In Vitro Metodo di controllo delle concentrazioni di gas alogenati in cellule epiteliali alveolari coltivate

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della ricerca sulle lesioni polmonari e sulla riparazione come testare l'aggiunta alogenata come potenziali nuove terapie per la sindrome da distress respiratorio acuto. Il vantaggio principale di questa tecnica è che si basa su un metodo molto semplice per coltura delle cellule e per esporle ad agenti alogenati al fine di raggiungere concentrazioni precise e controllate. Per costruire la camera ermetica, utilizzare una scatola ermetica in polipropilene con una capacità di 6,5 litri.

Praticare un foro di 2,5 centimetri di diametro sul lato inferiore della parete laterale della scatola. Quindi inserire un tubo ondulato con un segno verde che fungerà da tubo di ingresso della miscela di aria gassosa. E sigillare con silicone.

Successivamente, praticare un secondo foro con un diametro di 2,5 centimetri sul lato superiore della parete laterale opposta. Inserire un altro tubo ondulato con un segno rosso e collegarlo con un filtro a carbone che fungerà da tubo di uscita della miscela di aria gassosa. Quindi sigillare con silicone.

Successivamente praticare un foro stretto con un diametro di quattro millimetri al centro della parete. Inserire il breve tubo di infusione collegato a un collettore con un blocco di esca maschile rotante. Collegalo a un analizzatore di gas e sigillalo con silicone.

Quindi posizionare un termometro digitale all'interno della camera ermetica. Sotto una cappa aspirante di laboratorio, personalizzare un circuito della macchina anestetica per cambiare la linea di gas protossido di azoto con anidride carbonica. Inserire un umidificatore riscaldato nel tubo tra la macchina anestetica e la camera ermetica per riscaldare la miscela di flusso di gas a circa 37 gradi Celsius.

Collegare la camera ermetica con il tubo ondulato marcato verde nel circuito personalizzato della macchina anestetica. Quindi, posizionare la camera ermetica su una piastra calda impostata su 37 gradi Celsius. Posizionare una piastra di sei potte contenente cellule epiteliali alveolari umane nella camera ermetica e sigillare il coperchio.

Regolare la portata del gas per ottenere rapidamente il 5% di CO2. Quindi aprire l'evaporatore dell'agente alogenato e regolare la percentuale desiderata. Una volta raggiunti i valori obiettivo, ridurre la portata del gas fresco a un litro al minuto.

La camera ermetica può essere mantenuta con questa portata di gas per tutto il tempo necessario per l'esperimento. I corsi delle concentrazioni di sevoflurane e isoflurane nel mezzo erano simili nel tempo. Subito dopo aver fissato la concentrazione richiesta di agente alogenato, le concentrazioni sono aumentate nel corso della prima ora.

Fu quindi raggiunto un altopiano che persistette fino a quando la somministrazione dell'agente alogenato non fu fermata. Dopo l'interruzione della somministrazione, le concentrazioni sono diminuite entro un'ora. Qui sono mostrate le frazioni di agente alogenato nel tempo nella camera ermetica misurata dall'analizzatore di gas.

Questa procedura è relativamente economica e molto facile da adottare anche quando i ricercatori non hanno mai manipolato una camera ermetica prima d'ora. Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come la quantificazione di proteine e RNA, l'immunofluorescenza, la misurazione della permeabilità proteica e il trasporto libero al fine di rispondere alle domande sugli effetti specifici degli agenti alogenati durante la lesione polmonare epiteliale e la sua risoluzione. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica può spianare la strada alla ricerca nel campo della sindrome da distress respiratorio acuto per studiare ulteriormente il meccanismo coinvolto nella lesione polmonare epiteliale durante l'ARDS e per testare nuove terapie.