RNAi mediato silenziamento genico nelle zanzare richiede una preparazione preventiva e la purificazione della dsRNAs specifici che colpiscono il gene di interesse. Per la sintesi di dsRNA, si consiglia il kit Megascript Ambion che si avvale di un RNA polimerasi T7-mediata reazione di trascrizione in vitro. Per la purificazione dsRNA, si consiglia il kit Qiagen RNeasy. Campioni di dsRNA devono essere quantificati e regolata a 3 g / mL in acqua. Altri materiali è necessario includere: punta fine pinze, vetrino, aghi di vetro microcapillare, microinjector (usiamo Drummond Nanoject II), un microscopio ottico montato sopra un blocco freddo, una coperta piatto di vetro Petri, asciugamani di carta e un secchio di ghiaccio . Sarà inoltre necessario un modo per raccogliere le zanzare e un contenitore adeguato per loro insieme a una fonte di cibo come il batuffolo di cotone imbevuto di 10% di saccarosio. <ol><li> Raccogliere i vostri zanzare. Usando una batteria aspiratore, raccogliere le zanzare si vuole iniettare. Inserire l&#39;ugello con un tovagliolo di carta o cotone per cui non può sfuggire zanzare e rimuovere il serbatoio. Dal momento che temperature fredde anestetizzare le zanzare, seppellire il serbatoio in un secchio di ghiaccio e aspettare 5-10 minuti per le zanzare a smettere di muoversi. Anestesia può essere ottenuto anche mettendo il serbatoio in una stanza fredda o frigorifero o utilizzando CO 2. Durante questi 5-10 minuti, passare alla fase successiva. </li><li> Preparare l&#39;area di lavoro. Impostare un blocco piatta superficie fredda a 2 ° C e mettere un vetrino su di esso. Questo è dove le zanzare si riposerà come li iniettare. Inserire un ago di vetro sul microinjector e utilizzare il forcipe per rompere la punta dell&#39;ago alla larghezza desiderata. E &#39;importante che la larghezza è abbastanza grande per lasciare spazio sufficiente per liquido di fluire attraverso a un tasso ragionevole, ma è abbastanza stretto per infliggere una ferita minima durante l&#39;iniezione. Una punta dell&#39;ago bene sarà abbastanza stretto da piegare leggermente ma non si rompe. Impostare la vostra attrezzatura di iniezione per il volume di uscita desiderato (per RNAi, usiamo 69 nL). Immergere la punta del ago nella campione e disegnare il campione liquido nel ago utilizzando le istruzioni del produttore. Il campione di liquido può essere una soluzione dsRNA, sospensione batterica, o altro, il processo di iniezione è lo stesso per tutti. Incorpora un piatto di vetro Petri nel secchiello del ghiaccio in modo che il fondo del piatto è completamente contatto con il ghiaccio. Questo è dove si metteranno le zanzare finché non si è pronti a iniettare loro. </li><li> Preparare il zanzare. Transfer 50-100 zanzare dal serbatoio al piatto di vetro Petri. Usa la tua pinza sottile per loro di un unico strato, assicurandosi la maggior parte hanno contatto con il fondo del piatto freddo per tenerli anestetizzati. Coprire queste zanzare con il piatto coperchio quando non in uso. Riportare il serbatoio per il contenitore del ghiaccio per mantenere il resto delle zanzare anestetizzato. </li><li> Montare le zanzare sul blocco freddo. Usa la tua punta fine pinze per trasferire le zanzare uno alla volta dal piatto al vetrino montato sul blocco freddo sotto il microscopio ottico. Gestire le zanzare con delicatezza, preferibilmente entro le gambe. Line up fino a 30 zanzare fianco a fianco sul vetrino, facendo attenzione si può arrivare a ognuno con la microinjector e assicurandosi che ognuno entra in contatto con la diapositiva freddo. Assicurati che il tuo zanzare sono allineate in modo ordinato, che come si va avanti si sa che hanno e che non sono state iniettate. Lascia altre zanzare coperto il piatto freddo Petri. </li><li> Iniettare il primo gruppo di zanzare. Tenere il forcipe punta a punta fine in una mano e tenere la microinjector nell&#39;altra mano come una matita. Utilizzare le pinze per spostare la zanzara di cui hai bisogno (gestirli per le gambe per evitare ferite) e di mantenere la zanzara costante durante l&#39;iniezione. Questo funziona meglio se si utilizza il forcipe per supportare un lato della zanzara durante l&#39;iniezione dalla parte opposta. Inserire con attenzione solo la punta ago nel torace zanzara. E &#39;meglio per iniettare in una parte ancora tesa sottile della cuticola per minimizzare il danno. Inoltre, evitare di iniettare troppo profondamente, si vuole solo la punta di essere all&#39;interno del torace; più iniezioni di causa maggiore ferite che compromette la sopravvivenza. Una volta che la punta dell&#39;ago è in posizione, premere e rilasciare il pedale dell&#39;apparato microinjector che consegnerà il vostro volume preimpostato di dsRNA. Aspetta un secondo o due e togliere l&#39;ago dalla zanzara. Se una goccia di liquido appare al di fuori della ferita, attendere qualche secondo per essere assorbiti nella ferita. Se non assorbe in pochi secondi, scartare tale zanzara e riprovare. Continua il processo di iniezione per tutti zanzare sul vetrino. </li><li> Memorizzare le zanzare. Quando hai finito, inserire il vostro zanzare iniettato all&#39;interno di contenitori etichettati (noi preferiamo 1 pinta di cera alberato bicchieri di carta coperta damaglia metallica e fissato con elastici e un coperchio di cartone). </li><li> Continuare le iniezioni fino al termine. Continuare a posto le zanzare sul vetrino, iniettare e trasferimento in tazze fino ad avere la dimensione del campione che si desidera. Conto di alcune morti per principianti avrà molte zanzare muoiono per il trauma della iniezione. Ciò permetterà di migliorare con la pratica fino a quasi il 100% della vostra zanzare sopravvivono iniezione. </li><li> Al termine, mettere un piegata, asciugamano bagnato di carta sopra la coppa insieme a una fonte di cibo e coprire le tazze con qualcosa per trattenere l&#39;umidità, come involucro di plastica o un coperchio di plastica Petri. Zanzare iniettato sono inclini a seccarsi così l&#39;umidità fornita dal asciugamano bagnato e mantenuto dalla plastica contribuisce a prevenire questo. </li><li> Inserire il vostro zanzare in una camera ambiente controllato per l&#39;incubazione. </li></ol> Nota: L&#39;efficienza del silenziamento genico è altamente variabile e dipende da una serie di fattori tra cui trascrizione e proteine ​​tassi di turn-over, e l&#39;efficienza dsRNA assorbimento da parte delle cellule e organi. Abbiamo scoperto che il silenziamento inizia già dal 1 ° giorno dopo l&#39;iniezione, e può durare fino a 6 giorni dopo l&#39;iniezione. Utilizzare metodi di rilevamento trascrizione e proteine, come la PCR quantitativa e Western blotting per convalidare tacere. Nota: Ci sono parecchie variazioni su diverse fasi di iniezione zanzara e RNAi mediato tecnica di silenziamento genico. Alcune varianti sono descritti da: Boisson, et al (2006) e Blandin, et al (2002)...

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	<li>Boisson, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> , (2006).</li><li>Blandin, ., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> , (2002).</li></ol>

Efficienza del silenziamento genico è altamente variabile e dipende da una serie di fattori tra cui trascrizione e proteine ​​turn-over tassi ed efficienza dsRNA assorbimento da parte delle cellule e organi. Abbiamo scoperto che il silenziamento inizia già dopo 1 iniezione al giorno e può durare fino a 6 giorni dopo l&#39;iniezione. Utilizzare metodi di rilevamento trascrizione e proteine, come la PCR quantitativa e Western blotting per convalidare tacere.

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		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
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		<tbody>
		
<tr>
<td>Megascript</td>
<td>kit</td>
<td>Ambion</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>for dsRNA synthesis; T7 RNA polymerase-mediated in vitro transcription reaction</td>
</tr>
<tr>
<td>RNeasy</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>For dsRNA purification</td>
</tr>
<tr>
<td>dsRNA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>should be quantified and adjusted to 3 &#x03BC;g/ &#x03BC;L in water</td>
</tr>
<tr>
<td>fine-tipped forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>glass slide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>glass microcapillary needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>microinjector</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Drummond</td>
<td>Nanoject II</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>light microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>mounted above a cold block</td>
</tr>
<tr>
<td>Petri dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>covered, glass</td>
</tr>
<tr>
<td>paper towels</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10% sucrose</td>
<td>food</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>A. gambiae</td>
<td>Animal</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>mosquitos</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
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protocol for rnai assays in adult mosquitoes (a. gambiae)

Reverse approcci genetici si sono dimostrati estremamente utili per determinare quali geni di resistenza agli agenti patogeni sottostanti vettore nelle zanzare. Questo protocollo video illustra un metodo utilizzato dal laboratorio Dimopoulos per iniettare dsRNA in zanzare Anopheles gambiae, che ospitano il parassita della malaria. La tecnica di manipolare la configurazione di iniezione e iniezione di dsRNA nel torace è illustrato.

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Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes A. gambiae

Protocollo per saggi RNAi in zanzare adulte (A. gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

protocol-for-rnai-assays-in-adult-mosquitoes-a-gambiae

Research

JoVE Journal

Biology

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

12.5K Views.  Johns Hopkins University. Reverse approcci genetici si sono dimostrati estremamente utili per determinare quali geni di resistenza agli agenti patogeni sottostanti vettore nelle zanzare. Questo protocollo video illustra un metodo utilizzato dal laboratorio Dimopoulos per iniettare dsRNA in zanzare Anopheles gambiae, che ospitano il parassita della malaria. La tecnica di manipolare la configurazione di iniezione e iniezione di dsRNA nel torace è illustrato.