Questo protocollo dimostra l'eterogeneità nella composizione, struttura e morfologia delle trappole extracellulari dei neutrofili, a seconda del loro stimolo inducente in condizioni comparabili in vitro nei neutrofili umani di individui sani. Si ottengono un'elevata purezza e vitalità dei neutrofili. Ciò consente di confrontare la concentrazione di DNA, LL-37 e l'attività enzimatica della mieloperossidasi, dell'elastasi e della catepsina G, rilasciate dalle trappole extracellulari dei neutrofili.
Questo protocollo ha permesso di analizzare l'effetto di fattori solubili o di contatto cellulare o possibili terapie o meccanismi di chiusura sulla produzione di NET nelle malattie autoimmuni. Questi metodi possono aiutare nello studio della malattia autoimmune. A causa della riproduzione cellulare incontrollata dei NET e della durata dell'allineamento dei loro componenti, che sono considerati biomarcatori della malattia.
La microscopia a fluorescenza permette di catturare immagini di NET che mostrano la dispersione del DNA in associazione con proteine come LL37, che co-localizzato con microrganismi aiutando a capire come stanno apparendo. Per iniziare, eseguire la puntura della vena per raccogliere 10 millilitri di sangue periferico in provette contenenti EDTA dipotassico come anticoagulante. Quindi eseguire la biometria del sangue standard e il test della proteina C-reattiva per escludere infezioni o infiammazioni per garantire la qualità del campione.
Centrifugare il campione di sangue periferico per rimuovere il plasma ricco di piastrine, seguito da una seconda centrifugazione e scartare il plasma rimanente. Diluire il pacchetto eritrocitario e leucocitario risultante in un rapporto di volume uno-a-uno con un DPBS 1X. Quindi, in un tubo di vetro sterile da 10 millilitri, depositare prima un millilitro di soluzione di densità da 1,08 grammi per millilitro seguito da un millilitro di soluzione di densità di 1,079 grammi per millilitro.
Quindi, aggiungere quattro millilitri del pacchetto eritrocitario e leucocitario diluito versando sulle pareti. Centrifugare senza accelerazione o decelerazione per evitare di disturbare la pendenza. Aspirare la fase corrispondente ai granulociti e trasferire in un altro tubo di vetro sterile da 10 millilitri.
Lavare con quattro millilitri di 1X DPBS a 300 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius ed eliminare il surnatante. Per rimuovere gli eritrociti rimanenti, trattare le cellule con shock osmotico aggiungendo quattro millilitri di soluzione salina allo 0,2%. Incubare per due minuti a quattro gradi Celsius e centrifugare.
Scartare il surnatante e aggiungere quattro millilitri di soluzione salina allo 0,65%. Incubare per cinque minuti a quattro gradi Celsius per ripristinare l'integrità della membrana e ripetere la centrifugazione. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in quattro millilitri di 1X DPBS per rimuovere i detriti cellulari.
Ancora una volta, centrifugare e risospendere il pellet cellulare in due millilitri di tampone HBSS freddo. Per eseguire un test di esclusione del blu tripano, diluire cinque microlitri della sospensione cellulare in 20 microlitri di blu tripano allo 0,4%. Contare le cellule in una nuova camera bower e determinare la vitalità cellulare utilizzando un test di esclusione.
Quindi, montare 5 microlitri della sospensione cellulare su un vetrino e colorare con la macchia di Wright per 15 secondi. Fissare immediatamente il campione, lavare con acqua distillata e osservare la morfologia al microscopio ottico. Quindi, aggiungere una volta 10 alle quinte cellule per far fluire i tubi di citometria e colorare con un microlitro di 7AAD in 100 microlitri di tampone FACS per 15 minuti a quattro gradi Celsius al buio.
Lavare con 500 microlitri di tampone FACS a 300 G per 10 minuti. Fissare le cellule con 500 microlitri di paraformaldeide al 2% e conservare a quattro gradi Celsius fino all'analisi citometrica a flusso. Per un controllo delle cellule morte, fissare le cellule con 200 microlitri di paraformaldeide al 4% per 30 minuti e lavare con 500 microlitri di 1XPBS a 300 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius.
Scartare il surnatante e aggiungere 200 microlitri di Triton X-100 allo 0,1%. Incubare per un'ora a quattro gradi Celsius. Lavare con 500 microlitri di 1X PBS e colorare con 7AAD.
Analizza i dati acquisiti nel software del citometro a flusso. Carica i file e fai doppio clic sul file neutrofilo non macchiato. Scegliere forward scatter o FSC sull'asse X e dispersione laterale o SSC sull'asse Y per visualizzare la popolazione cellulare corrispondente ai neutrofili.
Quindi selezionare il canale B3-A:PerCP vio 700-A sull'asse X per delimitare l'autofluorescenza delle celle e scegliere l'istogramma sull'asse Y. Quindi, aprire il file di neutrofili macchiati. Scegliere FSC sull'asse X e SSC sull'asse Y per visualizzare la popolazione cellulare corrispondente ai neutrofili.
Anche in questo caso, selezionare il canale B3-A:PerCP vio 700-A per delimitare la popolazione di neutrofili positivi per il colorante 7AAD. Generare l'istogramma finale facendo clic con il pulsante destro del mouse sulla finestra e selezionando copia nell'editor di layout. Aggiungere pseudoife batteriche o fungine in micro tubi da 1,5 millilitri.
Aggiungi 200 microlitri, quindi cinque CFSC micromolari in 1X PBS. Mescolare e incubare a 37 gradi Celsius per 10 minuti al buio. Interrompere la reazione aggiungendo 500 microlitri di plasma decomplementato e centrifuga.
Scartare il surnatante e lavare il pellet con un millilitro di 1XPBS con centrifugazione. Quindi risospendere i microrganismi in 250 microlitri di 1X PBS. Preparare aliquote da 50 microlitri in microtubi da 1,5 millilitri con due volte 10 al settimo batterio o due volte 10 alla quinta pseudoife per l'induzione NET.
Posizionare 10 per 10 millimetri di copertura sterile di vetro scivola in una piastra da 24 pozzetti. Coprire con 10 microlitri di l-lisina poli-0,001% per un'ora a temperatura ambiente e lavare due volte con 100 microlitri di 1X PBS. Asciugare all'aria e irradiare con luce UV per 15 minuti.
Quindi, sostituire la soluzione HBSS della sospensione di neutrofili preparata in precedenza con mezzo RPMI 1640 integrato con plasma autologo decomplementato al 10% di calore. Aggiungere 350 microlitri di questa sospensione cellulare alla piastra a 24 pozzetti per una concentrazione finale di due volte 10 al quinto neutrofilo per pozzetto. Incubare la piastra per 20 minuti a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per consentire alle cellule di aderire al fondo dei pozzetti.
Per indurre la formazione di reti, aggiungere gli stimoli batterici MOI100 e le pseudoife a MOI1. Aggiungi anche gli stimoli biochimici e prepara un controllo senza stimolo aggiungendo 50 microlitri di HBSS. Ottenere un volume finale di 400 microlitri per pozzetto e mescolare su uno scuotitore a 140 RPM per 30 secondi.
Quindi incubare per quattro ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Dopo l'induzione netta, rimuovere il surnatante dai pozzetti pipettando accuratamente e fissare le cellule con 300 microlitri di paraformaldeide al 4% per 30 minuti. Lavare le celle con 200 microlitri di 1X PBS senza centrifugare e aggiungere 200 microlitri di tampone bloccante per 30 minuti.
Per la colorazione LL37, permeabilizzare le cellule con 200 microlitri di Triton X-100 allo 0,2% in 1X PBS per 10 minuti e lavare con 1X PBS due volte. Montare le scivolate di copertura su vetrini. Colorare le cellule con due microlitri di DAPI e conservarle a meno 20 gradi Celsius fino all'analisi mediante microscopia a fluorescenza confocale.
Le fasi cellulari dinamiche sono state visualizzate dopo la purificazione del gradiente a doppia densità. La tipica morfologia dei neutrofili è stata confermata dalla giusta colorazione. Le cellule hanno anche mostrato una vitalità ottimale osservata dall'esclusione del blu di tripano senza interruzione della membrana.
L'analisi di SSC versus FSC mediante citometria a flusso ha confermato una popolazione corrispondente a PMN con elevata purezza cellulare. I dot plot PMN per le cellule non colorate rispetto alle cellule colorate 7AAD e i loro rispettivi istogrammi hanno indicato un'elevata vitalità cellulare nei neutrofili appena isolati rispetto alle cellule di controllo permeabilizzate. Dopo aver stimolato i neutrofili con stimolanti chimici e microbici, i NET sono stati visualizzati mediante microscopia a fluorescenza utilizzando DPI del DNA e anti-LL37.
I microrganismi sono stati pre-colorati con CFSE. Formazione di rete suicidaria indotta da PMA indicata dalla co-localizzazione con LL37. Mentre i NET formati con HOCI hanno mostrato una minore dispersione del DNA nello spazio extracellulare che corrispondeva alla formazione di NET vitale.
NET indotta da pseudoife fungine ha mostrato basse concentrazioni di DNA rilasciato nello spazio extracellulare con strutture filamentose caratteristiche della formazione vitale di NET. S.aureus ha mostrato la formazione di NET vitale mentre P.aeruginosa ha indotto il rilascio di grandi concentrazioni di DNA con una morfologia torbida che si è co-localizzata con LL37 indicando la formazione di NET suicida. L'esecuzione della metodologia del doppio gradiente di densità ci consente di ottenere un'elevata purezza e vitalità dei neutrofili.
E eleviamo i lavaggi, evitiamo di danneggiarne la struttura. Seguendo questo metodo possiamo analizzare l'effetto di sostanze o cellule nella produzione di NET e se sono coinvolte in qualche meccanismo o il loro uso come terapie nelle malattie autoimmuni.
