Questo protocollo fornisce una tecnica per rilevare le proteine salivari delle cicaline e degli ospiti delle piante per indagare ulteriormente la funzione di queste proteine negli ospiti della pianta. Questa tecnica è facile da eseguire e il sistema è stabile e replicabile. Questo metodo potrebbe anche essere utile nella rilevazione di proteine salivari di altri emitteri e ospiti vegetali.
Per iniziare, alleva le cicaline adulte su piantine di riso in una gabbia cubica di 40 per 35 per 20 centimetri. Tenere un lato della gabbia coperto con una rete a prova di insetti per la ventilazione. Posizionare le gabbie con le cicaline in un'incubatrice contenente un regolatore di umidità integrato a 26 gradi Celsius con un'umidità relativa compresa tra il 60 e il 75% in un periodo fotografico di 16 ore di luce e otto ore di buio.
Una volta alla settimana, utilizzare un aspiratore per trasferire delicatamente tutti gli adulti dalla loro gabbia in una nuova gabbia contenente piantine di riso fresco. Consentire a più di 200 adulti di accoppiarsi e deporre le uova nel riso. Conserva le vecchie piantine di riso affinché le ninfe emergano e alleva queste nuove ninfe non virulifere al secondo stadio instar.
Usando l'aspiratore, trasferire con attenzione le ninfe non virulifere del secondo stadio in un tubo di coltura di vetro per una o due ore per la fame. Quindi rilasciare le ninfe in una gabbia contenente una pianta di riso infetta da virus nano del riso coltivata in una pentola e consentire alle ninfe di nutrirsi della pianta di riso infetta per due giorni. Dopo due giorni, trasferire con cura queste ninfe in una nuova gabbia che contenga piantine di riso fresche prive di virus e consentire alle ninfe di nutrirsi delle piantine di riso prive di virus per 12 giorni per completare il periodo di trasmissione circolativa del virus nano del riso.
Per raccogliere le proteine salivari, preparare cinque piccole gabbie di alimentazione simili a tubi coperte da reti a prova di insetti su un'estremità. Dopo aver confinato da 15 a 20 cicaline in ogni gabbia, coprire l'altra estremità della gabbia con un sottile tappetino di schiuma. Fissare una piantina di riso tra l'estremità della gabbia e un tappetino di schiuma con nastri, assicurandosi che le cicaline nella gabbia di alimentazione possano nutrirsi delle piantine di riso esposte all'interno della gabbia.
Immergere le radici della piantina in acqua in modo che la pianta di riso rimanga viva e consentire alle cicaline di nutrirsi di esse per due giorni. Dopo due giorni, rimuovere le cicaline dalle loro gabbie di alimentazione e raccogliere le piantine di riso su cui si sono nutrite le cicaline. Tagliare le piantine fuori dalla gabbia e recuperare le regioni di alimentazione delle piantine.
Preparare 1x tampone Tris-Glycine diluendo 200 millilitri del tampone 5x preparato con 800 millilitri di acqua sterile. Quindi preparare 10x tampone TBS e autoclavare la soluzione a 121 gradi Celsius per 15 minuti. Quindi, preparare il tampone del campione proteico 4x.
Quindi preparare il tampone di trasferimento mescolando 800 millilitri del tampone Tris-Glycine con 200 millilitri di metanolo. Infine, preparare la soluzione TBST aggiungendo 100 millilitri di 10x TBS e tre millilitri di Tween da 20 a 900 millilitri di acqua sterile. Per rilevare le proteine salivari e virali, macinare 0,1 grammi dei campioni di riso con azoto liquido fino a quando il tessuto diventa una polvere.
Quindi aggiungere 200 microlitri del tampone del campione proteico 4x al campione e far bollire per 10 minuti. Centrifugare i campioni e trasferire il surnatante in un nuovo flaconcino. Caricare 10 microlitri del campione su un gel SDS-PAGE ed eseguirlo in tampone Tris-Glycine a 150 volt per 45-60 minuti.
Mentre il gel è in esecuzione, posizionare una membrana di nitrocellulosa da 0,45 micron e altre forniture sandwich nel tampone di trasferimento per 30 minuti. Dopo la corsa, inserire il gel e trasferirlo per 90-120 minuti a 100 volt nel tampone di trasferimento. Al termine dell'assatura, posizionare la membrana in una soluzione di blocco del latte secco senza grassi al 7% in TBST e incubare per 20 minuti.
Successivamente, aggiungere un anticorpo contro il virus nano del riso P8 o la vitellogenina e incubare la membrana per due ore o durante la notte. Dopo l'incubazione, lavare la membrana con TBST tre volte con un'incubazione di cinque minuti tra ogni lavaggio. Quindi aggiungere IgG anti-coniglio di capra come anticorpo secondario e incubare la membrana per 60-90 minuti.
Utilizzare il kit ECL Western per la rilevazione chemiluminescente nei reagenti di rivelazione misti uno e due nel kit con un rapporto di uno a uno. Mettere la membrana sul reagente miscelato e incubare la macchia per cinque minuti. Drenare il reagente in eccesso e scattare una foto chemiluminescente e colorimetrica della membrana.
Combina le immagini per vedere quest'ultimo con bande proteiche. L'analisi Western blot per il rilevamento della vitellogenina ha mostrato bande specifiche e attese di circa 220 kilodalton nell'alimentazione delle piante di riso e delle ghiandole salivari degli insetti. Al contrario, nessuna banda è stata osservata nelle piante non nutritrici, indicando che la vitellogenina è stata rilasciata nell'ospite della pianta come proteina salivare.
L'analisi Western blot per il rilevamento della proteina P8 del virus nano del riso ha mostrato una banda specifica e prevista di circa 46 kilodalton nelle piante nutritrici e nei corpi di insetti viruliferi. Al contrario, nessuna banda è stata osservata nelle piante non nutritrici e nei corpi di cicaline non virulifere, dimostrando che le proteine virali potrebbero essere rilevate anche nelle piante nutrienti. La carica virale nelle cicaline, i tempi di rilevamento e le repliche devono essere presi in considerazione durante l'esecuzione di questo protocollo.
Questo metodo può essere applicato anche per studiare le zanzare che trasmettono arbovirus.
