I protocolli per la coltura di organoidi epatici e intestinali canini sono importanti per standardizzare questa nuova tecnologia. Questa tecnica consente l'istituzione affidabile e riproducibile della coltura organoide canina, compreso l'isolamento organoide, la manutenzione, la raccolta e il successivo biobanking dei campioni. Gli organoidi canini possono fornire un modello eccellente per numerose applicazioni che vanno dalla biologia, allo sviluppo di malattie infettive, ai test e alla scoperta di farmaci e anche alla medicina di trasmissione.
Per iniziare, preparare cinque tubi centrifughi da 15 millilitri con cinque millilitri di soluzione chelante completa 1X, un tubo con tre millilitri di soluzione chelante completa 1X, un tubo vuoto e un tubo con cinque millilitri di soluzione chelante completa 1X e due millilitri di siero bovino fetale. Il giorno dell'isolamento, metti una capsula di Petri sterile, un bisturi, un secchiello per il ghiaccio e una miscela di nutrienti DMEM avanzati F12 nell'armadio di biosicurezza. Posizionare il numero richiesto di piastra di coltura cellulare a 24 pozzetti nell'incubatore di anidride carbonica per preriscaldarsi.
Posizionare la matrice di membrana extracellulare solubilizzata sul ghiaccio per lo scongelamento. Pre-raffreddare la centrifuga a quattro gradi Celsius. Spostare i supporti completi con fattori di crescita dal congelatore a un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius evitando l'esposizione diretta alla luce.
Agitare i campioni di tessuto nel tubo di trasporto per 30 secondi. Rimuovere il surnatante eccessivo senza scartare alcun tessuto mediante lento pipettaggio vicino alla superficie del fluido fino a quando non rimangono 0,5 millilitri nel tubo. Trasferire il tessuto e il surnatante rimanente in una capsula di Petri sterile.
Usando un bisturi usa e getta, tagliare e tritare il tessuto in pezzi più piccoli che assomigliano a una consistenza di poltiglia per circa cinque minuti. Pipettare il tessuto tritato con liquido dalla capsula di Petri al primo tubo completo della soluzione chelante, quindi aggiungere due millilitri di miscela di nutrienti DMEM avanzati F12 alla capsula di Petri. Lavare il tessuto rimanente e trasferirlo al primo tubo di soluzione chelante completo.
Vortice del tubo della soluzione chelante completa 1X circa cinque volte per cinque secondi. Lasciare che le biopsie si depositino sul fondo del tubo per un minuto e rimuovere il surnatante fino a quando non rimangono cinque millilitri. Trasferire la soluzione chelante completa 1X dalla nuova provetta alla provetta campione.
Ripetere il passaggio precedente per i due tubi seguenti. E negli ultimi due lavaggi, rimuovere il surnatante fino a tre millilitri rimanenti nel tubo. Trasferire le biopsie e la soluzione chelante completa 1X dalla provetta del campione a un pozzetto di una piastra a sei pozzetti.
Aggiungere tre millilitri di soluzione chelante completa 1X alla provetta del campione. Ruotare delicatamente per raccogliere il tessuto rimanente e trasferirlo nello stesso pozzetto della piastra. Aggiungere 150 microlitri di acido tetraacetico etilene diammina molare 0,5 molare in un pozzetto e posizionare la piastra a sei pozzetti su un bilanciere a 20 gradi a 24 rpm a quattro gradi Celsius.
Incubare i campioni di fegato per 10 minuti e i campioni intestinali per un'ora sul bilanciere in movimento. Trasportare la piastra a sei pozzetti nell'armadio di biosicurezza e trasferire il tessuto e il liquido tritati in un tubo contenente 1 soluzione chelante completa 1X con siero bovino fetale. Lasciare che i tessuti si depositino e trasportare il surnatante con 0,2 millilitri della parte superiore del tessuto in un tubo vuoto.
Girare verso il basso il tubo contenente il campione a 700 XG per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Le cellule staminali sono ora pellettate insieme al tessuto tritato. Rimuovere ed eliminare il surnatante con attenzione per non disturbare il pellet.
Risospesciare il pellet in DMEM F12 avanzato. Ruotare nuovamente il tubo e aspirare il surnatante senza disturbare il pellet. Aggiungere il volume calcolato della matrice di membrana extracellulare solubilizzata alla provetta campione.
Fare attenzione quando si rimuovono i supporti in modo da non perdere il pellet cellulare. Quando si aggiunge una matrice di membrana extracellulare, pipettare lentamente per non creare bolle eccessive nella sospensione organoide. Mantenere il campione con la matrice di membrana extracellulare solubilizzata su ghiaccio e seminare la sospensione nel mezzo dei pozzetti in modo che la matrice di membrana extracellulare solubilizzata formi una struttura a cupola.
Trasportare la piastra in un incubatore e consentire alla matrice di membrana extracellulare solubilizzata di solidificarsi per 30 minuti. Mescolare l'inibitore ROCK e GSK3 beta in supporti completi con fattori di crescita e aggiungere 500 microlitri di questa soluzione ad ogni pozzo. Posizionare il piatto nell'incubatrice.
Il protocollo organoide canino genera in genere circa 50.000-150.000 cellule intestinali o epatiche per pozzo. Dopo l'isolamento delle cellule staminali, gli organoidi canini epatici iniziano il loro ciclo di vita come sferoidi in espansione e, dopo sette giorni, si trasformano in organoidi in erba e differenzianti. Sono stati calcolati il volume, la superficie, l'area dell'ellisse 2D e la circonferenza degli sferoidi.
L'area e la circonferenza dell'ellisse 2D sono state utilizzate per valutare la salute della coltura organoide. La valutazione dell'espressione dei marcatori in modo semi-quantitativo ha mostrato che gli sferoidi esprimevano preferenzialmente il marcatore dei colangiociti KRT7 che andava da uno al 26% L'espressione del marcatore delle cellule staminali LGR5 variava tra lo 0,17 e lo 0,78%, mentre i marcatori epatocitari erano espressi in misura inferiore dallo 0,05 allo 0,34% per forkhead box 1A e dallo 0,03 allo 0,28% per il citocromo-P450. Un'incubazione di 12 minuti con proteasi simile alla tripsina non ha inibito la crescita organoide.
Tuttavia, la crescita degli organoidi è stata influenzata negativamente utilizzando un'incubazione di 24 minuti. La sopravvivenza degli organoidi epatici canini in un ambiente sfavorevole è stata analizzata per determinare il volume di mezzi organoidi e matrice basale necessari per la crescita e la sopravvivenza di successo degli organoidi epatici. Il tasso di sopravvivenza degli organoidi variava da 12,9 giorni a 18 giorni.
Le tecniche di coltura cellulare di base e gli approcci asettici sono i prerequisiti essenziali per un corretto isolamento e mantenimento degli organoidi.
