Mosquito midgut ospita una complessa comunità di microbi che influenzano il metabolismo dell'ospite, la riproduzione, la forma fisica e la competenza veterinaria. Con ogni microbo intestinale è un effetto diverso. Questo video introduce la procedura per studiare il rispettivo ruolo di ogni ceppo batterico o fisiologia ospite.
Per acquisire una coltura di colonie batteriche intestinali, sezionare il midgut della zanzara in condizioni sterili. Macinate la midgut sezionata, serotologinate e sparpanate sul piatto di agar. Scegli singole colonie dalla piastra e identifica le specie di batteri attraverso la loro sequenza genica di 16 SRNA.
Nutrire le zanzare con goffratura COD contenente antibiotici per un periodo consecutivo di tre giorni per rimuovere il microbiota intestinale. L'efficacia del trattamento antibiotico può essere confermata sezionando il midgut della zanzara asettica per il test dell'unità di formazione della colonia prima dei successivi estremisti. Quindi reintrodurre specifiche specie di batteri che in precedenza si isolavano dall'intestino delle zanzare tramite test di alimentazione orale.
L'effetto dei batteri sulla fisiologia dell'ospite potrebbe essere valutato confrontando le zanzare non trattate, le zanzare trattate con antibiotici e le zanzare reintrodotta un contenimento specifico. Dissezione del midgut e isolamento batterica coltivabile. Per cominciare, raccogli le zanzare in gabbia con un aspiratore e celli le zanzare nella scatola di raccolta.
Anestetizza le zanzare sottosondo una temperatura di 4 gradi per tre o cinque minuti. Mantenere le zanzare anestetizzate mettendole in una piastra di Petri ghiacciata. Disinfettare il banco, sezionando il microscopio e le bombolette spruzzando il 75% di etanolo per evitare la contaminazione da batteri dall'ambiente.
Sterilizzare in superficie la zanzara nastrandole e scuotendole al 75% di etanolo per tre minuti e risciacquare due volte con tampone PBS. Bisect la zanzara separatamente su uno scivolo di vetro sterile contenente la goccia di PBS. Rimuovere con cura le gambe, le ali e la testa della zanzara usando le forcep.
Bloccare il torace della zanzara e l'ultima sezione dell'addome era pinza e separarsi per isolare il tratto digestivo. Utilizzare le forcep per rimuovere il raccolto e il tubo malpighiano dal tratto digestivo. Il raccolto viene posizionato sul pnterior di midgut e rigonfiamenti dopo aver ingerito acqua zuccherata.
I tubi malpighiani sono un gruppo di tubi escretori sottili sulla giunzione di midgut e hindgut. Mettere il trucco sezionato in tubo EP con tampone PBS sterile da 200 microlitri e macinarlo con il pastore di macinazione sterile nella panca pulita. Cereali per caricare l'omogeneato a tre delusioni di tempo a 50 microlitri di ogni illusione sul piatto di agar LB e piatto disperato.
Incubare la piastra come 37 gradi per uno o due giorni fino a quando le singole colonie sono fattibili. Raccogliere singole colonie in un pallone conico da 150 millilitri contenente 50 milliliter lb bras medium. scuotere i batteri a 37 gradi durante la notte.
Identificazione delle specie. Estrarre il DNA TOTO dal kit di costruzione del DNA genomico batterico e amplificare 16 SRDNA da PCR. Recupero e purificazione dei frammenti di DNA dai prodotti PCR mediante elettroforesi in gel ambrogio e kit di recupero guidato.
Ha eseguito il sequenziamento del DNA sui frammenti di DNA purificati per avere una sequenza di catene batteriche raggiunta. Esegui la ricerca dell'esplosione per una query sulla sequenza genica di 16 SRNA di identificare i batteri contro i batteri e l'archea e il database. L'identificazione al livello della specie è stata definita come maggiore o uguale alla somiglianza della sequenza SRDNA del 99%16 con l'ingresso bancario della squadra più vicino.
L'isolato è stato assegnato al genere corrispondente, quando è di 16 sequenze SRDNA, la somiglianza era inferiore al 99% e maggiore o uguale al 95% di trattamento antibiotico e ri-introduzione del batterio. pesare la quantità richiesta di penicillina di saccarosio e streptomicina per prepararci la soluzione di saccarosio al 10%, incluso provare 20 unità di penicillina e 20 microgrammi di streptomicina per millilitro. Infiltrarsi nei batuffoli di cotone nella soluzione di saccarosio contenente antibiotici e posizionarlo sopra la parte superiore del foglio di carta contenente zanzara.
Coprire il batuffolo di cotone con una piastra di Petri di 10 centimetri per evitare che un lungomare evapori. Sostituire i batuffoli di cotone due volte al giorno e nutrire la zanzara per un periodo consecutivo di tre giorni. Le zanzare sono divise in due gruppi.
Il primo gruppo è stato collocato in una tazza di zanzara senza alcun trattamento, qualsiasi medico batuffolo di cotone con 10%Quindi la croce è stata data ogni giorno. Il secondo gruppo è stato trattato con antibiotici e servire per tre giorni. In ogni gruppo, le zanzare Sergei sono state sezionate.
La Mika è stata estratta per l'estrazione totale del DNA e il QPCR è stato eseguito utilizzando primer di batteri universali, la figura uno mostra l'espressione di 16 SRNA nel gruppo di controllo e nel gruppo di trattamento antibiotico. I risultati mostrano che il costo o la realizzazione della penicillina e della streptomicina ha avuto successo. preparare una soluzione batterica, misurare una soluzione batterica nel virus con uno spettrofotometro, aggiungere una sospensione batterica OT nel tubo EP.
Centrifugare la sospensione a 5.000 RCA per cinque minuti a quattro gradi Scartare il supernatante, lavare i tentativi di pallet batterici con tampone PBS sterile. Sospendere di nuovo il pallet batterico con tampone PBS sterile da 200 microlitri Aggiungere 600 microlitri, soluzione di saccarosio al 10%, 200 microlitri ATP e sospensione batterica a 200 microlitri in un nuovo tubo AP e mescolare bene. In alternativa, i batteri possono essere sospesi di calore per attivare il sangue.
Preparazione del riscaldamento del sangue attivato. coagulare sangue fresco con tubo anticoagulante, assumere da due a tre millilitri di sangue fresco. centrifuga a 1000 per 10 minuti a quattro gradi per separare plasma e cellule del sangue.
Raccogliere il plasma in un nuovo tubo EP e attivare attivato a 56 gradi per un'ora. Lavare blast house attraverso i tempi con tampone PBS sterile. Risciacquare l'esplosione sospesa con plasma attivato dal riscaldamento.
Assemblare membrana e sistema di alimentazione. Tirare la malattia del film al massimo. fissare con l'anello di plastica e il parafilm del posto di lavoro per evitare perdite aggiungere lentamente la soluzione batterica preparata all'unità di alimentazione, al portafoglio massimo.
Per evitare che la bolla cadesse da una direzione e sigillare l'unità di alimentazione. Collegare l'alimentatore. Attendere che la temperatura raggiunga i 37 gradi Installato l'unità di alimentazione con soluzione batteria sull'alimentatore.
Prima di nutrire i batteri le zanzare devono essere fermate per 24 ore per metabolizzare gli antibiotici. Per l'unità di alimentazione sulla tazza di carta con zanzare, quindi consentire l'alimentazione per 90 minuti. Le zanzare pienamente incoraggiate potrebbero essere scelte per ulteriori studi.
Risultati rappresentativi. La figura due ci mostra il riconoscimento medio per zanzara. Dopo l'alimentazione della trama di antibiotico trattato le zanzare vediamo meningosepticum.
La figura tre mostra l'espressione di una variante dei geni correlati allo sviluppo 24 ore dopo la farina di sangue contenente il meningosettico C. I risultati mostrano che non vi è alcun cambiamento significativo nella produzione di uova del gruppo di controllo e del gruppo di sbiadimento. Grazie per il tuo interesse per i batteri o un saggio di alimentazione con zanzare trattate con antibiotici.
