The authors thank Colleen Van Kirk for mouse retina and cerebellum samples, and Peter Gregory for figure generation. The authors also thank Dr. Allison Gillaspy and the Laboratory for Molecular Biology and Cytometry Research core for access to the MiSeq. This work was supported by NIH grants DA029405, EY021716, and AG026607 and the Donald W. Reynolds Foundation.

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The authors have nothing to disclose.

BSAS consente concentrata, precisa quantificazione metilazione del DNA con elevate capacità di throughput sia il numero di campioni e il numero di obiettivi. Inoltre, questa generazione biblioteca utilizzando tagmentation transposome-mediata richiede meno DNA di ingresso, è più veloce e contiene meno passaggi rispetto tosatura tradizionale e successive tecniche adattatore legatura. Questi miglioramenti rispetto ai metodi attuali consentono precise a livello di base di analisi di metilazione del DNA di qualsiasi target di interesse. Inoltre, BSAS fornisce un nuovo metodo per la conferma delle regioni di interesse (regioni metilazione differenziale (tipo DMRS), isole CpG, regioni di regolamentazione) che sono stati identificati mediante intero genoma bisolfito 22 o catturare 23 approcci. Utilizzando approcci conferma ortogonali e più quantitativamente metodi precisi migliora il rigore analitico degli studi epigenomiche. La profondità elevata di lettura realizzato con BSAS consente per la quantificazione precisa in un intervallo di confidenza stretto, risultazione in quantificazione precisa 16. Inoltre, la possibilità di eseguire molti campioni in un singolo esperimento può aumentare la dimensione del campione per le conferme di metodi intero genoma, che consentirà di aumentare la potenza statistica; una debolezza di molti attuali studi epigenetici. È importante sottolineare che, BSAS fornisce un CpG metilazione quantificazione specifica-base, che consente la generazione di ipotesi verificabili per la ricerca epigenetica. Ipotesi come l&#39;aumento metilazione in un elemento di risposta specifica si tradurrà in una diminuzione legame di un fattore di trascrizione specifico. BSAS, combinati con dati di espressione di mRNA appaiati, fornisce un metodo per ottenere sia la regolazione epigenetica e l&#39;espressione di mRNA in un unico pezzo di tessuto o di una popolazione di cellule. Misure appaiati di regolamentazione e di espressione anche aumentare il rigore scientifico e l&#39;impatto dei risultati. Passaggi critici all&#39;interno del protocollo BSAS comprendono la progettazione di primer, ottimizzazione amplicon, e la generazione di biblioteca /QC. Polarizzazione PCR è introdotto se primer non sono progettati correttamente e amplificano a diverse efficienze 8. L&#39;utilizzo di standard di metilazione, come enzimaticamente generati 100% e 0% citosina standard metilati, può essere utilizzato per determinare il grado, se presente, di polarizzazione metilazione quantificazione, ed è un controllo metodologico appropriato quando quantificare metilazione 16. Allo stesso modo, si deve prestare attenzione quando si ottimizza reazioni PCR per la generazione di un singolo amplicone di alta qualità. Se non amplicone è presente con le linee guida suggerite descritti nel protocollo, passaggi di ottimizzazione includono un numero crescente di ciclo PCR o importo ingresso bsDNA. Se ci sono più prodotti PCR, compreso di primer-dimeri, passaggi di ottimizzazione includono diminuendo quantità di input bsDNA, diminuendo le concentrazioni di ingresso molari PCR Primer, aumento delle temperature di ricottura, o diminuendo il numero di ciclo PCR. Uno o una combinazione di questi procedimenti di ottimizzazione produce risultati sufficienti per generare una singola higamplicon h-qualità. In alternativa, ridisegnando primer è un buon approccio per i set di primer che non producono un singolo amplicone. Per le regioni in cui la riprogettazione non è adatto o possibile, degenerare set di primer, tra cui sia possibile lavorare di citosina e timina all&#39;indirizzo siti CpG in primer avanti e adenina e guanina di di in siti CpG in primer inverso. Tuttavia, questi set di primer devono ottimizzare ulteriormente per garantire l&#39;assenza di pregiudizi PCR è in corso, un processo al di fuori del campo di applicazione di questo protocollo. Librerie di qualità sono estremamente importanti per il successo. Garantire che le misure di controllo di qualità vengono effettuati per determinare le dimensioni, la qualità e la quantità delle librerie prima di sequenziamento. Le reazioni di sequenziamento sono inclini al fallimento con il contributo di librerie di bassa qualità. Bias in metilazione quantificazione può essere mitigato assicurando che le frequenze di metilazione sono presenti in entrambi avanti e retromarcia sequenziamento legge. Inoltre, i punteggi di qualità delle basi allineando a siti CpG dovrebbero essere ≥Q30 per alta confidence in quantificazione. Mentre altri hanno mostrato in precedenza poco o nessun pregiudizio in reazioni tagmentation di bisolfito DNA convertito 19, garantendo i parametri sopra descritti consente la conferma della bassa quantificazione pregiudizi metilazione. BSAS misura attualmente metilazione in siti CpG, però, le future espansioni di questo metodo consentirà misurazioni appaiate del CpG 5-HMC con l&#39;aggiunta di fasi sperimentali distinguendo tra 5-MC e 5-HMC quali l&#39;introduzione di perruthenate potassio prima della conversione bisolfito 24. Ciò aumenterà l&#39;impatto dell&#39;utilità BSAS consentendo metilazione associato, sia dati di espressione 5-mC e 5-HMC, e per determinare espressione genica ruoli normativi di metilazione del DNA. Preparazione biblioteca Transposome-mediata di ampliconi della PCR non comporta approfondito sequenziamento diminuito alle estremità delle regioni amplificate. Pertanto, le regioni di grande interesse dovrebbero essere progettati per risiedere nel mezzo di ampliconi. Comemai, perché BSAS genera sequenziamento leggere profondità di&gt; 1.000 X, la precisione quantitativa di 5-MC misurazioni vicino ai confini delle regioni amplificate rimane elevato.

E &#39;passato più di mezzo secolo da quando il primo rapporto di naturalmente modifiche del DNA in forma di citosina metilazione 1. Citosina metilazione è una base citosina nucleotide modificato in cui il 5 ° di carbonio sull&#39;anello di base ha un gruppo metilico (5-MC), più frequentemente si verificano nel dinucleotide CpG motivo nei genomi dei mammiferi. La presenza funzionale della 5-mC in promotori genici è generalmente associata con la repressione trascrizionale, mentre l&#39;assenza è associato con l&#39;attività trascrizionale 2. Enormi progressi sono stati fatti nella comprensione del ruolo della metilazione del DNA in fase di sviluppo 3, transgeneration propagazione di profili epigenetici 4, cancro patogenesi 5,6, e un certo numero di altri settori di ricerca. Molti di questi progressi sono venuti negli ultimi anni come nuove metodologie sono state sviluppate al profilo di metilazione del DNA 7. Con l&#39;avvento edivulgazione di tecniche di sequenziamento di prossima generazione (NGS) ora ci sono una serie di metodi per profilare la metilazione del DNA di un intero genoma o grandi regioni del genoma 8. Questi approcci aprono la possibilità di studi scoperta che quantificano metilazione del DNA e le differenze di metilazione del DNA. In aggiunta a questi approcci ipotesi che generano, vi è una forte necessità di target / Test di ipotesi DNA metodi metilazione di quantificazione. Pyrosequencing, metilazione specifico PCR, e Sanger sequenziamento diretto del DNA bisolfito convertito sono stati i metodi più utilizzati per l&#39;analisi delle regioni mirati (ad esempio, una regione del promotore di un singolo gene o un&#39;isola CpG) 9-12. Tutti questi metodi si basano sulla conversione bisolfito, una reazione chimica deaminazione dove citosina non metilate del sono convertiti in uracile di, mentre citosina metilati di 13,14 rimangono intatte. Amplificazione PCR di bisulfite-convertiti risultati del DNA in sostituzione di uracile di con timina 15 che consentono la metilazione differenziale leggere come una differenza di base. Mentre molto utile, le limitazioni a questi metodi includono bassa precisione quantitativa, lunghezza lettura breve, e la velocità bassa del campione. Per far fronte a queste limitazioni abbiamo sviluppato un metodo che abbiamo definito bisolfito Amplicon Sequencing (BSAS) 16. L&#39;obiettivo di questo metodo è quello di poter analizzare bersaglio regioni genomiche di interesse in un gran numero di campioni con elevata precisione quantitativa. BSAS utilizza elementi di metodi esistenti (conversione bisolfito e specifiche regione amplificazione PCR) e li combina con semplice costruzione di nuova generazione library (transposome-mediata) 17 e da banco NGS 18 (Figura 1). Questo approccio prevede un metodo di throughput più quantitativa e superiore per esaminare la metilazione citosina in qualsiasi regione di interesse. Ecco a voi laMetodo in dettaglio e descrivere approcci per la risoluzione dei problemi e la qualità controllo del processo BSAS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="840">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:304px;">Name</td>
			<td style="width:255px;">Company</td>
			<td style="width:97px;">Cat #</td>
			<td style="width:185px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agilent 2100 Bioanlyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G29393AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agilent RNA 6000 Nano kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agilent High Sensitivity DNA kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Typhoon 9200</td>
			<td>Amersham/GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agencourt AMPure XP - PCR Purification</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>164-5050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">twin.tech PCR plate 96&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951020362</td>
			<td>semi-skirted</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heatsealing Film</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030127838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heatsealing Foil</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030127854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heat Sealer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5390000.024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.1-10ul Tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030073.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2-200ul Tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030073.045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">50-1000ul Tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030073.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MixMate&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5353000.014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1.5 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030121.023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge 5424</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424000.010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2.0 mL Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022363352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nextera XT DNA Sample Preparation Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1024</td>
			<td>24 rxn</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nextera XT Index Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1001</td>
			<td>24 indexes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MiSeq Desktop Sequencer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MiSeq Reagent Kit v2</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>MS-102-2002</td>
			<td>300cycle</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KAPA SYBR FAST Universal qPCR kit</td>
			<td>KAPA Biosystems</td>
			<td>KK4824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P7589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Quant-iT RiboGreen RNA Assay kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>R11490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ProFlex 96-well PCR system</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4484075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Novex 6% TBE DNA gel</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>EC6261BOX</td>
			<td>10-well</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Novex TBE Running Buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>LC6675</td>
			<td>5X (1 L)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Novex Hi-Density TBE Sample Buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>LC6678</td>
			<td>5X (10 mL)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1 Kb Plus DNA Ladder</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10787-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Xcell SureLock Mini-Cell</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">UltraPure 10mg/mL Ethidium Bromide</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15585-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">7900HT Fast Real-Time PCR system</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4329001</td>
			<td>384well block</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DynaMag-96 Side Skirted</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SpectroMax M2 Multi-Mode Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices/VWR</td>
			<td>89429-532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AllPrep DNA/RNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stainless Steel Beads</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69989</td>
			<td>5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CLC Genomics Workbench</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td>Software for methylation pipeline</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QIAQuick PCR Purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>50 rxn</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TissueLyser II</td>
			<td>Retsch/Qiagen</td>
			<td>85300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nuclease-Free Water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W4502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TRIS hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PHG0002-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NanoDrop 2000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">384-well Full-Skirted Plate, Standard</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB-1384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Absolute qPCR Seal</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB-1170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EZ DNA Methylation-Lightning kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5030</td>
			<td>50 rxn</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ZymoTaq DNA Polymerase</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>E2001</td>
			<td>50 rxn</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeted dna methylation analysis by next-generation sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.

BSAS si legge correttamente allineato a sequenza di riferimento convertito sarà simile alla Figura 5. Dinucleotides CPG possono chiaramente essere identificati e gli stati di metilazione possono essere stimati osservando le chiamate di base a siti CpG nel mappato legge. Ad esempio, con comandi metilazione, 0% metilazione comporta tutte le letture mappati a siti CpG contenenti T (Figura 5A). 100% dei controlli metilazione comporterà tutta la letture mappato legge a siti contenenti CpG di C (Figura 5B). La quantificazione della frequenza di citosina (C / C + T) in siti CpG produce la frequenza metilazione nel campione originale. Una curva standard generata dal rappresentante interi controlli genoma metilazione (n = 3 / rapporto metilazione) mostra linearità metilazione quantificazione nonché precisione quantificazione a ciascun rapporto metilazione (Figura 6). Come esempio di questo metodo in totale, RNA e DNA sono stati co-iso<html> lata di topo cervelletto e retina (n = 4 / group). Espressione Rhodopsin, selettivamente espresso in tessuto retinico, è stata misurata utilizzando qPCR. Expression è stata rilevata in retina (Figura 7A). Utilizzando BSAS, i livelli di metilazione CpG sono stati quantificati nella regione del promotore rodopsina. Livelli di metilazione cumulativi tutta la regione promotore erano&gt; 80% nel cervelletto rispetto al &lt;15% nella retina (p &lt;0,001, t-test parametrico) (Figura 7B). BsAs benefici metilazione di quantificazione di site-specific metilazione quantificazione, e livelli di metilazione possono essere confrontati su base CpG-specifica attraverso una determinata regione genomica. Livelli di metilazione CpG in tutto il promotore rodopsina erano significativamente più alti nei campioni cerebellari rispetto ai campioni di retina (p &lt;0.001, t-test parametrico in ciascun sito CpG) (Figura 7c). 1highres.jpg &quot;/&gt; Figura 1:. Schema del metodo BSAS In questo metodo, il DNA genomico è bisolfito convertito modificare cytosines unmethylation a uracils. Successivamente, durante la PCR questi uracils vengono modificati a timina. Amplificazione PCR è diretto contro le regioni di interesse e altamente arricchisce solo per queste sequenze. I risultanti ampliconi della PCR sono fatti in librerie dual-indicizzati attraverso un semplice processo tagmentation. Successivamente le librerie sono in sequenza su un banco di nuova generazione sequencer e il sequenziamento letture sono mappati in silico convertito sequenza di riferimento e cento metilazione della citosina di è determinata in modo specifico-base. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig2highres.jpg" /> Figura 2:. In silico conversione bisolfito di regione di interesse Tutte le regioni di interesse da ogni riferimento genomico può essere Selected per la conversione in silico bisolfito. Cytosines non-CpG sono sostituiti con timina nella sequenza di riferimento. Cytosines CpG restano cytosines del bisolfito convertiti riferimento. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig3highres.jpg" /> Figura 3:. Primer placement Primer bisolfito PCR sono progettati contro una in silico bisolfito convertito sequenza di riferimento. Primer devono essere progettati in modo che non si sovrappongano dinucleotidi CG o progettati adiacente dinucleotidi CG. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig4highres.jpg" /> Figura 4: Esempi di ampliconi alti e poveri PCR qualità e le librerie di sequenziamento elettroferogramma tracce rappresentative e gel spettacolo (A) amplicone ideale per la generazione biblioteca transposome mediata con una sola alta.Prodotto concentrazione. (B) Biblioteca generata da questo amplicon mostra elevata concentrazione e la distribuzione, anche le dimensioni. (C) scarso ampliconi della PCR qualità possono essere bassi in termini di dimensioni, la concentrazione, e contengono più prodotti e / o dimeri di primer. Questi ampliconi di scarsa qualità porterà a (D) fallito generazione biblioteca a bassa concentrazione e la distribuzione bassa dimensione. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig5highres.jpg" /> Figura 5: Esempi di uscite di sequenziamento di controlli metilazione. (A) In silico convertito sequenziamento di riferimento con i siti CpG evidenziata in rosso. 0% di controllo metilazione mappato legge alla regione mostrando timina selezionati (avidità evidenziare) mappatura a siti CpG. Di controllo (B) 100% metilazione mappato legge mostra (blu highlight) mappatura di citosina in siti CpG. Figura 6:. Quantificazione metilazione in una serie di controlli di metilazione dell&#39;intero genoma controlli metilazione mescolato a rapporti di metilazione (n = 3 / ratio) da 0% a 100% sono stati quantificati con BSAS. Tracciamento quantificazione del previsto contro quantificata dimostra linearità del controllo metilazione quantificazione. Attraverso tutti i controlli, si è ad alta precisione in metilazione quantificazione. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig7highres.jpg" /> Figura 7: Esempio di abbinato metilazione del DNA ed espressione genica analisi da campioni di tessuto. (A) Rhodopsin espressione di mRNA relativa dal topo cerebellare e tessuto retinico. (B) Rhodopsin metilazione media promotore quantificato da BSAS tra cerebellare e il DNA della retina (*** p &lt;0.001, parametrico t-test). &lt;strong&gt; livelli di metilazione C) sito-specifica CpG tutto promotore rodopsina (-244 a +6, rispetto al sito di inizio della trascrizione [TSS]) nel topo cervelletto e DNA retina.

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Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.

Targeted DNA metilazione Analisi per sequenziamento di prossima generazione

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

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Research

JoVE Journal

Biology

36.8K Views.  University of Oklahoma College of Medicine. Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.