Questo saggio è stato sviluppato per affrontare le questioni chiave nel campo della biologia delle membrane plasmatiche e per stabilire come le cellule danneggiate in modo efficiente possano risigillare la loro membrana plasmatica. Questa tecnica può essere utilizzata per misurare l'efficienza del resealing della membrana plasmatica in una capacità ad alta produttività e per identificare proteine specifiche e percorsi corrispondenti che mediano il resealing della membrana plasmatica. Inizia aggiungendo 20 millilitri di una pipetta sierologica 2,5 per 10 alla quinta cellula HeLa per millilitro di sospensione media di crescita in un bacino di pipetta sterile e usa una pipetta sierologica da 10 millilitri per mescolare accuratamente le cellule.
Successivamente, utilizzare una micropipetta multicanale per seminare 100 microlitri di cellule per pozzo in triplice copia in una piastra trattata con coltura di tessuto polistirolo nero a 96 po 'di fondo piatto e chiaro. Ricorda che una distribuzione omogenea delle cellule è la chiave per un esperimento riuscito poiché i confronti tra tutte le condizioni sperimentali richiedono conteggi di cellule equivalenti. Dopo 24 ore nell'incubatore di coltura cellulare umidificato a 37 gradi Celsius e 5%CO2, prevendite il lettore di piastre a 37 gradi Celsius e impostate la configurazione ottica sul monocromatore, la modalità di lettura sulla fluorescenza e il tipo di lettura sulla cinetica.
Sotto le impostazioni della lunghezza d'onda, selezionare un'eccitazione di nove nanometri e un pass di emissione di 15 nanometri. Per i saggi che usano lo ioduro di propidio, impostare le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione rispettivamente a 535 nanometri e 617 nanometri. Sotto il tipo di piastra, selezionare 96 pozzi per il formato della piastra e selezionare una configurazione della piastra preimpostata corrispondente a una piastra inferiore chiara della parete nera.
Sotto l'area di lettura, evidenziare i pozzi che verranno analizzati durante il saggio cinetico. In PMT e ottica preimpostare i flash per lettura a sei e selezionare la casella per la lettura dal basso. In tempo, immettere zero ore e 30 minuti e zero secondi nel tempo di esecuzione totale per un test cinetico di 30 minuti e immettere zero ore cinque minuti e zero secondi per l'intervallo.
Verificare le impostazioni specificate nelle informazioni sulle impostazioni e fare clic su OK. Quindi fare clic su lettura per avviare l'esecuzione cinetica. Per impostare i parametri di imaging all'interno della modalità di impostazioni, impostare MiniMax per la configurazione ottica, l'imaging per la modalità di lettura e l'endpoint per il tipo di lettura. Sotto le lunghezze d'onda, selezionare la luce trasmessa e le apposito box di fluorescenza corrispondenti alle lunghezze d'onda sperimentali di eccitazione ed emissione.
Impostare il tipo di piastra e l'area di lettura come appena dimostrato e sotto l'impostazione dell'area del pozzo, impostare il numero di siti all'interno di un pozzo da imaged. Sotto le impostazioni di acquisizione dell'immagine per GFP, imposta il dispositivo in modo che immagini l'intero pozzo con un tempo di esposizione di 20 millisecondi per immagine. Per la luce trasmessa, acquisire una singola immagine del centro di ogni pozzo con un tempo di esposizione di otto millisecondi.
Per lo ioduro di propidio, acquisire una singola immagine al centro di ogni pozzo con un tempo di esposizione di 20 millisecondi. Quindi confermare le impostazioni nelle informazioni sulle impostazioni e fare clic su OK e leggere per avviare l'imaging. Per impostare un saggio a base di fluorescenza ad alta produttività per le condizioni permissive di riparazione, lavare le celle due volte con 200 microlitri di 37 gradi Celsius M1 medio per pozzo e aggiungere 100 microlitri di mezzo M1 fresco di 37 gradi Celsius integrato con 30 ioduro di propidio micromolare dopo aver scartato il secondo lavaggio.
Per riparare condizioni restrittive, lavare le celle una volta con 200 microlitri di 37 gradi Celsius M2 medium integrati con cinque millimolare EGTA per pozzo seguito da un lavaggio con 200 microlitri di mezzo M2 da solo. Dopo aver scartato il secondo lavaggio, aggiungere 100 microlitri di mezzo M2 fresco di 37 gradi Celsius integrato con 30 ioduro di propidio micromolare per pozzo. Quindi immagini la piastra sotto la luce trasmessa, GFP e PI come appena dimostrato.
Durante l'immagine della piastra, posizionare una micropiastra di polipropilene inferiore ben rotonda sul ghiaccio e configurare la piastra come appena dimostrato per la piastra precedente. Per la riparazione di condizioni permissive, aggiungere 100 microlitri di mezzo M1 ghiacciato integrato con 60 ioduro di propididio micromolare per pozzo seguito dall'aggiunta di 100 microlitri di M1 ghiacciato con o senza listeriolisina O 4X per pozzo. Per la riparazione di condizioni restrittive, aggiungere 100 microlitri di mezzo M2 ghiacciato integrato con 60 ioduro di propidio micromolare per pozzo seguito dall'aggiunta di 100 microlitri di M2 ghiacciato con o senza listeriolisina 4X O per pozzo.
È imperativo preparare la listeriolisina O all'appropriata concentrazione sperimentale sul ghiaccio circa cinque minuti prima dell'inizio del saggio cinetico quando la prima piastra è su ghiaccio e la piastra due è in fase di preparazione. Al termine dell'imaging della prima piastra, trasferire immediatamente la piastra su un foglio di foglio di alluminio sul ghiaccio. Dopo cinque minuti, trasferire 100 microlitri da ogni pozzo della seconda piastra all'apposito pozzo corrispondente nella prima piastra raffreddata, inserendo le punte delle pipette sotto il menisco della soluzione in ogni pozzo prima di espellere il volume senza mescolare per una corretta distribuzione della tossina.
Lasciare che la tossina si leghi alle cellule ospiti per un minuto e trasferire immediatamente la prima piastra al lettore di piastre per il saggio post-cinetico utilizzando la modalità spettrofluorometro. Al termine del saggio cinetico, acquisire immediatamente un'immagine post-cinetica dell'immagine della lastra come dimostrato per l'imaging precinetico. Per determinare il conteggio delle celle in base alla fluorescenza nucleare, nel software di enumerazione delle celle micropiatte in impostazioni, selezionare la ri-analisi e, nelle impostazioni di analisi delle immagini, selezionare l'analisi discreta degli oggetti utilizzando 541 come lunghezza d'onda per trovare oggetti.
All'interno dell'opzione Trova oggetti, usa il metodo di ricerca del disegno sulle immagini, seleziona i nuclei e fai clic su Applica, quindi fai clic su OK e leggi per avviare l'algoritmo di conteggio delle celle. L'espressione della GFP non interferisce con le misurazioni dell'intensità dello ioduro propidio in presenza o assenza di trattamento con listeriolisina O. L'espressione dello ioduro di propidio può sanguinare attraverso la fluorescenza GFP come evidenziato da un aumento dell'intensità di fluorescenza GFP nelle cellule HeLA H2B-GFP nel saggio di imaging post-cinetico rispetto all'analisi precinetica.
È importante notare tuttavia che questo crossover non influisce sul conteggio delle cellule, poiché il processo di segmentazione coinvolto nell'enumerazione dei nuclei non è influenzato da un aumento della fluorescenza GFP. In assenza di listeriolisina O, l'integrità della membrana plasmatica rimane costante in presenza o assenza di calcio extracellulare, mentre il trattamento con listeriolisina O in presenza di mezzo integrato con calcio si traduce in un costante aumento dell'intensità di fluorescenza dello ioduro propidio. In assenza di calcio extracellulare, tuttavia, c'è un aumento significativamente più forte della fluorescenza dello ioduro propidio, che riflette l'assenza di resealizzazione della membrana.
In alternativa, un colorante legante acido nucleico carbocianina con fluorescenza in rosso lontano può essere sostituito con lo ioduro di propidio per ridurre al minimo la sovrapposizione spettrale con la GFP. Inoltre, il più grande coefficiente di eccitazione per il colorante rosso lontano presenta un rapporto segnale/rumore più elevato e una migliore risoluzione tra la riparazione permissiva e la riparazione di condizioni restrittive. Durante il tentativo di questa procedura, si consiglia di etichettare tutti i tubi un giorno prima dell'esperimento, in quanto ciò ti preparerà per tutta la preparazione del reagente il giorno dell'esperimento.
Seguendo questa procedura, altri metodi come la citometria dell'immagine possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive, come ad esempio una tossina che forma pori danneggia tutte le cellule in modo uniforme o sono alcune cellule più suscettibili di altre. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nei campi delle malattie infettive e della riparazione della membrana plasmatica per esplorare gli effetti delle dimensioni dei pori sull'efficienza di riparazione di diversi tipi di cellule.
