The authors would like to acknowledge Dr. Paul Kubes for his guidance and mentoring that were central in the construction of this work.

NOTA: Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità alle linee guida etiche istituzionali locali. Disegno 1. Sangue <ol><li> Attraverso venipucture antecubitale, raccogliere 14 provette di sangue da un volontario sano in top verde (eparina) tubi e capovolgere ogni tubo prima di stabilirsi sul ghiaccio. Prelevare il sangue entro 10 - 15 minuti di esperimento per garantire la resa ottimale dei neutrofili. </li></ol> 2. neutrofili Isolamento da sangue intero <ol><li> Lavare ciascun tubo verde superiore di sangue con 5 ml di PBS senza Ca e Mg per diluire il sangue. In ognuno dei 4 x 50 ml conici, aggiungere 15 ml di linfociti separazione media (LSM) a temperatura ambiente. Utilizzando un ago 18 G montato su una siringa da 60 ml, strato accuratamente il sangue diluito sul LSM, la creazione di un forte interfaccia LSM-sangue. NOTA: Evitare miscelazione degli strati più possibile. </li><li> Centrifugare a 800 xg per 30 min a 21 ° C senza interruzione. NOTA: Sudden pause puòcausare miscelazione dei diversi strati. </li><li> Osservare eritrociti e neutrofili sedimenti sul fondo. Aspirare e scartare i primi 2 strati (plasma e LSM) facendo attenzione ad eliminare l&#39;interfaccia tra questi strati che contiene linfociti e cellule mononucleate, lasciando solo lo strato rosso fondo. </li><li> Per ogni provetta, aggiungere 20 ml di tampone fosfato salino (PBS) e la soluzione di destrano 20 ml del 6%. Invertire delicatamente ogni provetta per mescolare con lo strato di eritrociti e neutrofili e lasciar riposare a temperatura ambiente per 30 min. NOTA: Questo permetterà globuli rossi (RBC) per sedimentare sul fondo. </li><li> Dopo 30 minuti, trasferire il ricco surnatante neutrofili in tubi nuovi e scartare il pellet RBC. Supernatanti centrifugare a 450 xg a 4 ° C per 5 min. Dopo centrifugazione, scartare il surnatante. Il pellet conterrà per lo più neutrofili e alcuni globuli rossi. </li><li> Preparare una soluzione di lisi aggiungendo 0,5 ml di lisante buffer per 4,5 ml di acqua sterile. Lyse restante RBC con tha preparato 5 ml di soluzione lisante, il trasferimento di tutti precipitato risospeso in un tubo. Lasciare lisi a RT al buio per 10 min. </li><li> Centrifugare a 450 xg a 4 ° C per 5 min. Gettare il surnatante e lavare pellet con 5 ml di PBS senza Ca e Mg e centrifugare di nuovo a 450 xg a 4 ° C per eliminare ogni residuo soluzione lisante. Il pellet ottenuto a questo punto contiene i neutrofili. Risospendere il pellet in 30 ml di RPMI fredda 3% e mettere in ghiaccio. NOTA: 3% RPMI è fatto integrando i media RPMI con 3% siero fetale bovino (FBS) </li><li> Verificare la purezza del campione con blu di metilene colorazione. &gt; 95% di celle deve essere granulociti con nuclei multi-lobare. Utilizzare Trypan blu colorazione per verificare&gt; 95% la vitalità delle cellule e contare la resa finale dei neutrofili. Diluire neutrofili in ghiaccio freddo 3% RPMI per ottenere una concentrazione finale di 5 x 10 6 / ml neutrofili. </li></ol> 3. NET Generation <ol><li> Stimolare neutrofili con 500 nM di PMA (ogni 30 ml di soluzione neutrofili) e incubare su un tessuto piatto piatto 150 x 25mm coltura da 20 mm di griglia per 4 ore a 37 ° C 5% CO 2. Ciò consentirà NETosis. </li><li> Dopo 4 ore di stimolazione, delicatamente aspirare e scartare i media, lasciando lo strato di NET e neutrofili aderito al fondo. Non interrompere questo strato. </li><li> Usando un totale di 15 ml di PBS freddo senza Ca e Mg per piatto, lavare il fondo di ogni piatto pipettando 15 ml di PBS sul fondo del piatto per sollevare tutto il materiale aderente dal fondo. </li><li> Raccogliere soluzione ottenuta dal lavaggio ogni piatto (passo 3.3) in un tubo da 15 ml e centrifugare per 10 min a 450 xg a 4 ° C. I neutrofili e tutte le cellule rimanenti sedimentare sul fondo, lasciando un ricco-NET supernatante privo di cellule. </li><li> Divide surnatante in provette da 1,5 ml di micro-centrifuga e centrifugare per 10 minuti a 18.000 xg a 4 ° C. Questo permetterà tutto il DNA di pellet. NOTA: La centrifugazione in grande tuBES è più facile e meno consumando se velocità così elevate sono raggiungibili in centrifuga regolare, altrimenti sarà necessario dividere supernatanti in tubi più piccoli per utilizzare ad alta velocità micro-centrifuga. </li><li> Eliminare il surnatante e risospendere tutti pellets ottenuti insieme in ghiacciata PBS ad una concentrazione corrispondente a 2 x 10 7 neutrofili per 100 ml di PBS. Ciò comporterà lo stock NET privo di cellule che può essere utilizzato per esperimenti successivi. </li><li> Misurare la concentrazione di DNA nel campione ottenuto mediante spettrofotometria o alternativo strumento quantificazione del DNA. Una concentrazione adeguata del campione deve essere compresa tra 140-180 ng / ml. </li></ol> 4. NET-Cancer Cell Static Adesione saggio <ol><li> Aggiungere 100 microlitri dello stock NET precedentemente ottenuto per pozzetto in una piastra di fondo ben piatta 96 e lasciare pozzetti cappotto O / N a 4 ° C al buio. </li><li> Tra 12 e 20 ore più tardi, verifica la formazione di un monostrato di cellule uniformiNET liberi al fondo dei pozzetti al microscopio (Figura 1). A questo punto, aspirare delicatamente tutto il materiale non aderente dalle fonti, facendo attenzione a non disturbare il monostrato NET in basso. </li><li> Aggiungere 100 ml di 1% albumina sierica bovina (BSA) soluzione bloccante in ogni pozzetto e lasciare per 1 ora a RT. </li><li> Staccare le cellule tumorali A549 da un pallone T-75 di usare 2 ml di 0,25% soluzione tripsina. Una volta rimosso, aggiungere 10 ml di mezzi A549 alle cellule trypsinized e centrifugare a 450 xg a 4 ° C per 5 min. Eliminare le cellule surnatante e risospendere in media per ottenere una concentrazione di 2 x10 4 cellule tumorali per 100 microlitri mezzi. NOTA: le cellule A549 sono state coltivate separatamente. Brevemente, le cellule sono state coltivate e mantenute in mezzi F12 DMEM contenente 10% FBS e 1% penicillina streptomicina e incubate a 37 ° C 5% CO 2. Una volta 70 - è stato raggiunto l&#39;80% di confluenza delle cellule, sono stati staccati con 0,25% tripsina-EDTA e risospese nello stesso supportodescritto sopra. </li><li> Cellule tumorali Stain utilizzando CFSE aggiungendo 1 ml di CFSE per ml di supporti e lasciare macchiare a RT per 10 min. Dopo la colorazione, centrifugare fino a 450 xg a 4 ° C per 5 min poi scarta cellule surnatante e risospendere in volume iniziale di media per ottenere una concentrazione di 2 x 10 4 cellule tumorali per 100 microlitri supporti. </li><li> Dopo 1 h di NET blocco, delicatamente aspirare soluzione bloccante e aggiungere 2 x10 4 cellule tumorali in media, che è equivalente a 100 microlitri, per ben oltre il monostrato NET e permettere ad aderire per 90 min a 37 ° C 5% CO 2. Aspirare delicatamente le cellule e aggiungere 100 ml di soluzione salina in ogni pozzetto per lavare tutte le cellule non-aderenti. </li><li> In alcuni pozzi, aggiungere 1000U di DNAse1 per pozzetto per 10 minuti prima del lavaggio a degradare NET. Questo servirà come controllo negativo. In altri pozzi, aggiungere 100 ml di acqua sterile per bene per 10 minuti, che servirà come il controllo del veicolo (VC). NOTA: 3 replica per condition sono di solito eseguite per aumentare le dimensioni del campione. </li><li> Aspirare ed eliminare tutta la soluzione nei pozzetti lasciando solo NET e cellule tumorali aderenti al fondo. Aggiungere 100 ml di soluzione di formaldeide al 4% per pozzetto per fissare le cellule tumorali aderenti alle reti e leggere analisi al microscopio a fluorescenza (Figura 1). Trama e analizzare i risultati (Figura 3). </li></ol>

<ol>
	<li>Saitoh, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+mediate+a+host+defense+response+to+human+immunodeficiency+virus-1.">Neutrophil extracellular traps mediate a host defense response to human immunodeficiency virus-1.</a> Cell Host Microbe. 12 (1), 109-116 (2012).</li><li>Bruns, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+extracellular+traps+against+Aspergillus+fumigatus+in+vitro+and+in+infected+lung+tissue+is+dependent+on+invading+neutrophils+and+influenced+by+hydrophobin+RodA.">Production of extracellular traps against Aspergillus fumigatus in vitro and in infected lung tissue is dependent on invading neutrophils and influenced by hydrophobin RodA.</a> PLoS Pathog. 6 (4), e1000873 (2010).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Papayannopoulos, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NETs:+a+new+strategy+for+using+old+weapons.">NETs: a new strategy for using old weapons.</a> Trends Immunol. 30 (11), 513-521 (2009).</li><li>McDonald, B., Urrutia, R., Yipp, B. G., Jenne, C. N., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+neutrophil+extracellular+traps+capture+bacteria+from+the+bloodstream+during+sepsis.">Intravascular neutrophil extracellular traps capture bacteria from the bloodstream during sepsis.</a> Cell Host Microbe. 12 (3), 324-333 (2012).</li><li>Pilsczek, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mechanism+of+rapid+nuclear+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+response+to+Staphylococcus+aureus.">A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus.</a> J Immunol. 185 (12), 7413-7425 (2010).</li><li>Villanueva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netting+neutrophils+induce+endothelial+damage,+infiltrate+tissues,+and+expose+immunostimulatory+molecules+in+systemic+lupus+erythematosus.">Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus.</a> J Immunol. 187 (1), 538-552 (2011).</li><li>Khandpur, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NETs+are+a+source+of+citrullinated+autoantigens+and+stimulate+inflammatory+responses+in+rheumatoid+arthritis.">NETs are a source of citrullinated autoantigens and stimulate inflammatory responses in rheumatoid arthritis.</a> Sci Transl Med. 5 (178), 178ra140 (2013).</li><li>Demers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancers+predispose+neutrophils+to+release+extracellular+DNA+traps+that+contribute+to+cancer-associated+thrombosis.">Cancers predispose neutrophils to release extracellular DNA traps that contribute to cancer-associated thrombosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (32), 13076-13081 (2012).</li><li>Hahn, S., Giaglis, S., Hoesli, I., Hasler, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+NETs+in+reproduction:+from+infertility+to+preeclampsia+and+the+possibility+of+fetal+loss.">Neutrophil NETs in reproduction: from infertility to preeclampsia and the possibility of fetal loss.</a> Front Immunol. 3, 362 (2012).</li><li>Cools-Lartigue, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+sequester+circulating+tumor+cells+and+promote+metastasis.">Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells and promote metastasis.</a> J Clin Invest. , (2013).</li><li>Cools-Lartigue, J., Spicer, J., Najmeh, S., Ferri, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+cancer+progression.">Neutrophil extracellular traps in cancer progression.</a> Cell Mol Life Sci. , (2014).</li><li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+how+to+generate+and+visualize+them.">Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them.</a> J Vis Exp. (36), (2010).</li><li>Maqbool, M., Vidyadaran, S., George, E., Ramasamy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimisation+of+laboratory+procedures+for+isolating+human+peripheral+blood+derived+neutrophils.">Optimisation of laboratory procedures for isolating human peripheral blood derived neutrophils.</a> Med J Malaysia. 66 (4), 296-299 (2011).</li><li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+lymphocytes,+granulocytes+and+macrophages.">Isolation of lymphocytes, granulocytes and macrophages.</a> Scand J Immunol. Suppl. 5, 9-15 (1976).</li><li>Calado, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+hormones,+acting+on+the+TERT+gene,+increase+telomerase+activity+in+human+primary+hematopoietic+cells.">Sex hormones, acting on the TERT gene, increase telomerase activity in human primary hematopoietic cells.</a> Blood. 114 (11), 2236-2243 (2009).</li><li>Zhong, C., Qu, X., Tan, M., Meng, Y. G., Ferrara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+regulation+of+bv8+in+human+blood+cells.">Characterization and regulation of bv8 in human blood cells.</a> Clin Cancer Res. 15 (8), 2675-2684 (2009).</li><li>Wu, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+leukocyte+labeling+with+intravenous+ferumoxides/protamine+sulfate+complex+and+in+vitro+characterization+for+cellular+magnetic+resonance+imaging.">In vivo leukocyte labeling with intravenous ferumoxides/protamine sulfate complex and in vitro characterization for cellular magnetic resonance imaging.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 293 (5), C1698-C1708 (2007).</li><li>Saffarzadeh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+directly+induce+epithelial+and+endothelial+cell+death:+a+predominant+role+of+histones.">Neutrophil extracellular traps directly induce epithelial and endothelial cell death: a predominant role of histones.</a> PLoS One. 7 (2), e32366 (2012).</li><li>Fuchs, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps.">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare

Il protocollo di isolamento trappola neutrofili extracellulare dimostrato in questo video combina diverse tecniche utilizzate in letteratura per l&#39;isolamento dei neutrofili e la formazione NET. Semplifica un processo abbastanza complesso e variabile e offre un modo molto affidabile e replicabile per isolare NET privi di cellule purificate con meno passaggi rispetto ad altri protocolli. Inoltre, i reagenti immediatamente disponibili sono impiegati aggiungendo al protocolli semplicità e riducendo in modo significativ...

Neutrofili trappole extracellulari (NET) sono state recentemente scoperti elementi neutrofili-derivati ​​composti da filamenti di DNA extracellulare decorate da centinaia di proteine ​​e istoni. Essi sono secreti dai neutrofili nel contesto di infezione e infiammazione seguenti stimoli specifici e la loro iscrizione iniziale di far parte dei meccanismi del neutrofili di difesa contro le infezioni. Sono stati mostrati prima a promuovere la cattura di vari invasori microbici compresi batteri, virus e funghi 1-3. Trapping del microbo potrebbe poi portare alla sua distruzione sia direttamente da proteine ​​NET-associate 3,4 e indirettamente, attraverso il reclutamento locale di fagociti 5,6. Il ruolo dei NET tuttavia non sembra essere limitato a ospitare difesa. Più di recente, che hanno dimostrato di svolgere un ruolo importante nelle malattie autoimmuni 7,8, trombosi 9, i disturbi legati alla gravidanza 10 e anche la progressione del cancro11,12. Pertanto, sembra che NET svolgono un ruolo importante in un gran numero di diversi processi fisiologici. Tuttavia, data la natura romanzo di tale ricerca, molto resta da chiarire per quanto riguarda i meccanismi con cui NET esercitano i loro effetti. Qui, presentiamo un metodo semplificato per l&#39;isolamento dei NET in assenza di neutrofili. Nel seguente video, dimostriamo una tecnica semplificata e facile da isolare NET dal sangue umano intero. NET cell-free possono quindi essere usati in una serie di esperimenti in vitro compreso colorazione, imuunofluorescence, blotting nonché un certo numero di dosaggi come l&#39;adesione, la migrazione e la proliferazione. Esistono altri protocolli 13, 19, tuttavia sono generalmente lunghe, complesse, costose e spesso, bassa resa 13. Questo protocollo semplificato utilizza reagenti di base e diminuisce il numero di fasi necessarie per isolare neutrofili, minimizzando la lunghezza del Operazire massimizzando il rendimento. Il seguente metodo combina diverse tecniche per l&#39;isolamento dei neutrofili precedentemente descritti in letteratura per ottenere un semplice protocollo formare un campione molto pura di neutrofili vivi. Come suggerito in letteratura, sangue venoso viene raccolto in provette EDTA ed usata entro 10 min per evitare l&#39;attivazione dei neutrofili 14. Usiamo linfociti separazione media (LSM) gradiente di densità centrifugazione per isolare granulociti e globuli rossi dal sangue intero eparinizzato, un metodo adattato dalla tecnica di centrifugazione densità Ficoll inizialmente descritto da Boyum et al 15. LSM è una modifica della formulazione Boyum che sostituisce diatrizoato sodio per la metrizoate sodio ed è stato usato con successo in molti studi per isolare neutrofili 16-18. Dopo differenziale densità centrifugazione, monociti e linfociti vengono scartati; globuli rossi vengono poi sedimentateutilizzando una soluzione Dextran 6% 14 e le restanti globuli rossi vengono lisati di ottenere una popolazione di neutrofili puri, che si verifica con Trypan blu e blu di metilene colorazione. Molti agenti sono stati utilizzati per indurre NETosis sia in vitro che in vivo, compresi lipopolisaccaride (LPS), e forbolo miristato di acetato (PMA) e interleuchine (IL 8-) 3,5,6. Nella seguente protocollo, neutrofili isolati sono stimolati con PMA 500 ​​nM per 4 ore, che ha dimostrato di essere una concentrazione sufficiente per permettere la formazione NET coerente e affidabile senza promuovere apoptosi 19,20. Dopo l&#39;isolamento, si dimostra come NET privi di cellule ottenute da questo protocollo può essere utilizzato in un test di adesione. DNAse1 viene utilizzato per digerire e degradare NET come precedentemente descritto e quindi serve come controllo 2,3,11. Altre opzioni includono l&#39;uso di inibitori dell&#39;elastasi dei neutrofili (NEI) per inibire Formati NETon, che è un&#39;alternativa accettabile quando l&#39;obiettivo è quello di inibire la formazione NET anziché effettuare la degradazione 11. Sebbene NEi ha un certo numero di funzioni diverse, è stato precedentemente dimostrato che NET deposizione può essere inibita da NEi attraverso blocco decondensazione cromatina, degranulazione dei neutrofili nucleare e la morte 12

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="983">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:75px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:573px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (PBS), Modified, without calcium chloride and magnesium chloride</td>
			<td style="width:75px;">Wisent</td>
			<td style="width:119px;">311-425-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Lymphocyte Separation Medium (LSM)</td>
			<td style="width:75px;">Wisent</td>
			<td style="width:119px;">305-010-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dextran hydrochloride (powder)</td>
			<td style="width:75px;">Spectrum</td>
			<td style="width:119px;">DE130</td>
			<td>6% Dextran solution is made by supplementing PBS with Ca and Mg with 6% Dextran powder</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RPMI-1640 Medium with L-glutamine</td>
			<td style="width:75px;">Wisent</td>
			<td style="width:119px;">350-000-CL</td>
			<td>3% RPMI solution is made by supplementing RPMI with 3% Fetal Bovine serum</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">BD Pharm Lyse Lysing buffer</td>
			<td style="width:75px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">555899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td style="width:75px;">Sigma-Alrdrich</td>
			<td style="width:119px;">P8139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNAse1</td>
			<td>Roche</td>
			<td style="width:119px;">11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">F12 DMEM</td>
			<td style="width:75px;">Wisent</td>
			<td style="width:119px;">319-075-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:75px;">Wisent</td>
			<td style="width:119px;">080-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:75px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CFSE</td>
			<td style="width:75px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">C1157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:75px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Integrid tissue culture dish with 20mm grid (150 x 25mm)</td>
			<td style="width:75px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">353025</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simplified human neutrophil extracellular traps (nets) isolation and handling

Neutrofili extracellulari Traps (NET) sono stati recentemente identificati come parte dell&#39;armamentario antimicrobica del neutrofili. Oltre al loro ruolo nella lotta contro le infezioni, una recente ricerca ha dimostrato che possono essere coinvolti in molti altri processi patologici, tra cui la progressione del cancro. Isolare NET purificati è un elemento cruciale per consentire lo studio di queste funzioni. In questo video, dimostriamo un metodo semplificato di cella di isolamento NET esenti da sangue umano intero utilizzando reagenti prontamente disponibili. Isolati NET possono poi essere utilizzati per immunofluorescenza, cancellando o vari test funzionali. Ciò consente una valutazione delle loro proprietà biologiche in assenza dei potenziali effetti confondenti di neutrofili stessi. Una tecnica di separazione gradiente di densità viene impiegato per isolare neutrofili dal donatore sano sangue intero. Isolati neutrofili sono poi stimolati da phorbol 12 MYRiState 13-acetato (PMA) per indurre NETosis. Neutrofili attivati ​​vengono poi scartati, e uno stock NET cell-free si ottiene. Abbiamo poi dimostra come NET isolato può essere utilizzato in un test di adesione sulle cellule tumorali del polmone A549 umani. Lo stock NET è usato per rivestire i pozzi di un 96 e piastra di coltura cellulare O / N, e dopo aver assicurato una adeguata formazione monostrato NET sul fondo dei pozzetti, CFSE etichettati cellule A549 sono aggiunti. Cellule aderenti sono quantificati tramite un microscopio a fluorescenza Nikon TE300. In alcuni pozzi, 1000U DNAse1 viene aggiunto 10 minuti prima di contare fino a degradare NET

Conseguimento di successo di un saggio di adesione statica con NET richiede adeguata rivestimento dei pozzetti con un monostrato di NET prima dell&#39;aggiunta di cellule tumorali (Figura 1). Tutte le fasi successive devono essere eseguiti con attenzione a non interrompere quel livello. Quando si forma un adeguato strato di NET, si prevede una consistente cellule tumorali adesione NET come si vede nella Figura 2A e 2C. Questo effetto è abolita con l&#39;aggiunta di DNA...

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Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

Nella seguente protocollo, si descrive un modo molto semplice per isolare trappole neutrofili extracellulari (NET) da sangue umano intero utilizzando reagenti facilmente disponibili. Abbiamo poi mostrato come i NET isolati possono essere utilizzati in un&#39;adesione test in vitro con cellule tumorali.

Semplificato umani neutrofili extracellulari Traps (NET) Isolamento e Manipolazione

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

29.5K Views.  McGill University.  Nella seguente protocollo, si descrive un modo molto semplice per isolare trappole neutrofili extracellulari (NET) da sangue umano intero utilizzando reagenti facilmente disponibili. Abbiamo poi mostrato come i NET isolati possono essere utilizzati in un'adesione test in vitro con cellule tumorali. 

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Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them intracellularly when their antimicrobial granules fuse with the phagosome. We found that neutrophils have an additional way of killing microorganisms: upon activation, they release granule proteins and chromatin that together form extracellular fibers that bind pathogens. These novel structures, or Neutrophil Extracellular Traps (NETs), degrade virulence factors and kill bacteria1, fungi2 and parasites3. The structural backbone of NETs is DNA, and they are quickly degraded in the presence of DNases. Thus, bacteria expressing DNases are more virulent4. Using correlative microscopy combining TEM, SEM, immunofluorescence and live cell imaging techniques, we could show that upon stimulation, the nuclei of neutrophils lose their shape and the eu- and heterochromatin homogenize. Later, the nuclear envelope and the granule membranes disintegrate allowing the mixing of NET components. Finally, the NETs are released as the cell membrane breaks. This cell death program (NETosis) is distinct from apoptosis and necrosis and depends on the generation of Reactive Oxygen Species by NADPH oxidase5. 
Neutrophil extracellular traps are abundant at sites of acute inflammation. NETs appear to be a form of innate immune response that bind microorganisms, prevent them from spreading, and ensure a high local concentration of antimicrobial agents to degrade virulence factors and kill pathogens thus allowing neutrophils to fulfill their antimicrobial function even beyond their life span. There is increasing evidence, however, that NETs are also involved in diseases that range from auto-immune syndromes to infertility6.
We describe methods to isolate Neutrophil Granulocytes from peripheral human blood7 and stimulate them to form NETs. Also we include protocols to visualize the NETs in light and electron microscopy.

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) are an important innate immune mechanism to fight pathogenic bacteria, fungi and parasites. Here we describe methods to isolate neutrophil granulocytes from human blood and to activate them to form NETs. We present preparation techniques to visualize NETs in light and electron microscopy.

Neutrofili Trappole extracellulare: Come generare e poterle visualizzare

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of lipids. The function of lipids (e.g., in host-pathogen interactions or host entry) has been reported to play a crucial role in cellular processes. Here, we show a method to determine lipid composition, with a focus on the cholesterol level of primary blood-derived neutrophils, by HPTLC in comparison to high performance liquid chromatography (HPLC). The aim was to investigate the role of lipid/cholesterol alterations in the formation of neutrophil extracellular traps (NETs). NET release is known as a host defense mechanism to prevent pathogens from spreading within the host. Therefore, blood-derived human neutrophils were treated with methyl-&#946;-cyclodextrin (M&#946;CD) to induce lipid alterations in the cells. Using HPTLC and HPLC, we have shown that M&#946;CD treatment of the cells leads to lipid alterations associated with a significant reduction in the cholesterol content of the cell. At the same time, M&#946;CD treatment of the neutrophils led to the formation of NETs, as shown by immunofluorescence microscopy. In summary, here we present a detailed method to study lipid alterations in neutrophils and the formation of NETs.

Lipids are known to play an important role in cellular functions. Here, we describe a method to determine the lipid composition of neutrophils, with emphasis on the cholesterol level, by using both HPTLC and HPLC to gain a better understanding of the underlying mechanisms of neutrophil extracellular trap formation.

Metodi per studiare lipidiche Alterazioni nei neutrofili e la formazione successiva di neutrofili extracellulare Traps

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal microscopy methods to visualize macrophage extracellular traps (METs). These extracellular traps are defined by the presence of extracellular chromatin with co-expression of other components such as granule proteases, citrullinated histones, and peptidyl arginase deiminase (PAD). The expression of METs is generally measured after exposure to a stimulus and compared to un-stimulated samples. Samples are also included for background and isotype control. Cells are analyzed using well-defined image analysis software. Confocal microscopy may be used to define the presence of METs both in vitro and in vivo in lung tissue.

Macrophage extracellular traps are a newly described entity. This article will concentrate on confocal microscopy methods and how they are visualized in vitro and in vivo from lung samples.

Visualizzazione del macrofago trappole extracellulari mediante microscopia confocale

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. Immunofluorescence microscopy and image-based quantification methods remain important tools to quantitate neutrophil extracellular trap formation. However, there are key limitations to the immunofluorescence-based methods that are currently available for quantifying NETs. Manual methods of image-based NET quantification are often subjective, prone to error and tedious for users, especially non-experienced users. Also, presently available software options for quantification are either semi-automatic or require training prior to operation. Here, we demonstrate the implementation of an automated immunofluorescence-based image quantification method to evaluate NET formation called NETQUANT. The software is easy to use and has a user-friendly graphical user interface (GUI). It considers biologically relevant parameters such as an increase in the surface area and DNA:NET marker protein ratio, and nuclear deformation to define NET formation. Furthermore, this tool is built as a freely available app, and allows for single-cell resolution quantification and analysis.

Here, we present a protocol for generating neutrophil extracellular traps (NETs) and operating NETQUANT, a fully automatic software option for quantification of NETs in immunofluorescence images.

Quantificazione automatizzata basata su immagini di trappole extracellulari neutrophil utilizzando NETQUANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by neutrophils in response to systemic inflammation or pathogens. Although NETs have previously been shown to augment clot formation and inhibit fibrinolysis in humans and dogs, the role of NETs in cats with cardiogenic arterial thromboembolism (CATE), a life-threatening complication secondary to hypertrophic cardiomyopathy, is unknown. A standardized method to identify and quantify NETs in cardiogenic arterial thrombi in cats will advance our understanding of their pathological role in CATE. Here, we describe a technique to identify NETs in formaldehyde-fixed and paraffin-embedded thrombi within the aortic bifurcation, extracted during necropsy. Following deparaffinization with xylene, aortic sections underwent indirect heat-induced antigen retrieval. Sections were then blocked, permeabilized, and ex vivo NETs were identified by colocalization of cell-free DNA (cfDNA), citrullinated histone H3 (citH3), and neutrophil elastase (NE) using immunofluorescence microscopy. To optimize the immunodetection of NETs in thrombi, autofluorescence of tissue elements was limited by using an autofluorescence quenching process prior to microscopy. This technique could be a useful tool to study NETs and thrombosis in other species and offers new insights into the pathophysiology of this complex condition.

We describe a method to identify neutrophil extracellular traps (NETs) in formaldehyde-fixed and paraffin-embedded feline cardiogenic arterial thrombi using heat-induced antigen retrieval and a double immunolabeling protocol.

Identificazione delle trappole extracellulari neutrophil in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi utilizzando la microscopia immunofluorescenza

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by ...

Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of neutrophil extracellular traps (NETs). This study analyzes the morphological and compositional changes in NETs induced by microbial and chemical stimuli using standardized in vitro methodologies for NET induction and characterization with human cells. The procedures described here allow the analysis of NET morphology (lytic or non-lytic) and composition (DNA-protein structures and enzymatic activity), and the effect of soluble factors or cellular contact on such characteristics. Additionally, the techniques described here could be modified to evaluate the effect of exogenous soluble factors or cellular contact on NET composition.
The applied techniques include the purification of polymorphonuclear cells from human peripheral blood using a double density gradient (1.079-1.098 g/mL), guaranteeing optimal purity and viability (&#8805; 95%) as demonstrated by Wright's staining, trypan blue exclusion, and flow cytometry, including FSC versus SSC analysis and 7AAD staining. NET formation is induced with microbial (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, and Candida albicans) and chemical (phorbol myristate acetate, HOCl) stimuli, and the NETs are characterized by DNA-DAPI staining, immunostaining for the antimicrobial peptide cathelicidin (LL37), and quantification of enzymatic activity (neutrophil elastase, cathepsin G, and myeloperoxidase). The images are acquired through fluorescence microscopy and analyzed with ImageJ.

Presented here is a protocol for the induction and analysis of in vitro neutrophil extracellular traps (NETs). Quantification of DNA, cathelicidin (LL37), and enzyme activity yielded data that show the variability in the composition and morphology of NETs induced by microbial and chemical stimuli under similar controlled conditions.

Analisi morfologica e composizionale di trappole extracellulari neutrofile indotte da stimoli microbici e chimici

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of ...

Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures composed of DNA with granule proteins, such as myeloperoxidase (MPO) and neutrophil elastase (NE), and cytoplasmic and cytoskeletal proteins. Although interest in NETs has increased recently, no sensitive, reliable assay method is available for measuring NETs in clinical settings. This article describes a modified sandwich enzyme-linked immunosorbent assay to quantitatively measure two components of circulating NETs, MPO-DNA and NE-DNA complexes, which are specific components of NETs and are released into the extracellular space as breakdown products of NETs. The assay uses specific monoclonal antibodies for MPO or NE as the capture antibodies and a DNA-specific detection antibody. MPO or NE binds to one site of the capture antibody during the initial incubation of samples containing MPO-DNA or NE-DNA complexes. This assay shows good linearity and high inter-assay and intra-assay precision. We used it in 16 patients with COVID-19 with accompanying acute respiratory distress syndrome and found that the plasma concentrations of MPO-DNA and NE-DNA were significantly higher than in the plasma obtained from healthy controls. This detection assay is a reliable, highly sensitive, and useful method for investigating the characteristics of NETs in human plasma and culture supernatants.

We present a protocol for a modified sandwich enzyme-linked immunosorbent assay technique to quantitatively measure two components of neutrophil extracellular trap remnants, myeloperoxidase conjugated-DNA and neutrophil elastase conjugated-DNA complexes,derived from activated neutrophils.

Quantificazione dei complessi mieloperossidasi-DNA e elastasi-DNA neutrofili da trappole extracellulari di neutrofili utilizzando un ELISA a sandwich modificato

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures ...

Colorazione e imaging per visualizzare le trappole extracellulari dei neutrofili

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in autoimmune diseases and sterile inflammation. They are web-like structures composed of double-stranded DNA filaments, histones, and antimicrobial proteins. Once released, NETs can trap and kill extracellular pathogens in blood and tissue. Furthermore, NETs participate in homeostatic regulation by stimulating platelet adhesion and coagulation. However, the dysregulated production of NETs has also been associated with various diseases, including sepsis or autoimmune disorders, which makes them a promising target for therapeutic intervention. Apart from electron microscopy, visualizing NETs using immunofluorescence imaging is currently one of the only known methods to demonstrate NET interactions in tissue. Therefore, various staining methods to visualize NETs have been utilized. In the literature, different staining protocols are described, and we identified four key components showing high variability between protocols: (1) the types of antibodies used, (2) the usage of autofluorescence-reducing agents, (3) antigen retrieval methods, and (4) permeabilization. Therefore, in vitro immunofluorescence staining protocols were systemically adapted and improved in this work to make them applicable for different species (mouse, human) and tissues (skin, intestine, lung, liver, heart, spinal disc). After fixation and paraffin-embedding, 3 &#181;m thick sections were mounted onto slides. These samples were stained with primary antibodies for myeloperoxidase (MPO), citrullinated histone H3 (H3cit), and neutrophil elastase (NE) according to a modified staining protocol. The slides were stained with secondary antibodies and examined using a widefield fluorescence microscope. The results were analyzed according to an evaluation sheet, and differences were recorded semi-quantitatively.
Here, we present an optimized NET staining protocol suitable for different tissues. We used a novel primary antibody to stain for H3cit and reduced non-specific staining with an autofluorescence-reducing agent. Furthermore, we demonstrated that NET staining requires a constant high temperature and careful handling of samples.

Autore in primo piano: Imaging di trappole extracellulari neutrofile in tessuti umani e di topo 

Neutrophil extracellular traps (NETs) are associated with various diseases, and immunofluorescence is often used for their visualization. However, there are various staining protocols, and, in many cases, only one type of tissue is examined. Here, we establish a generally applicable protocol for staining NETs in mouse and human tissue.

Imaging in immunofluorescenza di trappole extracellulari di neutrofili in tessuti umani e murini

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...