape</td><td></td><td></td><td>no specific provider</td></tr><tr><td>Gammex Powder-free gloves with AMT</td><td>Ansell</td><td></td><td>for safety reasons necessary during work with pricks in the BSL3 laboratory</td></tr><tr><td>RealStar Zika Virus RT-PCR-Kit</td><td>altona diagnostics</td><td>591013</td><td></td></tr><tr><td>MagMax Pathogen RNA/DNA Kit</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>4462359</td><td>RNA isolation of mosquito bodies</td></tr><tr><td>Qiamp viral RNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>52906</td><td>RNA-Isolation of supernatant</td></tr><tr><td>filter tips (20 &amp;micro;L)</td><td>Sarstedt</td><td>701,116,210</td><td>Cut the first 3 mm of the tip</td></tr><tr><td>hand motor mixer</td><td>carl roth</td><td>sold out</td><td></td></tr><tr><td>micro pestles for hand motor mixer</td><td>carl roth</td><td>CXH8.1</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td></td><td>P0403550</td><td></td></tr><tr><td>L Glutamine Penicilin/Streptomycin</td><td>PAN</td><td>P0819100</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>PAN</td><td>P06-0110</td><td></td></tr><tr><td>Fructose</td><td>carl roth</td><td>4981.5</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>PAN</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>PAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvat</td><td>PAN</td><td>P0443100</td><td></td></tr><tr><td>MEM NAA</td><td>PAN</td><td>P0832100</td><td></td></tr><tr><td>Hemotek Feeder</td><td>Hemotek</td><td>PS6</td><td></td></tr><tr><td>Light Cycler</td><td>Roche</td><td>480 II</td><td></td></tr><tr><td>Light Cycler Software</td><td>Roche</td><td>480 SW 1.5.1</td><td></td></tr><tr><td>Modeling clay</td><td></td><td></td><td>no specific provider</td></tr><tr><td>King Fisher Flex Purification System</td><td>ThermoFisher scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Aedes albopictus&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>eggs were collected in Freiburg, Germany</td></tr><tr><td>Binocular</td><td>MOTIC</td><td>SMZ-168</td><td></td></tr><tr><td>Binocular light</td><td>MOTIC</td><td>MLC-150C</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-Incubator</td><td>Thermo scientific</td><td>MIDI 40</td><td></td></tr></tbody></table>

forced salivation as a method to analyze vector competence of mosquitoes

Competenza vettoriale è definito come il potenziale di una specie di zanzara per trasmettere un virus zanzara (mobovirus) ad un ospite vertebrato. Particelle di virus vitale vengono trasmessi durante un pasto di sangue tramite la saliva di una zanzara infetta. Saggi di salivazione forzata consentono di stabilire il potenziale di vettore sulla base di singole zanzare, evitando l'uso di esperimenti sugli animali. Il metodo è adatto per analizzare un gran numero di zanzare in un esperimento entro un breve periodo di tempo. Analisi di salivazione forzata sono state usate per analizzare 856 individuali zanzare intrappolate in Germania, tra cui due diversi biotipi di Culex pipiens pipiens , Culex torrentium nonché Aedes albopictus, che sono stati infettati sperimentalmente con il virus di Zika (ZIKV) e incubate a 18 ° C o 27 ° C per due o tre settimane. I risultati hanno indicato la mancanza di competenza vettoriale dei taxa diversi Culex per ZIKV. Al contrario, Aedes albopictus era suscettibile di ZIKV, ma solo a 27 ° C, con velocità di trasmissione simile a una colonia di laboratorio di Aedes aegypti testata in parallelo.

Aedes aegypti è noto come vettore competente per ZIKV almeno sotto condizioni climatiche tropicali12. Di conseguenza, abbiamo usato Ae. aegypti come controllo positivo per stabilire il dosaggio e analizzare IRs come pure TRs a una temperatura di incubazione di 27 ° C e un'umidità dell'80%. IR e TR sono stati definiti come precedentemente descritto da Fortuna et al. 13. contestato Ae. aegypti ha mostrato IR del 50% e 72% e TR del 42% e 31% a 14 e 21 giorni post infezione (dpi), rispettivamente (Figura 1A e 1B). Successivamente, le zanzare europee sono state testate per infezione ZIKV e trasmissione utilizzando condizioni climatiche tropicali così come temperate.
Temperatura di incubazione di 27 ° C, tutte le specie di zanzare ha mostrato l'infezione di ZIKV alle 14 dpi, nonché 21 dpi, tranne Cx. p. pipiens e Cx. torrentium individui, che è stata positiva solo 14 dpi. Tutte le specie di Aedes ha mostrato maggiore IRs (tra 50% e 72%) così come più alta concentrazione di RNA virale (106 fino a 10 campioni di copie/zanzara9 RNA) in confronto i diversi taxa di Culex , che ha rivelato IRs che varia tra 0 % e 32% e carichi virali di 103 a 10 esemplari di4 RNA copie/zanzara. Tutte le specie di Aedes visualizzato saliva ZIKV-positiva (TR 13 – 42%), mentre nessuno dei campioni di saliva dai taxa di Culex contenute ZIKV (Figura 1A e 1B). Interessante, velocità di trasmissione alle 21 dpi erano simili in Ae. aegypti e Ae. albopictus dalla Germania (30%), ma erano sostanzialmente più bassi in Ae. albopictus dall'Italia (13%).
Incubazione di zanzare sfidate ad una temperatura moderata di 18 ° C ha rivelato generalmente inferiore virus viene caricato nelle specie Aedes (4– 10 106 RNA copie/zanzara) così come in diversi taxa di Culex (102 –104 RNA copie/zanzara). Tuttavia, alla temperatura di incubazione di 18 ° C, trasmissione di ZIKV non è stata osservata per una delle specie di zanzara studiato.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57980/57980fig1.jpg"> Figura 1: tassi di trasmissione di zanzare infettati sperimentalmente con ZIKV. Risultati di studi di competenza vettoriale con ZIKV in specie diverse zanzare. Sei zanzara diversi taxa sono stati infettati con ZIKV e incubate a 27 ° C, 18 ° C per 14 (A) o 21 (B) giorni. TR è definito come il numero di zanzare con la saliva ZIKV-positivo per il numero di corpi di zanzara ZIKV-positivi. Il numero totale di zanzare studiato era 856, con un minimo di 30 persone per ogni taxa di zanzara/temperatura/punto di tempo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57980/57980fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes

Costretto la salivazione come un metodo per analizzare la competenza vettoriale delle zanzare

Per un controllo efficace della zanzara a carico di trasmissione del virus, la conoscenza del potenziale vettoriale delle rispettive zanzare è di particolare interesse. Descriviamo la salivazione forzato come un metodo per analizzare la competenza vettoriale di Aedes albopictus e tre diversi Culex taxa per la trasmissione del virus di Zika.

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus ...

forced-salivation-as-method-to-analyze-vector-competence

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

9.5K Views.  Bernhard Nocht Institute for Tropical Medicine. Per un controllo efficace della zanzara a carico di trasmissione del virus, la conoscenza del potenziale vettoriale delle rispettive zanzare è di particolare interesse. Descriviamo la salivazione forzato come un metodo per analizzare la competenza vettoriale di Aedes albopictus e tre diversi Culex taxa per la trasmissione del virus di Zika.

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Alphavirus Transducing System:  Tools for Visualizing Infection in Mosquito Vectors

Alphavirus transducing systems (ATSs) are important tools for expressing genes of interest (GOI) during infection. ATSs are derived from cDNA clones of mosquito-borne RNA viruses (genus Alphavirus; family Togaviridae). The Alphavirus genus contains about 30 different mosquito-borne virus species. Alphaviruses are enveloped viruses and contain single-stranded RNA genomes (~11.7 Kb). Alphaviruses transcribe a subgenomic mRNA that encodes the structural proteins of the virus required for encapsidation of the genome and maturation of the virus. Alphaviruses are usually highly lytic in vertebrate cells, but persistently infect susceptible mosquito cells with minimal cytopathology. These attributes make them excellent tools for gene expression in mosquito vectors. The most common ATSs in use are derived from Sindbis virus (SINV). The broad species tropism of SINV allows for infection of insect, avian, and mammalian cells8. However, ATSs have been derived from other alphaviruses as well9,10,20. Foreign gene expression is made possible by the insertion of an additional viral subgenomic RNA initiation site or promoter. ATSs in which an exogenous gene sequence is positioned 5' to the viral structural genes is used for stable protein expression in insects. ATSs, in which a gene sequence is positioned 3' to the structural genes, is used to trigger RNAi and silence expression of that gene in the insect.
ATSs have proven to be valuable tools for understanding vector-pathogen interactions, molecular details of viral replication and maintenance infectious cycles3,4,11,19,21. In particular, the expression of fluorescent and bioluminescent reporters has been instrumental tracking the viral infection in the vector and virus transmission5,14-16,18. Additionally, the vector immune response has been described using two strains of SINV engineered to express GFP2,9.
Here, we present a method for the production of SINV containing a fluorescent reporter (GFP) from the cDNA infectious clone. Infectious, full-length RNA is transcribed from the linearized cDNA clone. Infectious RNA is introduced into permissive target cells by electroporation. Transfected cells generate infectious virus particles expressing the GOI. Harvested virus is used to infect mosquitoes, as described here, or other host species (not shown herein). Vector competence is assessed by detecting fluorescence outside the midgut or by monitoring virus transmission7. Use of a fluorescent reporter as the GOI allows for convenient estimation of virus spread throughout a cell culture, for determination of rate of infection, dissemination in exposed mosquitoes, virus transmission from the mosquito and provides a rapid gauge of vector competence.

Methods for using alphavirus transducing systems to express fluorescent reporters in vitro and in adult mosquitoes are described. This technique may be adapted to express any protein of interest in lieu of or in addition to a reporter.

Sistema alfavirus trasduzione: Strumenti per la visualizzazione di infezione in Vettori Mosquito

Alphavirus transducing systems (ATSs) are important tools for expressing genes of interest (GOI) during infection.  ATSs are derived from cDNA clones of ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes. Investigation of transcripts and gene regulators that are expressed in tissues in which the mosquito host and pathogen interact, and in organs involved in reproduction are of great interest for strategies to reduce mosquito-borne disease transmission and disrupt egg development. A number of tools have been employed to study and validate the temporal and tissue-specific regulation of gene expression. Here, we describe protocols that have been developed to obtain spatial information, which enhances our understanding of where specific genes are expressed and their products accumulate. The protocol described has been used to validate expression and determine accumulation patterns of transcripts in tissues related to mosquito-borne pathogen transmission, such as female salivary glands, as well as subcellular compartments of ovaries and embryos, which relate to mosquito reproduction and development. 
 The following procedures represent an optimized methodology that improves the efficiency of various steps in the protocol without loss of target-specific hybridization signals. Guidelines for RNA probe preparation, dissection of soft tissues and the general procedure for fixation and hybridization are described in Part A, while steps specific for the collection, fixation, pre-hybridization and hybridization of mosquito embryos are detailed in Part B.

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Temporal and spatial gene expression analyses have a crucial role in functional genomics. Whole-mount hybridization in situ is useful for determining the localization of transcripts within tissues and subcellular compartments. Here we outline a hybridization in situ protocol with modifications for specific target tissues in mosquitoes.

Ibridazione<em&gt; In situ</em&gt; Delle ghiandole salivari, ovaie, e gli embrioni di Vector zanzare

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes.  Investigation of transcripts and gene ...

Use of a Recombinant Mosquito Densovirus As a Gene Delivery Vector for the Functional Analysis of Genes in Mosquito Larvae

In vivo microinjection is the most commonly used gene transfer technique for analyzing the gene functions in individual mosquitoes. However, this method requires a more technically demanding operation and involves complicated procedures, especially when used in larvae due to their small size, relatively thin and fragile cuticle, and high mortality, which limit its application. In contrast, viral vectors for gene delivery have been developed to surmount extracellular and intracellular barriers. These systems have the advantages of easy manipulation, high gene transduction efficiency, long-term maintenance of gene expression, and the ability to produce persistent effects in vivo. Mosquito densoviruses (MDVs) are mosquito-specific, small single-stranded DNA viruses that can effectively deliver foreign nucleic acids into mosquito cells; however, the replacement or insertion of foreign genes to create recombinant viruses typically causes a loss of packaging and/or replication abilities, which is a barrier to the development of these viruses as delivery vectors.
Herein, we report using an artificial intronic small-RNA expression strategy to develop a non-defective recombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) in vivo delivery system. Detailed procedures for the construction, packaging and quantitative analysis of the rAaeDV vectors, and for larval infection are described.
This study demonstrates, for the first time, the feasibility of developing a non-defective recombinant MDV micro RNA (miRNA) expression system, and thus providing a powerful tool for the functional analysis of genes in mosquito and establishing a basis for the application of viral paratransgenesis for controlling mosquito-borne diseases. We demonstrated that Aedes albopictus 1st instar larvae could be easily and effectively infected by introducing the virus into the water body of the larvae breeding site and that the developed rAaeDVs could be used to overexpress or knock down the expression of a specific target gene in larvae, providing a tool for the functional analysis of mosquito genes.

We report using an artificial intronic small RNA expression strategy to develop a non-defective recombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) in vivo delivery system. A detailed procedure for the construction, packaging, and quantitative analysis of the rAaeDV vectors as well as for larval infection is described.

Utilizzo di una zanzara ricombinante Densovirus come un vettore di consegna del Gene per l'analisi funzionale di geni in larve di zanzara

In vivo microinjection is the most commonly used gene transfer technique for analyzing the gene functions in individual mosquitoes. However, this method ...

Biologia dello sviluppo

Phenotypic Analysis of Rodent Malaria Parasite Asexual and Sexual Blood Stages and Mosquito Stages

Recent advances in genetics and systems biology technologies have promoted our understanding of the biology of malaria parasites on the molecular level. However, effective malaria parasite targets for vaccine and chemotherapy development are still limited. This is largely due to the unavailability of relevant and practical in vivo infection models for human Plasmodium species, most notably for P.&#160;falciparum and P. vivax. Therefore, rodent malaria species have been extensively used as practical alternative in vivo models for malaria vaccine, drug targeting, immune response, and functional characterization studies of conserved Plasmodiumspp. genes. Indeed, rodent malaria models have proven to be invaluable, especially for exploring mosquito transmission and liver stage biology, and were indispensable for immunological studies. However, there are discrepancies in the methods used to evaluate the phenotypes of transgenic and wild-type asexual and sexual blood-stage parasites.&#160;Examples of these discrepancies are the choice of an intravenous vs. intraperitoneal infection of rodents with blood-stage parasites and the evaluation of male gamete exflagellation. Herein, we detail standardized experimental methods to evaluate the phenotypes of asexual and sexual blood stages in transgenic parasites expressing reporter-gene or wild-type rodent malaria parasite species. We also detail the methods to evaluate the phenotypes of malaria parasite mosquito stages (gametes, ookinetes, oocysts, and sporozoites) inside Anopheles mosquito vectors. These methods are detailed and simplified here for the lethal and non-lethal strains of P. berghei and P. yoelii but can also be applied with some adjustments to P. chabaudi and P. vinckei rodent malaria species.

Due to the striking similarities of the life cycle and biology of rodent malaria parasites to human malaria parasites, rodent malaria models have become indispensable for malaria research. Herein, we standardized some of the most important techniques used in the phenotypic analysis of wild-type and transgenic rodent malaria species.

Phenotypic Analisi del roditore Malaria Parassita Sessuale e Sessuale Fasi Sangue e Mosquito Fasi

Recent advances in genetics and systems biology technologies have promoted our understanding of the biology of malaria parasites on the molecular level. ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine the rate of infection, disseminated infection, and potential transmission of the virus in the mosquito population in question. These procedures are widely utilized with various modifications in vector competence evaluations globally. They are important in determining the potential role that a given mosquito (i.e., species, population, individual) may play in the transmission of a given agent.

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The presented protocol can determine the vector competence of Aedes aegypti mosquito populations for a given virus, such as Zika, in a containment setting.

Analisi di competenza vettoriale sulle zanzare Aedes aegypti utilizzando il virus Zika

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public health. Once ingested, the viruses must overcome the mosquito midgut barrier to reach the hemolymph, from where they might potentially spread to the salivary glands. When a mosquito bites, these viruses are spread to new vertebrate hosts. Similarly, the mosquito may pick up different viruses. In general, only a tiny portion of viruses may enter the salivary glands via the gut. The transmission efficiency of these viruses to the glands is be affected by the two physical barriers found in different mosquito species: midgut barriers and salivary glands barriers. This protocol presents a method for virus detection in salivary glands of Aedes aegypti&#39;s&#160;following oral feeding and intrathoracic injection infection. Furthermore, determining whether the guts and/or salivary glands hinder viral spread can aid in the risk assessments of MBVs transmitted by Aedes aegypti.

This methodology, which included oral feeding and intrathoracic injection infection, could effectively assess the influence of midgut and/or salivary gland barriers on arbovirus infection.

Infezione virale sperimentale nelle zanzare adulte mediante alimentazione orale e microiniezione

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public ...

A Bacterial Oral Feeding Assay with Antibiotic-Treated Mosquitoes

The mosquito midgut harbors a highly dynamic microbiome that affects the host metabolism, reproduction, fitness, and vector competence. Studies have been conducted to investigate the effect of gut microbes as a whole; however, different microbes could exert distinct effects toward the host. This article provides the methodology to study the effect of each specific mosquito gut microbe and the potential mechanism.
This protocol contains two parts. The first part introduces how to dissect the mosquito midgut, isolate cultivable bacteria colonies, and identify bacteria species. The second part provides the procedure to generate antibiotic-treated mosquitoes and reintroduce one specific bacteria species.

This article presents a protocol to investigate the effect of individual mosquito gut bacteria, including isolation and identification of mosquito midgut cultivable microbes, antibiotic depletion of mosquito gut bacteria, and reintroduce one specific bacteria species.

Un saggio di alimentazione orale batterico con zanzare trattate con antibiotici

The mosquito midgut harbors a highly dynamic microbiome that affects the host metabolism, reproduction, fitness, and vector competence. Studies have been ...

Biologia

Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection

Rice stripe virus (RSV), which causes significant economic loss of agriculture in East Asia, entirely depends on insect vectors for its effective transmission among host rice. Laodelphax striatellus (small brown planthopper, SBPH) is the primary insect vector that horizontally transmits RSV while sucking sap from the phloem. Saliva plays a significant role in insects' feeding behavior. A convenient method that will be useful for research on insects' saliva with piercing-sucking feeding behavior is described here. In this method, insects were allowed to feed on an artificial diet sandwiched between two stretched paraffin film layers. The diet containing the saliva was collected each day, filtered, and concentrated for further analysis. Finally, the quality of collected saliva was examined by protein staining and immunoblotting. This method was exemplified by detecting the presence of RSV and a mucin-like protein in the saliva of SBPH. These artificial feeding and saliva collection method will lay a foundation for further research on factors in insect saliva related to feeding behavior and virus transmission.

Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection

The present protocol describes a method to collect sufficient saliva from piercing-sucking insects using an artificial medium. This is a convenient method for collecting insect saliva and studying salivary function on insect feeding behavior and vector-borne virus transmission.

Metodo sandwich a membrana a due strati per la raccolta della saliva di Laodelphax striatellus

Rice stripe virus (RSV), which causes significant economic loss of agriculture in East Asia, entirely depends on insect vectors for its effective ...

Dissection and Immunostaining of Larval Salivary Glands from Anopheles gambiae Mosquitoes

Mosquito salivary glands (SGs) are a requisite gateway organ for the transmission of insect-borne pathogens. Disease-causing agents, including viruses and the Plasmodium parasites that cause malaria, accumulate in the secretory cavities of SG cells. Here, they are poised for transmission to their vertebrate hosts during a subsequent blood meal. As adult glands form as an elaboration of larval SG duct bud remnants that persist beyond early pupal SG histolysis, the larval SG is an ideal target for interventions that limit disease transmission. Understanding larval SG development can help develop a better understanding of its morphology and functional adaptations and aid in the assessment of new interventions that target this organ. This video protocol demonstrates an efficient technique for isolating, fixing, and staining larval SGs from Anopheles gambiae mosquitoes. Glands dissected from larvae in a 25% ethanol solution are fixed in a methanol-glacial acetic acid mixture, followed by a cold acetone wash. After a few rinses in phosphate-buffered saline (PBS), SGs can be stained with a broad array of marker dyes and/or antisera against SG-expressed proteins. This method for larval SG isolation could also be used to collect tissue for in situ hybridization analysis, other transcriptomic applications, and proteomic studies.

Dissection and Immunostaining of Larval Salivary Glands from Anopheles gambiae Mosquitoes

The adult mosquito salivary gland (SG) is required for the transmission of all mosquito-borne pathogens to their human hosts, including viruses and parasites. This video demonstrates efficient isolation of the SGs from the larval (L4) stage Anopheles gambiae mosquitoes and preparation of the L4 SGs for further analysis.

Dissezione e immunocolorazione delle ghiandole salivari larvali da zanzare Anopheles gambiae

Mosquito salivary glands (SGs) are a requisite gateway organ for the transmission of insect-borne pathogens. Disease-causing agents, including viruses and ...

Detecting Virus and Salivary Proteins of a Leafhopper Vector in the Plant Host

Insect vectors horizontally transmit many plant viruses of agricultural importance. More than one-half of plant viruses are transmitted by hemipteran insects that have piercing-sucking mouthparts. During viral transmission, the insect saliva bridges the virus-vector-host because the saliva vectors viruses, and the insect proteins, trigger or suppress the immune response of plants from insects into plant hosts. The identification and functional analyses of salivary proteins are becoming a new area of focus in the research field of arbovirus-host interactions. This protocol provides a system to detect proteins in the saliva of leafhoppers using the plant host. The leafhopper vector Nephotettix cincticeps infected with rice dwarf virus (RDV) serves as an example. The vitellogenin and major outer capsid protein P8 of RDV vectored by the saliva of N. cincticeps can be detected simultaneously in the rice plant that N. cincticeps feeds on. This method is applicable for testing the salivary proteins that are transiently retained in the plant host after insect feeding. It is believed that this system of detection will benefit the study of hemipteran-virus-plant or hemipteran-plant interactions.

This protocol demonstrates how to use the plant host to detect salivary proteins of leafhopper and plant viral proteins released by leafhopper vectors.

Rilevamento del virus e delle proteine salivari di un vettore cicalina nell'ospite della pianta

Insect vectors horizontally transmit many plant viruses of agricultural importance. More than one-half of plant viruses are transmitted by hemipteran ...