Qui presentiamo NETQUANT, un approccio completamente automatizzato per quantificare le immagini NETS e immunofluorescenza. Ciò aiuterà i ricercatori a effettuare analisi delle immagini comparabili dai dati generati da più utenti e condizioni. I vantaggi di questa tecnica sono la facilità d'uso, l'analisi dei dati a cella singola, più criteri per valutare la formazione net e un'analisi imparziale di più immagini.
Installare e aprire il software di analisi. Una versione aggiornata è disponibile sull'archivio Zenodo GitHub o sul sito Web Nordonfelt Lab. Nella scheda setup scegliere una cartella di origine per l'analisi facendo clic sull'opzione ottieni percorso nel menu di origine.
Selezionare la cartella contenente le sequenze di immagini da analizzare. Anche in questo caso, fare clic sull'opzione ottieni percorso nel menu di destinazione e selezionare la cartella di destinazione per salvare i dati dopo l'analisi delle immagini. Successivamente, quando si utilizzano immagini di canale separate, denominare le cartelle del canale in modo che il canale del DNA corrisponda alla macchia di DNA nucleare e il canale NET raffigura la macchia di elastasi neutrofila nelle immagini.
Assegnare inoltre un nome alla cartella contenente i file di immagine del controllo come controllo. Fare quindi clic sul pulsante carica informazioni immagine e caricare i metadati dell'immagine nel software. Quindi, nel sottochio menu dell'ordine del canale, selezionare l'ordine corretto del canale contenuto nelle immagini.
Questo aiuta a prevenire disallineamenti accidentali. Ora fai clic sul pulsante prepara dati per acquisire le proprietà dell'immagine primaria dai dati non elaborati e convertire le immagini. Le immagini convertite verranno quindi visualizzate nel sotto-menu dei tipi di esempio.
Fare clic sul menu del tipo di campione, selezionare un'immagine dal sottochi menu e fare clic sui dati dell'immagine visualizzata per visualizzare le immagini suddivise rispettivamente nel DNA e nella trappola extracellulare neutrofila o nel canale NET. Per segmentare le cellule nei rispettivi canali, selezionare la scheda del metodo di segmentazione e selezionare un metodo nel sottochia menu del metodo sia per il DNA che per i canali NET. Il metodo predefinito di segmentazione è impostato su adaptive ed è l'impostazione consigliata.
Altre opzioni sono disponibili nel software tra cui bordo globale e chanverse. È stata inclusa anche un'opzione spartiacque per aiutare a distinguere tra cellule o NET posizionati da vicino. Anche nella scheda segmentazione, fare clic sull'opzione esempi di controllo del segmento.
Quindi selezionare PMA dal sottochi menu di tipo di esempio e fare clic sull'opzione batch per iniziare la segmentazione di tutte le immagini incluse nel set di dati. Selezionare quindi le immagini nel menu del tipo di esempio e fare clic sul pulsante visualizza dati immagine per visualizzare e convalidare le maschere immagine binarie sia per le maschere DNA che NET generate dopo la segmentazione. Ora, nella scheda analisi, fare clic sul pulsante determina soglia per analizzare gli esempi di controllo.
Quindi, sul lato destro, cambiare il tipo di campione in PMA e fare clic sul pulsante ottieni proprietà cella per completare l'analisi dei campioni stimolati. Selezionare quindi un'immagine dal sottochio menu del tipo di esempio e fare clic sul pulsante visualizza dati immagine per visualizzare la sovrapposizione e il numero di celle e celle di formazione NET nell'immagine. Iniziare selezionando l'esempio dal sottochilo menu del tipo di esempio.
Le singole immagini possono essere selezionate dal sottochio menu del tipo di campione per l'analisi o l'intero batch di immagini può essere analizzato selezionando l'opzione batch. Una volta selezionata, fare clic sul pulsante analizza NET per completare l'analisi. Regolare manualmente i criteri NET per ottenere risultati ottimali per un determinato campione.
Confronta i NET identificati con le immagini originali per valutare la qualità dell'identificazione. Una volta completato questo passaggio, i criteri NET possono essere applicati a tutte le immagini del set di dati. Qualsiasi modifica apporta ai criteri NET viene applicata contemporaneamente anche a tutti i campioni di controllo.
Esaminare il riepilogo dei dati nel sottochio menu dei dati delle celle, in cui vengono visualizzati il numero di immagini, il numero di celle per immagine e la percentuale di NET per immagine. Immettere la scheda output per selezionare e visualizzare gli output dei risultati. Esplorare e confrontare i vari output di dati generati dall'analisi dei campioni trattati con controllo e PMA selezionando la forma dell'output e facendo clic sul pulsante dei risultati di output.
Avviare quindi il file CSV della tabella dati dei risultati per esplorare i dati a cella singola e fare clic sui file PDF dei risultati per visualizzare la distribuzione dell'area NET e il rapporto DNA/NET nei campioni. La linea rossa indica il valore di soglia nei grafici. Infine, fare clic sul file di distribuzione bivariato dei risultati per determinare l'area NET rispetto alla forma del DNA.
Qui, 15 immagini di neutrofili di controllo e 15 immagini di neutrofili stimolati dal PMA sono state analizzate in meno di dieci minuti. Il numero totale di cellule è stato conteggiato e la percentuale di cellule con trappole extracellulari neutrofile è stata determinata utilizzando il metodo di quantificazione automatizzato descritto in questo articolo. Questi risultati mostrano che i neutrofili stimolati dal PMA hanno un'area più ampia, un aumento della deformazione nucleare e un rapporto DNA/NET più elevato rispetto ai campioni di controllo.
Se combinati in un grafico 3D, i campioni stimolati dal PMA tendono a mostrare aree di raggruppamenti di serraggio rispetto ai campioni di controllo. Durante il tentativo della procedura, è importante ricordare che, sebbene il flusso di lavoro sia stato testato utilizzando più donatori, si consiglia all'utente di decidere i parametri software in modo appropriato in base al singolo set di dati.
