Stabilire questo modello di topo umanizzato può aiutare negli studi preclinici sulla ricerca sull'HIV. Ad esempio, è possibile valutare sia diversi ceppi virali che nuovi interventi sull'HIV. Questi protocolli possono essere utilizzati per valutare lo stato della variante CCR5 del donatore di cellule staminali e per infettare in modo efficiente i topi umanizzati con HIV e per quantificare i carichi virali del plasma di topo.
Il protocollo di quantificazione dell'RNA può essere facilmente adattato per quantificare qualsiasi sequenza di RNA virale di scelta rilevabile nei campioni di plasma. Per lo screening genetico di campioni di sangue del cordone ombelicale per le varianti CCR5 delta 32, incubare 1,25 microlitri di flusso non pelletato con 11,25 microlitri di miscela PCR contenenti 200 mix di dNTP micromolare, 0,01 unità per microlitro di DNA polimerasi ad alta fedeltà e primer avanti e indietro come descritto nella tabella. Regolare il volume con acqua priva di nucleasi a circa 12,5 microlitri per ogni reazione PCR e amplificare i frammenti genomici con il programma di ciclismo PCR come indicato nella tabella.
Al termine della reazione, separare i prodotti PCR su un gel di agarosio al 2%. I prodotti PCR degli alleli di tipo selvaggio e gli alleli delta 32 producono frammenti PCR rispettivamente di 196 coppie di basi e 164 coppie di basi, rendendo le bande facilmente distinguibili per elettroforesi in gel. Per l'esposizione all'HIV intravaginale, posizionare una lampada riscaldante focalizzata sul centro dello spazio di lavoro in cui si trova il mouse e posizionare punte sterili di pipetta da 20 microliter in una pipetta appropriata nel cofano.
Posizionare un contenitore con disinfettante liquido nella cappa per l'inattivazione immediata di tutti i materiali e liquidi che sono stati a contatto con il virus. Posizionare il mouse anestetizzato su un cuscinetto blu sterile nella posizione supina sotto la lampada con la coda del mouse rivolta verso la parte posteriore del cappuccio e confermare la mancanza di risposta al riflesso del pedale nel mouse. Afferrare l'animale alla base della coda.
Sollevando delicatamente il mouse dalla base della coda, sostenere l'animale in posizione verticale capovolta. Utilizzare una punta sterile per stimolare l'area genitale con un delicato accarezzare verso l'ano per indurre lo svuotamento del retto e alleviare la pressione sulla vagina. Per esporre l'apertura vaginale, avvolgere con cura la coda del mouse sulle dita, in modo che la vulva si apra naturalmente.
Utilizzando una nuova punta di pipetta, posizionare la punta a livello dell'apertura vaginale e rilasciare atraumaticamente 20 microlitri del virus nella vagina, consentendo alla gravità di tirare la sospensione virale nella vagina. Una volta che tutto il virus è stato consegnato, conservare il mouse in questa posizione per cinque minuti per evitare perdite indotte dalla gravità del virus. Quindi, riportare con attenzione il mouse nella sua gabbia di casa in posizione supina e monitorare fino al completo recupero.
Per isolare l'RNA dai campioni di plasma di topo scongelati, utilizzare un kit di isolamento dell'RNA virale secondo le istruzioni del produttore. Aggiungere il campione che si lega alla colonna e aggiungere una fase di trattamento della DNasi su colonna per garantire la rimozione di tutto il DNA all'interno del campione plasmatico. Quindi conservare i campioni di RNA a 80 gradi Celsius per almeno un'ora.
Per sintetizzare il cDNA, utilizzare la transcriptasi inversa secondo i protocolli standard, inclusi 0,5 microlitri di un inibitore della RNasi all'interno della reazione cDNA per evitare la degradazione dell'RNA, quindi eseguire la sintesi cDNA come descritto nella tabella e conservare i campioni di cDNA a 80 gradi Celsius per almeno un'ora. Per preparare i campioni per ddPCR, mescolare 11 microlitri di miscela di reazione della sonda ddPCR contenente polimerasi e dNTP con 250 nanomolari di sonda legante a scanalatura minore e 900 nanomolari di ciascuno dei primer avanti e indietro, come indicato nella tabella. Aggiungere tre microlitri di ogni campione di cDNA e regolare i volumi totali di PCR a 22 microlitri con acqua priva di nucleasi.
Utilizzare olio di generazione di goccioline per sonde su un generatore di goccioline secondo il protocollo del produttore per emulsionare le miscele PCR. Quindi eseguire il programma PCR come descritto nella tabella. Per il trattamento cART dopo l'infezione da HIV confermata, nutrire i topi con pellet preparati da un fornitore esterno contenente un regime cART standard, come indicato nella tabella.
Usa una dieta cART di colore rosso per distinguerlo facilmente dal normale chow di topo e usa una dieta di controllo chow senza cART in un colore marrone standard. Per l'inizio del trattamento, posizionare la dieta chow contenente cART in gabbie sterili prima di trasferire i topi dalla vecchia gabbia alla nuova gabbia. Quindi monitorare i pesi dei topi e controllare il consumo di chow contenente cART ogni giorno per assicurarsi che i topi si adattino al cambiamento.
Qui viene descritta la strategia di gating citometrica del flusso per l'analisi della purezza delle cellule staminali, con la purezza delle cellule staminali positive isolate CD34 che in genere vanno dall'85 al 95% con una contaminazione cellulare inferiore all'1%T. L'analisi PCR dimostra lo stato variante CCR5 delle cellule staminali donatrici purificate, rendendo facilmente identificabili i donatori eterozigoti CCR5 delta 32. La frequenza del genotipo mutante in un gruppo di 19 donatori era di circa il 15,8% in accordo con studi epidemiologici più grandi sulle popolazioni scandinave.
Da tre a cinque mesi dopo il trasferimento adottivo di 7,5 volte 10 alla 4a cellule positive del CD45 umano nei topi riceventi, dal 20 al 50% dei globuli bianchi recuperati da campioni di sangue periferico animale ricevente sono cellule positive CD45 umane e i topi avranno sviluppato cellule B e T umane. Il 64% dei topi viene infettato dall'HIV a seguito dell'esposizione vaginale come dimostrato. Quattro settimane dopo il passaggio a una dieta di 40 giorni contenente cART standard, i carichi virali nei topi sieropositivi diminuiscono al di sotto del limite di rilevamento.
Dopo la cessazione della dieta, il virus rimbalza, rispecchiando i dati clinici. È importante sottolineare che i topi su cART tollerano bene il cambiamento nella dieta. È fondamentale ricordare che questi animali sono immunodifesa e quindi vulnerabili all'ambiente.
L'adesione alle tecniche asettiche aumenterà la salute generale degli animali e il successo del protocollo. Dopo l'istituzione della coorte di topi umanizzata per l'infezione da HIV, il protocollo può essere adattato per la quantificazione dell'RNA virale nei tessuti o per testare nuovi interventi in diversi ceppi virali. La flessibilità e l'accessibilità dei topi umanizzati per gli studi sulle infezioni da HIV hanno permesso progressi critici nella virologia, nell'immunologia e nella ricerca terapeutica dell'HIV.
Prima di tentare protocolli riguardanti l'HIV infettivo, assicurarsi di ottenere l'approvazione dei funzionari locali dell'ambiente di lavoro e di aderire alle procedure di decontaminazione approvate.
