SD was supported by a Sir Henry Wellcome Fellowship [092201/Z/10/Z]. This work was funded by Wellcome Trust grants [WT066839MA][104627/Z/14/Z][108445/Z/15/Z] to Professor Keith Gull. We would like to thank Professor Keith Gull for helpful conversations and insights.

1. 96 pozzetti lungo Primer PCR <ol><li> Pre-freeze 96 pozzetti PCR più fresco in congelatore -80 ° C. </li><li> In un tubo da 10 ml, preparare Master Mix A: 2.100 ml DDH 2 O, 105 ml PCR grado DMSO, 105 ml 10 mM dNTP, 105 ml modello pPOT (25 ng / ml) 9, per un volume totale di 2.415 ml per piastra . </li><li> Aliquota 23 ml in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti PCR. </li><li> Aggiungere 2 ml di 100 micron pool primer per ogni caricato bene con un P20 12 canali pipetta multicanale. Sigillare con la pellicola, piastra posto sul radiatore PCR pre-raffreddata e permettere di congelare per un minimo di 20 minuti a -80 ° C. </li><li> In un tubo da 10 ml, preparare Master Mix B: 2.048 ml DDH 2 O, 525 microlitri di buffer 10x, 52,5 ml polimerasi per un volume totale di 2.626 ml per piastra. </li><li> Rimuovere la piastra e PCR più fresco dal -80 ° C freezer. </li><li> Con la piastra ancora sul radiatore PCR, aggiungere 25 microlitri Master Mix B in cima alla congelaton Master Mix A per un volume di reazione totale di 50 microlitri. Questo è il tempo critico, e dovrebbe essere completato prima di Mix A può scongelare. Guarnizione della piastra con la pellicola. </li><li> Impostare termociclatore come segue: 94 ° C per 10 min, quindi 30 cicli di 94 ° C per 15 sec, 65 ° C per 30 sec, 72 ° C per 2 min seguita da un periodo di estensione finale di 72 ° C per 7 min . </li><li> Caricare la piastra PCR dopo il blocco ha raggiunto 94 ° C. </li></ol> 2. Convalida dei 96 pozzetti lungo Primer PCR <ol><li> Cast un&#39;ampia 1% (w / v) di gel di agarosio in Tris acetato EDTA (TAE) tampone di corsa con 4 x 28 pozzetti pettini per dare un gel con 4 file di pozzi. Allineare i denti supplenti del pettine con le punte di una pipetta multicanale a 12 canali. immergere con attenzione il gel in TAE tampone di corsa dopo le corsie vengono caricati. </li><li> Carico 1 kb scala DNA nel 1 ° e il 28 ° e di ogni riga. </li><li> Utilizzando un P20 12 canali multicanale pipetta, trasferire 2 ml di PCR dir prodottoectly per ogni corsia di gel (Figura 1A). Fare questo rapidamente per ridurre la possibilità di contaminare gli ampliconi. <ol><li> Caricare i prodotti di PCR di riga A della piastra PCR nelle corsie numerate dispari della prima fila del gel (A1 - corsia 3, A2 - corsia 5 ...... A11 - corsia 23, A12 - corsia 25) e caricare i prodotti di PCR da riga B della piastra PCR nei vicoli numerazione pari del 1 ° fila del gel (B1 - corsia 4, A2 - corsia 6 ...... B11 - corsia 24, B12 - corsia 26). </li><li> Caricare i prodotti di PCR di fila C e D della piastra PCR utilizzando lo stesso modello come descritto sopra, con fila C in corsie numerate e le fila D dispari nelle corsie pari. Continuare questo modello loading finché ogni pozzetto della piastra PCR viene caricato sul gel. buffer di DNA di caricamento non è tenuto a caricare questo gel. </li></ol></li><li> Posizionare il gel nel serbatoio esecuzione e riempire il serbatoio con TAE tampone di corsa fino a quando il gel viene sommerso. Eseguire a 100 V per 30 minutivisualizzare utilizzando un transilluminatore UV. Vedi Figura 1B per un gel esempio. Nota: PCR prodotti possono essere conservati a -20 ° C per diverse settimane prima trasfezione </li></ol> 3. Trasfezione 96 pozzetti <ol><li> Utilizzare il T. brucei prociclico linea di cellule forma SMOXP9 10 per questa procedura e crescere in SDM-79 supporti contenenti il 10% di FCS 10. </li><li> Utilizzare 1 x 10 7 cellule per trasfezione (totale di 1,1 x 10 9 cellule) quando codifica sul terminale N della proteina e 2 x 10 7 cellule per trasfezione (totale di 2,2 x 10 9 cellule) quando codifica sul terminale C di la proteina. Mantenere le cellule in mid-log (1,2 x 10 6 -1 x 10 7 cellule / ml) per diversi giorni prima della trasfezione e raccogliere le cellule per trasfezione ad una densità di 5-8 x 10 6 cellule / ml. </li><li> Lasciare prodotti di PCR congelati per trasfezione per scongelare a temperatura ambiente. </li><li> Contare le cellule utilizzando un emeocytometer o contatore di cellule automatica. </li><li> Pellet numero di celle in più provette da 50 ml a 800 xg per 10 min. </li><li> Dopo la centrifugazione Gettare il surnatante e risospendere le cellule in 10 ml cytomix modificato (0,8 mm EGTA, 24 mm KCl, 0,15 mm CaCl 2, 10 mM fosfato di potassio tampone pH7.6, 25 mM HEPES-KOH pH7.6, 2,6 mm MgCl 2, 0.5% (w / v) di glucosio, 100 ug / ml BSA, 1 mM ipoxantina, 144 mM saccarosio) per provetta. Trasferire tutte le soluzioni cellulari ad un singolo tubo e far girare nuovamente a 800 xg per 10 min. </li><li> Dopo centrifugazione, scartare il surnatante e risospendere le cellule in 23 ml di cytomix modificato per una concentrazione finale di 5 x 10 7 cellule / ml. </li><li> Mentre le cellule sono filatura, aggiungere 1 ml di SDM-79 media per ciascun pozzetto di piastre di coltura tissutale 4 x 24 pozzetti. Etichettare il piastre dC e disegnare un anello attorno pozzetto A1 su ogni piatto in pennarello indelebile per aiutare l&#39;orientamento piatto. </li><li> Collegare il gestore piastra al electroporator. Sulla electroporaUnità tor impostare la tensione a 1500 V, la lunghezza dell&#39;impulso di 100 microsec e il numero di impulsi a 12 e l&#39;intervallo di impulso per 500 msec. Sul conduttore piatto, impostare il conteggio degli impulsi a 1. Questo assicura che tale electroporator applicherà un singolo impulso a ciascuna delle colonne 12 della piastra elettroporazione. </li><li> Utilizzando un P200 a 12 canali multicanale pipetta, trasferire le reazioni di PCR dalla piastra PCR per le piastre di elettroporazione 96 pozzetti usa e getta, Gap 4 mm. </li><li> Quando le cellule sono state filate e sono risospesi alla concentrazione finale di 5 x 10 7 cellule / ml (Passo 3.7), trasferire ad un serbatoio di reagenti. Pipettare 200 ml di soluzione di cellule in ciascun pozzetto della piastra elettroporazione utilizzando un P200 a 12 canali pipetta multicanale, mescolare con il prodotto PCR pipettando. </li><li> Usando tessuto rimuovere eventuali goccioline dalla parte superiore della piastra per evitare cortocircuiti. </li><li> Applicare la pellicola sigillante fornito nella confezione piastra alla sommità della piastra elettroporazione, positioning in modo da lasciare i fori per gli elettrodi scoperti nella parte superiore e inferiore di ogni colonna. Evitare di coprire i punti sollevati utilizzati per guidare il film. </li><li> Caricare la piastra di elettroporazione nel gestore piastra e chiudere il coperchio. Premere &#39;Pulse&#39; sull&#39;unità electroporator. </li><li> Dopo l&#39;elettroporazione, trasferire rapidamente le cellule dalla piastra elettroporazione 96 pozzetti alle piastre di coltura tissutale 4 x 24 pozzetti. Per trasferire le cellule, usare un P200 a 12 canali multicanale pipetta con ogni altro punta mancante in modo tale che i restanti 6 punte allineano con i 6 file su un 24-pozzetti di coltura tissutale. Trasferire le cellule elettroporate nei electroporations piastre a 96 pozzetti nel modello predefinito per le piastre di coltura tissutale 24 pozzetti (Figura 2A). </li><li> Preparare le punte per pipette P200 - per ogni 96 pozzetti trasfezione preparare 2 scatole di 96 punte con ogni altra colonna rimosso. <ol><li> pozzi di trasferimento A1 / A3 / A5 / A7 / A9 / A11 sulla piastra elettroporazione 96 pozzetti apiatto Una riga A delle piastre di coltura di tessuto da 24 pozzetti, B1 / B3 / B5 / B7 / B9 / B11 in riga B, C1 / C3 / C5 / C7 / C9 / C11 in riga C e D1 / D3 / D5 / D7 / D9 / D11 in fila D. Dopo il trasferimento di ogni serie di 6 pozzi dalla piastra a 96 pozzetti per la 24-pozzetti, i pozzi della piastra a 96 pozzetti vengono poi lavate con supporti da rispettivi pozzetti in 24- pozzetti e il lavaggio viene poi trasferito di nuovo ai pozzetti nella piastra 24 pozzetti. </li><li> Trasferimento pozzi E1 / E3 / E5 / E7 / E9 / E11 sul piatto elettroporazione 96 pozzetti a 24 pozzetti B riga A, F1 / F3 / F5 / F7 / F9 / F11 in riga B, G1 / G3 / G5 / G7 / G9 / G11 in riga C e H1 / H3 / H5 / H7 / H9 / H11 in fila D. Dopo il trasferimento di ogni serie di 6 pozzi dalla piastra a 96 pozzetti per la 24-pozzetti, i pozzi in 96 piastra -well vengono poi lavati con supporti da rispettivi pozzetti nella piastra 24 pozzetti ed il lavaggio viene poi trasferito nuovamente ai pozzetti nella piastra 24 pozzetti. </li><li> pozzi di trasferimento A2 / A4 / A6 / A8 / A10 / A12 sulla piastra elettroporazione 96 pozzetti a 24 pozzetti C riga A, B2 / B4 / B6 / B8 / B10 / B12 in riga B, C2 / C4 / C6 / C8 / C10 / C12 in riga C e D2 / D4 / D6 / D8 / D10 / D12 in fila D. Dopo il trasferimento di ogni serie di 6 pozzi dal 96 piastra -well alla piastra 24 pozzetti, i pozzi della piastra a 96 pozzetti vengono poi lavati con supporti da rispettivi pozzetti nella piastra 24 pozzetti ed il lavaggio viene poi trasferito nuovamente ai pozzetti nella piastra 24 pozzetti. </li><li> pozzi di trasferimento E2 / E4 / E6 / E8 / E10 / E12 sul piatto elettroporazione 96 pozzetti a 24 pozzetti D riga A, F2 / F4 / F6 / F8 / F10 / F12 in riga B, G2 / G4 / G6 / G8 / G10 / G12 in riga C e H2 / H4 / H6 / H8 / H10 / H12 in fila D. Dopo il trasferimento di ogni serie di 6 pozzi dalla piastra a 96 pozzetti per la 24-pozzetti, i pozzi del 96 piastra -well vengono poi lavati con supporti da rispettivi pozzetti nella piastra 24 pozzetti ed il lavaggio viene poi trasferito nuovamente ai pozzetti nella piastra 24 pozzetti. </li></ol></li><li> Utilizzando un microscopio a contrasto di fase invertito, esaminare 1 e da ogni colonna per controllare le cellule. Ci sarà una miscela di cellule vive e morte connotevole quantità di detriti cellulari. cellule vive possono essere distinte dalle cellule morte perché saranno luminoso al microscopio a contrasto di fase e saranno in movimento. </li><li> Posizionare le piastre da 24 pozzetti in una scatola pulita, di plastica con un coperchio che forma una tenuta ermetica. Mettete la scatola in un incubatore a 28 °. </li><li> Tra 6-8 ore più tardi, aggiungere 1 ml di SDM-79 con 10% FCS contenente antibiotico selettivo 2x a ciascun pozzetto. Nella nostra esperienza, le linee cellulari in cui i geni sono targhetta su terminale N sono resistenti alle alte concentrazioni di farmaco selettivo. Pertanto, utilizzando blasticidin come esempio, codifica sul terminale N richiede una concentrazione finale di 20 ug / ml blasticidin e codifica il terminale C richiede una concentrazione finale di 10 ug / ml blasticidin. Nota: linee cellulari transgeniche saranno visibili 9-10 giorni dopo la trasfezione. </li><li> Passaggio almeno due volte nel farmaco fresco e supporti prima dell&#39;analisi. La Figura 2B mostra i risultati di un tipico Transfe 96 pozzettiction per la codifica di 96 diverse proteine ​​sul terminale N. Valutare ogni bene al microscopio a contrasto di fase per determinare se contiene cellule sane, resistenti ai farmaci. A ben sano contiene prevalentemente (&lt;95%), le cellule altamente attivi che sono luminose nel campo della microscopia contratto di fase. L&#39;analisi successiva mediante microscopia in epifluorescenza o Western Blot è necessaria per determinare se la proteina è stato etichettato con successo. </li></ol>

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	<li>Kelly, S., Reed, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+in+Trypanosoma+brucei:+a+collection+of+vectors+for+the+expression+of+tagged+proteins+from+endogenous+and+ectopic+gene+loci.">Functional genomics in Trypanosoma brucei: a collection of vectors for the expression of tagged proteins from endogenous and ectopic gene loci.</a> Mol Biochem Parasitol. 154 (1), 103-109 (2007).</li><li>Wirtz, L. E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. 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M., MacGregor, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+dissection+of+the+quorum+sensing+signalling+pathway+in+Trypanosoma+brucei.">Genome-wide dissection of the quorum sensing signalling pathway in Trypanosoma brucei.</a> Nature. 505 (7485), 681-685 (2014).</li><li>Rigaut, G., Shevchenko, A., Rutz, B., Wilm, M., Mann, M., S&#233;raphin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration+:+Abstract+Nature+Biotechnology.">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration : Abstract Nature Biotechnology.</a> Nature Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).</li><li>Los, G. V., Encell, L. 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M., Roditi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+stable+transformation+of+bloodstream+forms+of+Trypanosoma+brucei.">Highly efficient stable transformation of bloodstream forms of Trypanosoma brucei.</a> Mol Biochem Parasitol. 153 (2), 220-223 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

notevoli miglioramenti nella sensibilità di proteomica e trascrittomica metodi negli ultimi 5-10 anni ha fornito dati preziosi su migliaia di geni e dei loro prodotti. Tuttavia, gli strumenti per affrontare la funzione di queste proteine ​​non hanno tenuto il passo. Tagging una proteina facilita numerosi esperimenti per determinare la sua funzione. Ad esempio, una proteina può essere fuso ad una proteina fluorescente in una varietà di colori diversi per facilitare gli studi di localizzazione e co-localizzazione. Tag sviluppato per la microscopia elettronica, come ad esempio APEX2 o miniSOG 11,12, consentire la localizzazione ultrastrutturale della proteina codificata. Parole chiave per la biochimica, come ad esempio il tag TAP, e ProtC-TEV-Prota (PTP) Indicatore 7,13 permettere la purificazione di complessi associati con la proteina per l&#39;identificazione di partner di legame o in saggi biochimici in vitro. I passi specifici che sono cruciali per il successo del ProtoColo sono: l&#39;incorporazione di DMSO nella PCR Master Mix 1, congelamento della PCR Master Mix 1 prima dell&#39;aggiunta del Master Mix 2, l&#39;uso della polimerasi commerciale in Master Mix 2 e la modifica del buffer cytomix elettroporazione. Nella nostra esperienza, è necessario utilizzare il doppio del numero di celle per C trasfezioni terminale di codifica da per N trasfezioni terminale di codifica per ottenere una percentuale simile di pozzetti positivi. Pertanto, tutti i passaggi devono essere eseguiti come descritto. Questa tecnica è solo probabile che sia successo quando transfecting l&#39;insetto prociclico modulo trypanosome. Forme sangue hanno una bassa efficienza di trasfezione 14, inoltre sono probabilità di morire durante la selezione a causa della tossicità densità-dipendente che non è correlato al farmaco selettivo. Pertanto, il nostro precedente protocollo rappresenta la migliore tecnologia attuale per la codifica di tripanosomi forma sangue 9. E &#39;anche probabile che il transefficienza perfezione varia dipende dalla specifica isolato trypanosome. Questo protocollo è stato ottimizzato utilizzando 927 SMOX forme prociclico - altri ceppi possono richiedere ulteriore ottimizzazione. Le misure che possono aumentare la probabilità di successo includono: aumentando la quantità di PCR amplicone, aumentando il numero di cellule inclusi nella trasfezione. Vi presentiamo un metodo in cui centinaia di proteine ​​possono essere contrassegnati in parallelo. Ciò faciliterà studi su larga scala sulla localizzazione e l&#39;interazione, integrando grandi set di dati esistenti e di fornire informazioni preziose per la comunità. modelli Primer sono disponibili su richiesta e un elenco di plasmidi modelli sono disponibili presso: http://www.sdeanresearch.com/

Trypanosoma brucei è un protozoo parassita che causa trypanosomasis africana umana e nagana nei bovini. T. brucei è un organismo ideale per l&#39;analisi della funzione proteica grazie alla combinazione di un genoma di alta qualità, numerose proteomica e trascrittomica set di dati e strumenti molecolari ben sviluppati 1-3. I progressi nella proteomica e il sequenziamento hanno portato a grandi serie di dati che evidenziano potenzialmente geni interessanti 4-6; Tuttavia, molti geni hanno informazioni minime ad essi associati nei database esistenti. Vi è quindi la necessità di un metodo di alta produttività per aiutare caratterizzazione funzionale della proteina. Espressione di una proteina marcata può dare una molteplicità di intuizioni in funzione di una proteina. Ad esempio, una proteina marcata con una proteina fluorescente o epitopo può essere localizzato mediante microscopia a fluorescenza, che fornisce informazioni su dove protein potrebbe essere esercitando il suo effetto biologico. In alternativa, una proteina contrassegnati con un TAP 7, 8 o HaloTag sua etichetta può essere purificato per saggi biochimici e l&#39;identificazione dei suoi partner di interazione. Recentemente abbiamo sviluppato una metodologia di codifica robusta per T. brucei 9. Questo era lungo Primer PCR per generare il DNA per trasfezione e ha permesso la marcatura di decine di proteine ​​in parallelo - un miglioramento importante di protocolli esistenti. Ora abbiamo migliorato la scalabilità di questo protocollo in forme prociclico da un ordine di grandezza. Qui, vi presentiamo il nostro metodo in cui eseguiamo la PCR e trasfezione in piastre a 96 pozzetti, con il recupero e la selezione che si verificano in piastre da 24 pozzetti. Come centinaia di proteine ​​possono essere contrassegnati in parallelo questo metodo fornisce un metodo conveniente e fattibile per la codifica l&#39;intero genoma trypanosome.

<table><tbody><tr><td>Oligonucleotide</td><td>Life technologies</td><td>na</td><td>desalt only (do not use additional purification)</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Roche</td><td>Included with the Expand HiFi pack</td><td>Must be PCR grade</td></tr><tr><td>dNTP</td><td>any reputable</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Expand HiFi polymerase</td><td>Roche</td><td>11759078001</td><td></td></tr><tr><td>BTX ECM830</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td>Electroporator</td></tr><tr><td>HT-200 plate handler</td><td>Harvard Apparatus</td><td>HT-200</td><td>Handles the 96-well eletroplates</td></tr><tr><td>MOS 96 ELECTROPLATE 4 mm</td><td>Harvard Apparatus</td><td>45-0452</td><td>Electroplate for the 96-well electroporation</td></tr><tr><td>Blasticidin S Hydrochloride</td><td>Melford</td><td>3513-03-9</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin b Gold</td><td>Invivogen</td><td>ant-hg-1</td><td></td></tr><tr><td>Phleomycin</td><td>Melford</td><td>P0187</td><td></td></tr><tr><td>225 cm TC Flask, canted neck, phenolic cap</td><td>Appletonwoods</td><td>BC006</td><td></td></tr><tr><td>24 well culture plates</td><td>Appletonwoods</td><td>BC017</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf&amp;reg; PCR Cooler, iceless cold storage system for 96 well plates and PCR tubes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z606634-1EA</td><td></td></tr><tr><td>96-well Multiply&amp;reg; PCR plate with lateral skirt</td><td>Sarstedt</td><td>72.1979.203</td><td></td></tr></tbody></table>

high-throughput gene tagging in trypanosoma brucei

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.

In questo trasfezione rappresentante, i primer sono stati progettati utilizzando lo script perl Tagit 9 e sintetizzati in commercio. Il 96 pozzetti PCR è stato eseguito e convalidato come descritto (Figura 1A); in questo esempio, 95/96 PCR hanno avuto successo (Figura 1B). Nella nostra esperienza, ripetendo le reazioni fallite sia con i primer originali o primer ri-sintetizzato non si traduca in una PCR di successo. Gli ampliconi sono state trasferite in piastre da 96 pozzetti elettroporazione per elettroporazione (Figura 2A) e poi trasferiti piastre di coltura da 24 pozzetti per il recupero e la selezione. Dopo un tempo sufficiente a permettere la selezione avvenga, i pozzetti sono stati ottenuti per la sopravvivenza prima ulteriori analisi. In questo esempio, 88/96 pozzi (92%) sono risultati positivi dopo la selezione di 15 giorni. <img alt = &quot;Figura 1&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 54342 / 54342fig1.jpg&quot; /&gt; Figura 1: convalida di lunga Primer PCR (A) del modello per il trasferimento di prodotti di PCR da 96 pozzetti PCR per il gel per la validazione della PCR.. (B) A 96 pozzetti PCR gel rappresentante convalida per la codifica 95 geni sul terminale N e 1 amplicon non contenente 5 &#39;omologia di targeting per fungere da controllo negativo nella trasfezione. I campioni vengono caricati su un 1% (w / v) gel e risolti a 100 V per 30 min. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54342/54342fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54342/54342fig2.jpg" /> Figura 2: 96 pozzetti elettroporazione e la selezione (A) del modello per il trasferimento di cellule elettroporate da 96 pozzetti elettroporazione plat.e per 24 pozzetti piastre di coltura dei tessuti. (B) Un schematicamente una tipica competenza live / morti dopo 15 giorni di selezione in piastre da 24 pozzetti. Verde rappresenta un trasfezione successo, grigio rappresenta un pozzo con solo cellule morte. In questo esempio, 88/96 (92%) dei pozzi conteneva parassiti transfettate con successo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54342/54342fig2large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

High-throughput di Gene Tagging in<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

7.9K Views.  University of Oxford. Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

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Examination of the Telomere G-overhang Structure in Trypanosoma brucei

The telomere G-overhang structure has been identified in many eukaryotes including yeast, vertebrates, and Trypanosoma brucei. It serves as the substrate for telomerase for de novo telomere DNA synthesis and is therefore important for telomere maintenance. T. brucei is a protozoan parasite that causes sleeping sickness in humans and nagana in cattle. Once infected mammalian host, T. brucei cell regularly switches its surface antigen to evade the host's immune attack. We have recently demonstrated that the T. brucei telomere structure plays an essential role in regulation of surface antigen gene expression, which is critical for T. brucei pathogenesis. However, T. brucei telomere structure has not been extensively studied due to the limitation of methods for analysis of this specialized structure. We have now successfully adopted the native in-gel hybridization and ligation-mediated primer extension methods for examination of the telomere G-overhang structure and an adaptor ligation method for determination of the telomere terminal nucleotide in T. brucei cells. Here, we will describe the protocols in detail and compare their different advantages and limitations.

Examination of the Telomere G-overhang Structure in Trypanosoma brucei

Telomeres are essential for chromosome stability and the telomere G-overhang structure is essential for telomerase-mediated telomere maintenance. We have recently adopted two methods for detecting the telomere G-overhang structure in Trypanosoma brucei, which are native in-gel hybridization and ligation-mediated primer extension, which will be described.

L&#39;esame dei telomeri G-Struttura in aggetto Trypanosoma brucei</em

The telomere G-overhang structure has been identified in many eukaryotes including yeast, vertebrates, and Trypanosoma brucei. It serves as the substrate ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target against T. cruzi, it is important to validate the essentiality of the target gene in the mammalian stage of the parasite, the amastigote. Amastigotes of T. cruzi replicate inside the host cell; thus, it is difficult to conduct a knockout experiment without going through other developmental stages. Recently, our group reported a growth condition in which the amastigote can replicate axenically for up to 10 days without losing its amastigote-like properties. By using this temporal axenic amastigote culture, we successfully introduced gRNAs directly into the Cas9-expressing amastigote to cause gene knockouts and analyzed their phenotypes exclusively in the amastigote stage. In this report, we describe a detailed protocol to produce in vitro derived extracellular amastigotes, and to utilize the axenic culture in a CRISPR/Cas9-mediated knockout experiment. The growth phenotype of knockout amastigotes can be evaluated either by cell counts of the axenic culture, or by replication of intracellular amastigote after host cell invasion. This method bypasses the parasite stage differentiation normally involved in producing a transgenic or a knockout amastigote. Utilization of the temporal axenic amastigote culture has the potential to expand the experimental freedom of stage-specific studies in T. cruzi.

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Here, we describe a protocol to introduce a gene knockout into the extracellular amastigote of Trypanosoma cruzi, using the CRISPR/Cas9 system. The growth phenotype can be followed up either by cell counting of axenic amastigote culture or by proliferation of intracellular amastigotes after host cell invasion.

Presentazione di un Gene Knockout direttamente nello stadio Amastigote di Trypanosoma cruzi Utilizzando il sistema CRISPR/Cas9

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...

Genetica

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene function and phenotype(s). The development of mutant strains with targeted gene deletions, targeted mutations, complemented gene function, and/or tagged genes provides powerful strategies to address gene function, particularly if these genetic manipulations can be efficiently targeted to the gene locus of interest using integration mediated by double cross over homologous recombination.
Due to very high rates of nonhomologous recombination, functional genomic analysis of Toxoplasma gondii has been previously limited by the absence of efficient methods for targeting gene deletions and gene replacements to specific genetic loci. Recently, we abolished the major pathway of nonhomologous recombination in type I and type II strains of T. gondii by deleting the gene encoding the KU80 protein1,2. The &Delta;ku80 strains behave normally during tachyzoite (acute) and bradyzoite (chronic) stages in vitro and in vivo and exhibit essentially a 100% frequency of homologous recombination. The &Delta;ku80 strains make functional genomic studies feasible on the single gene as well as on the genome scale1-4.
Here, we report methods for using type I and type II &Delta;ku80&Delta;hxgprt strains to advance gene targeting approaches in T. gondii. We outline efficient methods for generating gene deletions, gene replacements, and tagged genes by targeted insertion or deletion of the hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HXGPRT) selectable marker. The described gene targeting protocol can be used in a variety of ways in &Delta;ku80 strains to advance functional analysis of the parasite genome and to develop single strains that carry multiple targeted genetic manipulations. The application of this genetic method and subsequent phenotypic assays will reveal fundamental and unique aspects of the biology of T. gondii and related significant human pathogens that cause malaria (Plasmodium sp.) and cryptosporidiosis (Cryptosporidium).

Here we report a method for using type I and type II &Delta;ku80 strains of Toxoplasma gondii to efficiently generate targeted gene deletions and gene replacements for functional genomic analysis.

La manipolazione genetica in<em&gt; Δku80</em&gt; Ceppi per analisi genomica funzionale di<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in cattle1. The parasite alternates between the bloodstream of the mammalian host and the tsetse fly vector. The composition of many cellular organelles changes in response to these different extracellular conditions2-5.
Glycosomes are highly specialized peroxisomes in which many of the enzymes involved in glycolysis are compartmentalized. Glycosome composition changes in a developmental and environmentally regulated manner4-11. Currently, the most common techniques used to study glycosome dynamics are electron and fluorescence microscopy; techniques that are expensive, time and labor intensive, and not easily adapted to high throughput analyses.
To overcome these limitations, a fluorescent-glycosome reporter system in which enhanced yellow fluorescent protein (eYFP) is fused to a peroxisome targeting sequence (PTS2), which directs the fusion protein to glycosomes12, has been established. Upon import of the PTS2eYFP fusion protein, glycosomes become fluorescent. Organelle degradation and recycling results in the loss of fluorescence that can be measured by flow cytometry. Large numbers of cells (5,000 cells/sec) can be analyzed in real-time without extensive sample preparation such as fixation and mounting. This method offers a rapid way of detecting changes in organelle composition in response to fluctuating environmental conditions.

Glycosome dynamics in African trypanosomes are difficult to study by traditional cell biology techniques such as electron and fluorescence microscopy. As a means of observing dynamic organelle behavior, a fluorescent-organelle reporter system has been used in conjunction with flow cytometry to monitor real-time glycosome dynamics in live parasites.

Utilizzo di proteine ​​fluorescenti per monitorare Glycosome Dynamics in Tripanosoma africano

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in ...

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing &#946;-galactosidase

Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas disease (ChD), an endemic disease of public health importance in Latin America that also affects many non-endemic countries due to the increase in migration. This disease affects nearly 8 million people, with new cases estimated at 50,000 per year. In the 1960s and 70s, two drugs for ChD treatment were introduced: nifurtimox and benznidazole (BZN). Both are effective in newborns and during the acute phase of the disease but not in the chronic phase, and their use is associated with important side effects. These facts underscore the urgent need to intensify the search for new drugs against T. cruzi.
T. cruzi is transmitted through hematophagous insect vectors of the Reduviidae and Hemiptera families. Once in the mammalian host, it multiplies intracellularly as the non-flagellated amastigote form and differentiates into the trypomastigote, the bloodstream non-replicative infective form. Inside the insect vector, trypomastigotes transform into the epimastigote stage and multiply through binary fission.
This paper describes an assay based on measuring the activity of the cytoplasmic &#946;-galactosidase released into the culture due to parasites lysis by using the substrate, chlorophenol red &#946;-D-galactopyranoside (CPRG). For this, the T. cruzi Dm28c strain was transfected with a &#946;-galactosidase-overexpressing plasmid and used for in vitro pharmacological screening in epimastigote, trypomastigote, and amastigote stages. This paper also describes how to measure the enzymatic activity in cultured epimastigotes, infected Vero cells with amastigotes, and trypomastigotes released from the cultured cells using the reference drug, benznidazole, as an example. This colorimetric assay is easily performed and can be scaled to a high-throughput format and applied to other T. cruzi strains.

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing &#946;-galactosidase

We describe a high-throughput colorimetric assay measuring &#946;-galactosidase activity in three life cycle stages of Trypanosoma cruzi, the causative agent of Chagas disease. This assay can be used to identify trypanocidal compounds in an easy, fast, and reproducible manner.

In vitro Screening farmacologico contro tutte le fasi del ciclo di vita di Trypanosoma cruzi utilizzando parassiti che esprimono β-galattosidasi

Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas disease (ChD), an endemic disease of public health importance in Latin America that also affects many ...

Biochimica

Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades the central nervous system (CNS). In vivo study of the late stage has been limited as traditional methodologies require the removal of the brain to determine the presence of the parasites.
Bioluminescence imaging is a non-invasive, highly sensitive form of optical imaging that enables the visualization of a luciferase-transfected pathogen in real-time. By using a transfected trypanosome strain that has the ability to produce late stage disease in mice we are able to study the kinetics of a CNS infection in a single animal throughout the course of infection, as well as observe the movement and dissemination of a systemic infection.
Here we describe a robust protocol to study CNS infections using a bioluminescence model of African trypanosomiasis, providing real time non-invasive observations which can be further analyzed with optional downstream approaches.

This manuscript describes the use of a bioluminescent strain of African trypanosomes to enable the tracking of late stage infection and demonstrates how in vivo live imaging can be used to visualize infections within the central nervous system in real-time.

Bioluminescenza Imaging per rilevare fase avanzata di infezione di africani Tripanosomiasi

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades ...

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) cycles between a tsetse vector and a mammalian host. It evades the mammalian host immune system by periodically switching the dense, variant surface glycoprotein (VSG) that covers its surface. The detection of antigenic variation in Trypanosoma brucei can be both cumbersome and labor intensive. Here, we present a method for quantifying the number of parasites that have 'switched' to express a new VSG in a given population. The parasites are first stained with an antibody against the starting VSG, and then stained with a secondary antibody attached to a magnetic bead. Parasites expressing the starting VSG are then separated from the rest of the population by running the parasites over a column attached to a magnet. Parasites expressing the dominant, starting VSG are retained on the column, while the flow-through contains parasites that express a new VSG as well as some contaminants expressing the starting VSG. This flow-through population is stained again with a fluorescently labeled antibody against the starting VSG to label contaminants, and propidium iodide (PI), which labels dead cells. A known number of absolute counting beads that are visible by flow cytometry are added to the flow-through population. The ratio of beads to number of cells collected can then be used to extrapolate the number of cells in the entire sample. Flow cytometry is used to quantify the population of switchers by counting the number of PI negative cells that do not stain positively for the starting, dominant VSG. The proportion of switchers in the population can then be calculated using the flow cytometry data.

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

African trypanosomes grown in vitro undergo antigenic variation at a low rate, such that populations are made up of parasites expressing a dominant variant surface glycoprotein (VSG) type and a small population of "switched" variants. This protocol describes a fast method for detecting and quantifying these populations.

rilevamento di<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; Switching Variante superficie glicoproteina da magnetico cellulare Attivato Ordinamento e citometria a flusso

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

Purification of Extracellular Trypanosomes, Including African, from Blood by Anion-Exchangers (Diethylaminoethyl-cellulose Columns)

This method allows the separation of trypanosomes, parasites responsible for animal and human African trypanosomiasis (HAT), from infected blood. This is the best method for diagnosis of first stage HAT and furthermore this parasite purification method permits serological and research investigations.
HAT is caused by Tsetse fly transmitted Trypanosoma brucei gambiense and T. b. rhodesiense. Related trypanosomes are the causative agents of animal trypanosomiasis. Trypanosome detection is essential for HAT diagnosis, treatment and follow-up. The technique described here is the most sensitive parasite detection technique, adapted to field conditions for the diagnosis of T. b. gambiense HAT and can be completed within one hour. Blood is layered onto an anion-exchanger column (DEAE cellulose) previously adjusted to pH 8, and elution buffer is added. Highly negatively charged blood cells are adsorbed onto the column whereas the less negatively charged trypanosomes pass through. Collected trypanosomes are pelleted by centrifugation and observed by microscopy. Moreover, parasites are prepared without cellular damage whilst maintaining their infectivity.
Purified trypanosomes are required for immunological testing; they are used in the trypanolysis assay, the gold standard in HAT serology. Stained parasites are utilized in the card agglutination test (CATT) for field serology. Antigens from purified trypanosomes, such as variant surface glycoprotein, exoantigens, are also used in various immunoassays. The procedure described here is designed for African trypanosomes; consequently, chromatography conditions have to be adapted to each trypanosome strain, and more generally, to the blood of each species of host mammal.
These fascinating pathogens are easily purified and available to use in biochemical, molecular and cell biology studies including co-culture with host cells to investigate host-parasite relationships at the level of membrane receptors, signaling, and gene expression; drug testing in vitro; investigation of gene deletion, mutation, or overexpression on metabolic processes, cytoskeletal biogenesis and parasite survival.

Purification of Extracellular Trypanosomes, Including African, from Blood by Anion-Exchangers Diethylaminoethyl-cellulose Columns

This method of trypanosome separation from blood depends on their surface charge being less negative than mammalian blood cells. Infected blood is placed and treated on an anion-exchanger column. This method, the most fitting diagnostic for African trypanosomiasis, provides purified parasites for immunological, biological, biochemical, pharmaceutical and molecular biology investigations.

Purificazione dei tripanosomi extracellulare, tra cui africana, dal sangue mediante scambiatori di anioni (colonne Diethylaminoethyl-cellulosa)

This method allows the separation of trypanosomes, parasites responsible for animal and human African trypanosomiasis (HAT), from infected blood. This is ...

Sviluppo di un sensore basato su pHluorin2 per il pH glicosomiale in Trypanosoma brucei

Measuring Dynamic Glycosomal pH Changes in Living Trypanosoma brucei

Glucose metabolism is critical for the African trypanosome, Trypanosoma brucei, as an essential metabolic process and regulator of parasite development. Little is known about the cellular responses generated when environmental glucose levels change. In both bloodstream and procyclic form (insect stage) parasites, glycosomes house most of glycolysis. These organelles are rapidly acidified in response to glucose deprivation, which likely results in the allosteric regulation of glycolytic enzymes such as hexokinase. In previous work, localizing the chemical probe used to make pH measurements was challenging, limiting its utility in other applications.
This paper describes the development and use of parasites that express glycosomally localized pHluorin2, a heritable protein pH biosensor. pHluorin2 is a ratiometric pHluorin variant that displays a pH (acid)-dependent decrease in excitation at 395 nm while simultaneously yielding an increase in excitation at 475 nm. Transgenic parasites were generated by cloning the pHluorin2 open reading frame into the trypanosome expression vector pLEW100v5, enabling inducible protein expression in either lifecycle stage. Immunofluorescence was used to confirm the glycosomal localization of the pHluorin2 biosensor, comparing the localization of the biosensor to the glycosomal resident protein aldolase. The sensor responsiveness was calibrated at differing pH levels by incubating cells in a series of buffers that ranged in pH from 4 to 8, an approach we have previously used to calibrate a fluorescein-based pH sensor. We then measured pHluorin2 fluorescence at 405 nm and 488 nm using flow cytometry to determine glycosomal pH. We validated the performance of the live transgenic pHluorin2-expressing parasites, monitoring pH over time in response to glucose deprivation, a known trigger of glycosomal acidification in PF parasites. This tool has a range of potential applications, including potentially being used in high-throughput drug screening. Beyond glycosomal pH, the sensor could be adapted to other organelles or used in other trypanosomatids to understand pH dynamics&#160;in the live cell setting.

Autore in primo piano: Progressi nel monitoraggio del pH glicosomiale in Trypanosoma brucei utilizzando il biosensore pHluorin2

We describe a method to study how pH responds to environmental cues in the glycosomes of the bloodstream form of African trypanosomes. This approach involves a pH-sensitive heritable protein sensor in combination with flow cytometry to measure pH dynamics, both as a time-course assay and in a high-throughput screen format.

Misurazione delle variazioni dinamiche del pH glisomiale nel Trypanosoma brucei vivente

Glucose metabolism is critical for the African trypanosome, Trypanosoma brucei, as an essential metabolic process and regulator of parasite development. ...

High-throughput di Gene Tagging in

Riepilogo

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Capitoli in questo video

L'esame dei telomeri G-Struttura in aggetto Trypanosoma brucei

Presentazione di un Gene Knockout direttamente nello stadio Amastigote di Trypanosoma cruzi Utilizzando il sistema CRISPR/Cas9

La manipolazione genetica in

Utilizzo di proteine fluorescenti per monitorare Glycosome Dynamics in Tripanosoma africano

In vitro Screening farmacologico contro tutte le fasi del ciclo di vita di Trypanosoma cruzi utilizzando parassiti che esprimono β-galattosidasi

Bioluminescenza Imaging per rilevare fase avanzata di infezione di africani Tripanosomiasi

rilevamento di

Purificazione dei tripanosomi extracellulare, tra cui africana, dal sangue mediante scambiatori di anioni (colonne Diethylaminoethyl-cellulosa)

Misurazione delle variazioni dinamiche del pH glisomiale nel Trypanosoma brucei vivente

Misurazione delle variazioni dinamiche del pH glisomiale nel Trypanosoma brucei vivente

High-throughput di Gene Tagging in

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Utilizzo di proteine ​​fluorescenti per monitorare Glycosome Dynamics in Tripanosoma africano

In vitro Screening farmacologico contro tutte le fasi del ciclo di vita di Trypanosoma cruzi utilizzando parassiti che esprimono β-galattosidasi

Bioluminescenza Imaging per rilevare fase avanzata di infezione di africani Tripanosomiasi

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Purificazione dei tripanosomi extracellulare, tra cui africana, dal sangue mediante scambiatori di anioni (colonne Diethylaminoethyl-cellulosa)

Misurazione delle variazioni dinamiche del pH glisomiale nel Trypanosoma brucei vivente

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Utilizzo di proteine fluorescenti per monitorare Glycosome Dynamics in Tripanosoma africano