Questo metodo consente di investigazione del tessuto umano vivente nella sua struttura e composizione 3D naturale per la traduzione dei principali risultati di laboratorio in potenziali terapie. Questa tecnica consente specificamente la generazione di colture tissutali da tessuto polmonare umano resected chirurgico o espiantato per la visualizzazione di singoli campioni di tessuto polmonare del paziente deceduto. Il tessuto polmonare privo di malattie può essere utilizzato come colture di tessuti 3D per modellare malattie polmonari ex vivo consentendo l'analisi dei pathomechanismi precoci in un'alta risoluzione spaziotemporale.
Iniziare posizionando il campione polmonare resettato in 15 millilitri di mezzo di coltivazione in un piatto sterile da coltura di 15 centimetri e vassoio metallico sterile coperto di carta velina e riempire una siringa da 30 millilitri con agarosio a basso punto di fusione di 42 gradi Celsius. Rimuovere l'otturatore da un catetere venoso periferico e attaccare il catetere alla siringa da 30 millilitri. Identificare un bronco da 0,5 a 3 millimetri di diametro nel tessuto di ventilazione in una sezione intatta del tessuto e inserire delicatamente la canula nel bronco per quanto possibile.
Utilizzare pinze per comprimere la parete bronchiola intorno alla canula, bloccando idealmente qualsiasi arteria polmonare adiacente allo stesso tempo, per sigillare il bronco intorno alla canula e utilizzare un morsetto chirurgico per occludere qualsiasi altra airways aggiuntiva, per prevenire perdite di agarosio. Successivamente, utilizzare le forcep per sollevare il tessuto polmonare dal piatto di coltura e utilizzare la siringa per consegnare manualmente l'agarosio attraverso la canula, non più velocemente di 0,3 millilitri al secondo. Quando il tessuto polmonare viene riempito completamente senza gonfiare e troppo il tessuto, rimuovere immediatamente la canula e bloccare il bronco.
Immergere il tessuto nel terreno di coltura a quattro gradi Celsius per 30 minuti per facilitare la solidificazione dell'agarosio e ripetere la procedura di riempimento dell'agarosio per eventuali aperture aggiuntive di bronchiole. Quindi, conservare le sezioni del tessuto polmonare riempite di agarosio in quattro gradi Celsius medio fino all'affezione. Per l'affezione polmonare tagliata con precisione, identificare le regioni solidamente riempite di agarosio all'interno del tessuto polmonare, che non collassano quando delicatamente premute con pinzette contro il fondo del piatto di coltura cellulare.
Asportare un blocco da 1 a 1,5 centimetri cubi di regione solidamente riempita con un lato ancora coperto di pleura e utilizzare la colla cianoacrilato per attaccare il lato plurale di ogni blocco di tessuto al supporto del vibratomo. Affettare l'intera strada attraverso il lungo blocco tissutale, fino a quando solo due o tre milometri di tessuto non vengono lasciati affettati. Utilizzo di forcep per trasferire ogni sezione di 500 micrometri in un pozzo di un mezzo di coltivazione contenente dodici pozzi, man mano che vengono ottenuti.
Quando tutto il tessuto è stato sezionato, trasferire i campioni da ogni pozzo in singoli piatti di coltura di dieci centimetri e posizionare un punzonatore di biopsia di quattro millimetri ortogonalmente sulla superficie superiore della fetta polmonare tagliata con precisione. Quindi, spostando il punzonatore in rotazioni in senso orario e antiorario, ottenere punzoni tissutali del campione polmonare. Posizionare ogni punzone in un mezzo di coltura cellulare fresco in singoli pozzi di una piastra di 96 po 'mentre si ottengono.
Quando tutti i punzoni tissutali sono stati ottenuti, posizionare la piastra nell'incubatrice di coltura cellulare per un massimo di cinque giorni. L'immunoetichettatura della fibronectina nei nuclei cellulari utilizzando l'immunofluorescenza nelle colture di tessuti polmonari 3D umani consente l'imaging della struttura alveolare preservata ex vivo. Il trattamento dei punzoni a fette polmonari tagliati con precisione umana con un cocktail di citochina profibrotica per 48 ore provoca cambiamenti simili alla fibrosi nelle colture di tessuto 3D polmonare umano, tra cui la significativa induzione dei componenti della matrice extracellulare rilevanti per la fibrosi, il collagene di tipo Uno e i geni della fibronectina.
Inoltre, i livelli proteici della vimentina marcatore mesenchimale sono regolati in tre pazienti su quattro dopo il trattamento dei punzoni di coltura del tessuto polmonare 3D. Seguendo questa procedura, altri metodi come l'analisi dell'RNA mediante PCR quantitativa in tempo reale, o l'analisi proteica mediante gonfiore occidentale, possono essere eseguiti per valutare l'espressione genica e proteica rispettivamente all'interno del tessuto. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada a ricerche nel campo della pneumologia sperimentale, all'espianto della biologia polmonare e all'esecuzione di studi tossicologici e farmacologici su campioni di tessuto umano.
Ricorda che il tessuto umano vivo è potenzialmente infettivo e che le misure precauzionali come l'uso di dispositivi di protezione individuale e un adeguato stoccaggio, trasporto e trattamento dei rifiuti dei tessuti dovrebbero sempre essere adottate durante l'esecuzione di questa procedura
