Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del biopesticida, come come l'espressione genica di impatto dell'RNA a doppio filamento e la fecondità nei ditteri adulti. Il vantaggio principale di questa tecnica è che dosi quantificabili di RNA a doppio filamento vengono consegnate alla zanzara o alla mosca, e quindi possono essere valutati gli effetti risultanti sulla letalità multigenerazionale. Sebbene questo metodo sia presentato per la zanzara, le aedes aegypti e la mosca domestica, musca domestica, può essere applicato anche ad altre specie di zanzare e mosche.
Generalmente, gli individui nuovi a questo metodo avranno difficoltà, perché padroneggiare la procedura di iniezione stessa è un investimento nel tempo. Iniettare ogni insetto con la dimensione ottimale della punta dell'ago è fondamentale per garantire il parto riducendo al minimo le lesioni e la mortalità. Per iniziare, usa le forcep per montare attentamente le zanzare in modo che alla fine siano esposte su un microscopio che scivola a circa mezzo centimetro di distanza l'una dall'altra.
Per aiutare la gestione delle diapositive, lasciare uno spazio da uno a un centimetro e mezzo all'estremità sinistra o destra della diapositiva. Quindi posizionare lo scivolo di insetti messi in scena a quattro gradi Celsius in una grande piastra di Petri. Impostare un microscopio sezionato e un microiniettore su un tavolo freddo.
Dopo aver tirato i capillari di vetro su una punta fine, posizionare l'ago capillare nel microiniettore e rompere la punta dell'ago con pini. Quindi sciacquare l'ago tirando ed espellendo l'acqua priva di nucleasi tre volte. Si noti che le dimensioni di apertura dell'ago di vetro variano tra zanzare e mosche della casa.
Quindi, preparare una soluzione di iniezione con una concentrazione appropriata per le zanzare. Aggiungere tre microgrammi per millilitro di Rodamina B alla soluzione per aiutare nella visualizzazione. Utilizzare una pipetta per trasferire da tre a quattro microlitri di soluzione su una superficie pulita e disegnarla nell'ago di vetro senza prendere aria.
Premere ripetutamente il pulsante di iniezione fino a quando il liquido inizia a erogare dall'ago. Usa un marcatore a punto ultra fine per disegnare segni di hash a circa un millimetro di distanza l'uno dall'altro, a partire dal menisco liquido al gambo dell'ago. Impostare lo scivolo delle zanzare sotto l'ago e assicurarsi che il campo visivo sia abbastanza largo da vedere la soluzione menisco nell'ago.
Allineare l'ago con il mezzo di un terzo dello sterno mesocarape. Rinforzare la zanzara contro l'ago con pinza posizionata sul lato opposto della zanzara e forare delicatamente la cuticola con la punta dell'ago. Far scorrere delicatamente l'ago nella zanzara fino a quando la punta non è passata attraverso la linea mediana.
Premere il pulsante di iniezione fino a quando non è stata iniettata la quantità desiderata di liquido. Se il menisco non si muove, fai scorrere lentamente la zanzara o vola via dall'ago mentre guardi il movimento del menisco. Se una parte della soluzione iniettata esce dalla cuticola dopo la rimozione dell'ago o se il menisco non riesce a muoversi, scartare l'insetto poiché l'iniezione non ha avuto successo.
Sulla mosca della casa, allineare l'ago con il mesopleurone. Rinforzare la mosca contro l'ago con pini posizionati sul lato opposto della mosca e forare delicatamente la cuticola con la punta dell'ago. Trasferire gli insetti iniettati per cancellare tazze da 3,5 oncia in gruppi da dieci a 15.
Quindi coprire la tazza con la rete e consentire loro di recuperare a temperatura ambiente. Dopo che gli insetti si sono ripresi, invertire la tazza di tenuta su un batuffolo di cotone imbevuto di soluzione di saccarosio al 10%. In primo luogo, riempire una membrana artificiale da 12 pollici con sangue fresco e scaldarla a 60 gradi Celsius in un bagno di acqua calda.
Asciugare la membrana con un tovagliolo di carta e appoggiarla sul tappo di rete della tazza di tenuta. Dopo che le zanzare si nutrono, sostituire il batuffolo di cotone e lasciare riposare le zanzare per 24 ore. Successivamente, costruire tazze di ovideposizione riempiendo tazze di acetato bio da 3,5 once chiare con circa 30 millimetri di acqua deionizzata.
Quindi posizionare un pezzo di carta germinazione del seme nella parte inferiore della tazza. Coprire la tazza con la rete e tagliare una piccola fessura nel tappo di rete. 24 ore dopo l'alimentazione, tagliare una piccola fessura nel cappuccio della tazza di tenuta e trasferire le femmine che si sono nutrite con successo a tazze di ovideposizione.
Quindi sigillare la piccola fessura nel tappo di ovideposizione con un batuffolo di cotone saturo di saccarosio al 10%. Monitora le zanzare e monitora la mortalità giornaliera. Dopo aver permesso alle zanzare di ovoposit per cinque o sette giorni, contare le uova al microscopio sezionato.
A dimostrare la procedura sarà il Dr.Christopher Geden, un entomologo di ricerca USDA ARS. Tre giorni dopo l'iniezione, anestetizza le mosche con anidride carbonica. Quindi trasferisci le mosche in una gabbia pulita con acqua e dieta a mosca preparata.
Registra i dati sulla mortalità e rimuovi le mosche morte ogni giorno. Successivamente, mescolare il 75% di crusca di grano con il 25% di mangime vivo pelletato in peso per preparare il mezzo di allevamento larvale. Aggiungere acqua alla miscela fino a raggiungere il 62% di umidità.
Aggiungere la crusca di grano inumidito miscela di mangime per animali vivi in un quadrato di stoffa nera e arrotolarla in una palla. Utilizzare un elastico per mantenere il panno in posizione e spremere delicatamente fino a quando il mezzo liquido non scorre. Mettere la palla in una tazza da 60 millilitri e posizionarla nella gabbia di mosca per cinque ore.
Dopo questo, sciacquare le uova dalla palla, assicurandosi che le uova siano rimosse da sotto le pieghe del panno. Agitare le uova per interrompere eventuali grappoli e trasferirle in un tubo di centrifuga graduato da 20 millilitri. Lasciare depositare le uova e notare il volume delle uova depositate nel tubo.
Quindi aggiungere acqua sufficiente per portare il volume a 20 volte il volume delle uova sistemate. Successivamente, utilizzare una barra di agitazione magnetica per mescolare l'acqua e la sospensione delle uova. Infine, utilizzare una punta di pipetta modificata per erogare 0,5 millilitri della sospensione su un pezzo di stoffa nera pre-inumidita in una serie di linee.
In questo protocollo, le zanzare femminili sono state micro-iniettate per valutare l'espressione genica. L'iniezione di femmine con RNA a doppio filamento ha mostrato una significativa riduzione dell'espressione relativa attraverso cicli di ovideposizione multipli. Le dimensioni medie delle frizioni nelle zanzare nel primo ciclo gonotrofico sono state significativamente ridotte sia per i gruppi trattati con dsRPS6 che dsRPL26.
Un evidente effetto dose è stato osservato nelle dimensioni della frizione quando si inietta dsRPS6 da un microgrammo a 50 nanogrammi nelle zanzare femminili. Le mosche della casa sono state anche iniettate con cinque microgrammi di costrutti di RNA a doppio filamento. Simile alle osservazioni delle zanzare, è stata notata una significativa riduzione sia dell'espressione di trascrizione specifica che delle dimensioni della frizione.
Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di scartare gli insetti che non sono stati iniettati con successo. Utilizzando questa procedura, qualsiasi costrutto di RNA a doppio filamento o altro biorational può essere consegnato a zanzare o mosche. Non dimenticare che lavorare con aghi di vetro può essere pericoloso e dovrebbero sempre essere smaltiti in appositi contenitori di rifiuti affilati.
