Questo protocollo è un modo molto semplice ed efficiente per rilevare i mutanti generati dalla tecnologia CRISPR / Cas9 da numerosi individui. I due principali vantaggi di questa tecnica sono che può essere fatto in poche ore e che è applicabile a una moltitudine di organismi. La progettazione del primer può essere impegnativa per alcuni geni e possono essere necessari più cicli di progettazione e verifica del primer per rendere efficiente l'HRMA.
Per eseguire una PCR sfumata, iniziare preparando un mix master. Quindi rimuovere 19 microlitri del mix master per il controllo non modello o NTC in una piastra a 96 pozzetti. Quindi, aggiungere il modello al mix master rimanente.
Aliquot 20 microlitri della miscela campione nella piastra a 96 pozzetti. Eseguire la PCR seguendo i parametri ciclici e quindi generare i profili di fusione termica utilizzando i parametri menzionati nel manoscritto. Dopo aver raccolto tutto il materiale richiesto, preparare una miscela principale con 0,5 microlitri del reagente di rilascio del DNA e 20 microlitri di tampone di diluizione per individuo da genotipizzare.
Utilizzando un pipetto multicanale, aliquota 20 microlitri della miscela in una piastra PCR e lasciare la piastra PCR sul ghiaccio. Quindi, posizionare le zanzare G1 anestetizzate in una capsula di Petri di vetro per tenerle sedate e posizionare otto zanzare selvatiche nella seconda capsula di Petri. Pulire un paio di pinzette con etanolo al 70% e utilizzare le pinzette disinfettate per rimuovere una delle zampe posteriori delle zanzare.
Quindi, immergere la gamba nella soluzione di reagente di rilascio del DNA. Posizionare la zanzara nella fiala corrispondente e chiudere la fiala con una spugna. Una volta fatto, pulire le pinzette con etanolo al 70% prima di procedere con la rimozione della gamba dalla zanzara successiva fino a quando la piastra a 96 pozzetti non è completata.
Successivamente, sigillare la piastra con un sigillo ottico della piastra PCR e incubare la piastra PCR contenente le gambe a temperatura ambiente per due-cinque minuti, seguita dall'incubazione a 98 gradi Celsius per due minuti. Lasciare raffreddare la piastra a temperatura ambiente. Per la PCR, preparare una miscela master contenente i componenti preferiti e quindi utilizzare una pipetta multicanale per trasferire 19 microlitri della miscela master in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti.
Dopo aver trasferito un microlitro della soluzione di rilascio del DNA contenente DNA di zanzara precedentemente preparato sulla piastra, sigillare la piastra con un sigillo ottico della piastra PCR. Eseguire la PCR con gli opportuni parametri ciclici per generare profili termici di fusione seguendo i parametri descritti nel manoscritto, quindi esaminare i profili di fusione assegnando il controllo wild-type al cluster di riferimento. Contrassegnare i diversi cluster con i colori corrispondenti sul modello a 96 pozzetti.
Quindi, selezionare gli individui con curve di interesse e rimuovere gli individui selezionati dai tubi da incrociare. Il sangue nutre le femmine fatte, seguito dalla raccolta di G2A. Nell'analisi rappresentativa, viene mostrata l'analisi di sequenza del mutante ZIP11 di Aedes aegypti.
L'elettroferogramma di mutanti eterozigoti Aedes aegypti ZIP11 ha indicato la posizione nucleotidica in cui si è verificato l'indel. L'indel è rappresentato da uno spostamento da picchi singoli a doppi poiché le posizioni polimorfiche mostrano entrambi i nucleotidi contemporaneamente. Al termine dell'esecuzione, il numero di coppie di basi eliminate o inserite è stato calcolato contando i singoli picchi.
Le zanzare contenenti mutazioni nei geni Aedes aegypti ZIP11 e myo-fem sono state genotipizzate e sequenziate verificate utilizzando l'analisi del fuso ad alta risoluzione di HRMA. I segnali fluorescenti dei campioni sono stati normalizzati a valori relativi da uno a zero. Inoltre, ogni curva è stata sottratta dal riferimento wild-type e ha indicato l'ingrandimento corrispondente.
Un'assegnazione automatica del cluster non riuscita viene mostrata nei risultati rappresentativi, in cui non è stata fatta una distinzione adeguata tra i gruppi. Inoltre, ogni campione è stato analizzato individualmente e assegnato ai gruppi corretti in base alla somiglianza con campioni di riferimento di eterozigoti, omozigoti e transeterozigoti. Dopo aver eseguito gli HRMA, è necessario sequenziare il DNA dagli individui mutati per analizzare gli indel e identificare le altre mutazioni nella sequenza mirata.
