Le ghiandole salivari degli insetti sono necessarie per trasmettere molte malattie umane. Quindi una migliore comprensione della biologia delle ghiandole salariali dovrebbe aiutarci, aggiungere alle strategie esistenti per la prevenzione delle malattie. Questa tecnica ci permetterà, di chiederci rapidamente se mutazioni nei regolatori candidati, influenzano la morfologia, delle ghiandole salivari larvali della zanzara, e potenzialmente influenzano la trasmissione, dei parassiti malarici.
Le prime volte che lavori con le larve di zanzara, sono difficili da afferrare mentre si muovono rapidamente. Più pratichi, meglio ottieni. Ad iniziare con la procedura, sarà Marisol Luchetti, assistente di ricerca universitaria per il mio laboratorio.
Per iniziare l'esperimento, posiziona una piastra vasino sul palco di un microscopio di dissezione e trasferisci 10 larve di zanzara L4 sulla piastra vasino. Quindi posizionare una goccia della soluzione di dissezione, sulla piastra vasino separata dalle larve. Utilizzare una pinza per posizionare una larva L4, nella goccia di soluzione di dissezione del 25% di etanolo.
Tenendo una pinza numero cinque in ogni mano, afferrare le larve con una pinza appena sotto la testa, con la mano dominante, e afferrare la testa della larva con la mano non dominante, quindi tirare delicatamente la testa con una forza minima costante, per staccarsi dal resto del corpo, mentre le ghiandole rimangono attaccate alla testa. Dopo aver scartato la parte corporea della carcassa della larva, raccogliere la testa o le ghiandole salivari, in un millilitro di PBS, in un tubo micro centrifugo da 1,5 millilitri e attendere che le ghiandole salivari affondino sul fondo del tampone. Il giorno successivo, scolare la soluzione per fissare i tessuti, con un millilitro di acetone freddo al 100% per 90 secondi.
Dopo aver rimosso l'acetone, sciacquare delicatamente i tessuti tre volte, con un millilitro di PBS. Per l'immunocolorazione, aggiungere un anticorpo primario come Rab 11, alla diluizione appropriata, in 200 microlitri del volume totale di PBS. Ruotare delicatamente il contenuto del tubo con una punta della pipetta.
Incubare gli anticorpi primari durante la notte a quattro gradi, seguiti dal lavaggio tre volte in un millilitro di PBS. Quindi aggiungere l'anticorpo secondario, Alexa Fluor 488 Goat anti-Rabbit, alla diluizione appropriata, in 200 microlitri di volume totale. Dopo aver miscelato il contenuto con una punta di pipetta, incubare i tessuti con coloranti, come il rosso Nilo, e Hoechst in 200 microlitri di PBS, a temperatura ambiente per 60 minuti, seguiti dal lavaggio tre volte con PBS.
Preparare un vetrino per microscopio, aggiungendo 200 microlitri di glicerolo al 100% con una pipetta e trasferendo fino a 20 teste colorate, con le ghiandole e le strutture interne attaccate, per vetrino del microscopio usando una spazzola morbida. Distribuire i campioni di testa, per distribuirli uniformemente lungo il vetrino. Osservando al microscopio sezionante, separare la testa larvale dalle ghiandole, usando due paia di pinze, tirando con cura i due tessuti in direzioni opposte.
Quando tutti i campioni sono fatti, posizionare delicatamente un coperchio di 1,5 millimetri di spessore, sopra il vetrino, evitando la formazione di bolle d'aria, quindi sigillare il vetrino con smalto trasparente. Le ghiandole salivari sono relativamente facili da sezionare, dalle larve del quarto stadio. Le larve maschili e femminili possono essere distinte, allo stadio larvale L4 tardivo da una striscia rossa, lungo il torace dorsale delle femmine.
La morfologia antennale è anche più elaborata, nei maschi che nelle larve L4 femminili come si può vedere, con le frecce bianche che indicano, le antenne femminili nell'immagine a sinistra e le antenne maschili a destra. Le ghiandole salivari isolate dalle prime larve dello stadio L4, macchiate di Hoechst, rivelano i lobi prossimali e distali, separati da una stretta costrizione. Il lume di formazione è stato esaminato, nella ghiandola salivare distale immuno macchiata, di una larva L4 medio-tardiva.
I domini apicali delle cellule secretorie, che circondano il lume di formazione, avevano un'intensa colorazione rosso Nilo, suggestiva di strutture simili a microvilli. La colorazione Rab 11 è stata osservata vicino alla superficie apicale. C'è solo un passo con il tempo, e questo è l'incubazione di 90 secondi, dei tessuti in acetone freddo.
Questo protocollo è stato sviluppato solo di recente, ma ci aspettiamo che sarà utile, a chiunque lavori sulla ghiandola salivare della zanzara. Ci aspettiamo di usarlo spesso.
