Gli autori ringraziano Victoria Carpenter per i suoi commenti critici di questo protocollo.

Parte I - RNAi-mediato knockdown gene in adulti zanzare Aedes aegypti. Esperimento per una panoramica si veda la Figura 1. 1. dsRNA Sintesi <ol><li> Sintetizzare dsRNA specifici contro i geni di dsRNA di interesse e di controllo. Nota: Si consiglia di primer di sviluppo per frammenti PCR nell&#39;intervallo di 300 a 500 coppie di basi situate all&#39;estremità 3 &#39;del cDNA specifico 2 e con la sequenza del primer T7 attaccata all&#39;estremità 5&#39; (5&#39;-TAC TAA GAC TCA CTA TAG GG-3 &#39;). Unicità dei frammenti deve essere confermata da analisi BLASTN 3. </li><li> Utilizzare il Ambion Megascript T7 alta Kit Trascrizione Yield (Ambion, tabella dei reagenti) che utilizza T7 RNA polimerasi per la reazione di trascrizione di sintetizzare dsRNA. Nota: i reagenti e kit simili sono disponibili altrove. </li><li> Per purificare dsRNA, precipitato con cloruro di litio seguendo le istruzioni fornite con il kit Megascript. </li><li> Dopo purificatione, sciogliere il precipitato dsRNA in acqua sterile. Per assicurare un&#39;adeguata viscosità per microiniezione, la concentrazione di dsRNA non deve superare 2 pg / pl. </li></ol> 2. Iniezione di preparazione <ol><li> Un semplice micro iniettore può essere costruito utilizzando tubi, forbici, un ago metallico, una siringa da 1 ml e 1 ml di plastica punta di pipetta (vedi Figura 2). Il tubo deve essere tagliato a ~ 40 cm di lunghezza. In alternativa, un sistema automatico micro iniettore può essere utilizzato come Drummond Nanojet II 4. <ol><li> Tagliare la punta della siringa (mozzo dell&#39;ago) a segno 2 ml di scala e rimuovere la testa dello stantuffo di gomma lo stantuffo. </li><li> Punch un buco con un ago metallico nella testa stantuffo in gomma e luogo la testa in gomma stantuffo nel mozzo dell&#39;ago. </li><li> Posizionare il mozzo dell&#39;ago in un&#39;estremità del tubo e inserire una punta di plastica 1 ml pipetta l&#39;altra estremità, che verrà utilizzato come il boccaglio (in alternativa, uno ml 10 SYRinge può essere utilizzato per produrre la pressione necessaria per iniezione). </li></ol></li><li> Inserire un ago capillare di vetro nel foro nella testa gomma stantuffo e rompere la punta dell&#39;ago off modo che la larghezza è abbastanza grande per liquido di fluire attraverso. Nota: La dimensione ottimale della punta dell&#39;ago deve essere determinato empiricamente - se la larghezza dell&#39;ago è troppo grande questo si tradurrà in trauma e un alto tasso di mortalità zanzara, se la larghezza è troppo piccola dell&#39;ago, sarà impossibile penetrare l&#39;esoscheletro zanzara. </li><li> Immergere l&#39;ago per iniezioni nel campione dsRNA preparato e prelevare il campione di liquido nella ago per l&#39;iniezione aspirando il liquido con il boccaglio (o una siringa). Nota: Questo passo è identico per tutti i reagenti liquidi che vengono iniettate zanzare, compresi tampone PBS, che viene usato nel protocollo del test in vivo diuresi (vedi sotto). </li></ol> 3. Raccogliere e Anestetizzare zanzare <ol><li> Collect zanzare con un aspiratore a batteria in una fiala di raccolta. Mettere un coperchio sopra la fiala di raccolta e posizionare il flacone su una superficie pulita CO 2 pad per anestetizzare le zanzare. Nota: in alternativa le zanzare possono essere anestetizzati su ghiaccio. </li></ol> 4. Mosquito iniezione <ol><li> Aprire la fiala di raccolta e posizionare le zanzare direttamente sul CO 2 pad e attendere che le zanzare sono anestetizzati. </li><li> Eliminare tutti i maschi. </li><li> Allineare le zanzare sul lato per consentire un accesso più facile per l&#39;iniezione. </li><li> Prendete le zanzare per le gambe o le ali per evitare lesioni. È inoltre possibile utilizzare un pennello fine o piuma di manipolare le zanzare. </li><li> Quando è possibile iniettare la zanzara prima, delicatamente sostenere un lato del torace con la pinza e inserire la punta dell&#39;ago nell&#39;altro lato del torace (Figura 2). E &#39;meglio iniettare in una porzione sottile della cuticola e non spingere l&#39;agoO in profondità nel torace. </li><li> Una volta che l&#39;ago è in posizione, soffiare il liquido nella zanzara. La quantità desiderata può essere determinata monitorando il menisco del liquido in dell&#39;ago. Il numero di millimetro necessarie per un volume specifico può essere determinata calcolando il volume del cilindro dell&#39;ago capillare di vetro (πr 2 h). La quantità efficace di dsRNA che viene tipicamente utilizzato per l&#39;iniezione è 1 ug. </li><li> Una volta che il liquido viene iniettato in zanzara, accuratamente ritrarre l&#39;ago. Se un grande forme liquide goccioline all&#39;esterno del torace, la zanzara deve essere scartato. Poi, ripetere questo processo con la zanzara successiva. </li></ol> 5. Mosquito di recupero e conservazione <ol><li> Dopo l&#39;iniezione, collocare le zanzare in un contenitore per la conservazione. Per esempio, una cera pinta allineati tazze di cartone (coppe zuppa) con maglia rivestimento fissato con il coperchio di cartone. Il coperchio ha una porzione ritagliata per la maglia che copre da esporre. Una volta che tutto il mosquitoes vengono inseriti nel contenitore, posizionare il contenitore in una camera ambiente controllato per incubazione e fornire le zanzare con una fonte di cibo, ad esempio 20% saccarosio batuffoli di cotone imbevuto poste sulla parte superiore del rivestimento maglia. Prima di eseguire il test in vivo diuresi, privare i dsRNA-iniettati zanzare di una sorgente di acqua per 12 ore per standardizzare lo stato di idratazione di ogni zanzara. </li><li> L&#39;efficienza di dsRNA-mediata knockdown gene può essere variabile. Silenziamento genico può iniziare 1 giorno dopo l&#39;iniezione e potrebbe durare fino a 6 giorni dopo l&#39;iniezione 4. Il tempo ottimale per raggiungere la massima knockdown gene deve essere determinati empiricamente per ogni gene utilizzato. In generale, noi aspettiamo 3 giorni dopo l&#39;iniezione di dsRNA prima di procedere. </li></ol> Parte II - In diuresi test in vivo in pazienti adulti zanzare Aedes aegypti Nota: Questo protocollo è stato sviluppato dagli autori eutilizzato per la RNAi-mediato delle proteine ​​knockdown acquaporina nella febbre gialla zanzara Aedes aegypti 1. Per evitare variabilità tra le singole zanzare, zanzare dovrebbero essere analizzati in gruppi. Per motivi tecnici, si consiglia di gruppi di 5 zanzare per il trattamento - non vi è una quantità limitata di tempo per eseguire la prima misurazione del peso prima di zanzare cominciano a espellere l&#39;urina dopo l&#39;iniezione. 6. Raccogliere e Anestetizzare zanzare <ol><li> Prima della raccolta delle zanzare, registrare il peso di una fiala di raccolta vuoto con un cappuccio con una bilancia analitica precisione. Questa fiala verrà utilizzato per tutte le misurazioni successive. </li><li> Raccogli 5 zanzare femmine nella fiala di raccolta pesato con un aspiratore. Mettere il coperchio sopra la fiala di raccolta e lasciare riposare sul CO 2 pad per alcuni secondi per anestetizzare le zanzare. </li></ol> 7. Misurazione del peso iniziale <ol><li> Prendere tsi misura il peso iniziale delle zanzare 5 ponendo la provetta di raccolta contenente le zanzare con il tappo sulla bilancia di precisione. </li><li> Calcolare il peso del gruppo di 5 zanzare prendendo il peso delle zanzare e la fiala di raccolta con tappo e sottraendo il peso del flacone con tappo insieme vuoto. </li><li> Aprire la fiala di raccolta e posizionare le zanzare direttamente sul pad CO 2, dopo aver registrato il peso delle zanzare. Se le zanzare stanno cominciando a svegliarsi durante le misurazioni del peso, impostare la provetta sulla CO 2 pad per alcuni secondi prima di aprirlo e di immissione delle zanzare sul pad. </li></ol> 8. Iniezione di preparazione <ol><li> Impostare l&#39;iniettore micro seguendo le istruzioni riportate nel protocollo di RNAi-mediato gene knockdown. </li><li> Inserire un ago capillare di vetro nell&#39;iniettore micro e rompere la punta dell&#39;ago off modo che la larghezza è abbastanza grande per liquid a fluire attraverso. </li><li> Immergere l&#39;ago in tampone PBS e disegnare il buffer in l&#39;ago di iniezione, l&#39;importo desiderato da utilizzare per questo protocollo è di 1,25 microlitri di PBS per ogni zanzara. Nota: Questo importo imita la quantità media di plasma sanguigno, che è occupato da una zanzara femmina 5. </li></ol> 9. Mosquito iniezione <ol><li> Allineare le zanzare per consentire un più facile accesso con l&#39;iniettore micro. </li><li> Una volta che l&#39;ago è a posto, soffiare tampone PBS nella zanzara. </li><li> Una volta che il liquido viene iniettato nel zanzara, una gocciolina potrebbe formare all&#39;esterno del torace. La goccia deve essere accuratamente rimossa prima del passaggio successivo. </li><li> Ripetere questo processo di iniezione con la zanzara successiva. Con l&#39;esperienza, il tasso di sopravvivenza zanzara sarà quasi del 100% dopo l&#39;iniezione. </li></ol> 10. Le zanzare di pesatura <ol><li> Dopo l&#39;iniezione, delicatamente posizionare le zanzare nella fiala di raccoltae cappuccio. Prendere la prima misurazione del peso dei 5 zanzare ponendo il flacone di raccolta contenente le zanzare con il tappo sulla bilancia di precisione. </li><li> Calcolare il peso del gruppo di 5 zanzare prendendo il peso delle zanzare e la fiala di raccolta con tappo e sottrarre il peso del flacone con tappo insieme vuoto. Nota: le zanzare inizieranno a espellere urine entro 2 minuti dopo la rimozione dalla CO 2 pad l&#39;anestesia, quindi è importante prendere la misura del peso prima di iniziare a espellere. </li><li> Mettere le zanzare in un piccolo contenitore in cui cominceranno a espellere l&#39;urina. </li></ol> 11. Misure secondo peso e successivi Nota: Le misurazioni del peso delle zanzare dovrebbero essere prese in intervalli di 30 minuti, ma questo può essere regolato a intervalli più o meno lunghi a seconda del tassi di escrezione. <ol><li> Dopo 30 minuti, raccogliere il Group su 5 zanzare con un aspiratore nel flaconcino stessa collezione con tappo. Prendere la misura successiva peso delle zanzare ponendo il flacone di raccolta contenente le zanzare con il tappo sulla bilancia di precisione. </li><li> Dopo la misurazione, posizionare le zanzare nel contenitore stessa azienda per i successivi 30 minuti. </li><li> Ripetere questo processo per una quantità di tempo desiderato. </li></ol> 12. Determinazione Mosquito tasso di escrezione <ol><li> La quantità totale di liquido che è stato iniettato nel gruppo di 5 zanzare può essere calcolato sottraendo il peso iniziale delle zanzare dal peso immediatamente dopo l&#39;iniezione. </li><li> La quantità di urina che è stato espulso dal gruppo di zanzare in un punto temporale specifico può essere calcolato sottraendo il peso iniziale delle zanzare dal peso delle zanzare al punto temporale specifico. </li><li> Il tasso di escrezione in un punto temporale specifico può essere calcolato dalla divisioneDing la quantità di urina escreta a questo punto tempo la quantità totale di liquido iniettato (Tabella 1). </li></ol> 13. Risultati rappresentativi RNAi-mediato knockdown genica e la diuresi test in vivo sono stati utilizzati dal laboratorio di Hansen per studiare gli effetti di acquaporine della diuresi zanzara Aedes aegypti. Tre acquaporine che si esprimono in Aedes aegypti Malpighi tubuli sono stati abbattuti con effetti significativi sui tassi di escrezione rispetto al controllo delle zanzare 1. La figura 4 mostra i risultati rappresentativi di un esperimento in cui il test diuresi è stato utilizzato per confrontare i tassi di escrezione tra Aedes aegypti e Culex quinquefasciatus a temperature differenti. <img src="/files/ftp_upload/3479/3479fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Diagramma di flusso del RNAi / diuresi test. 5 gruppi di 10 zanzare each sono iniettati con dsRNA per un gene specifico e altri cinque gruppi di dieci zanzare sono iniettati con controllo dsRNA. Un altro gruppo di zanzare iniettati con 200 pM in PBS HgCl 2 viene utilizzato come controllo positivo. Queste zanzare sono pesati prima dell&#39;iniezione, e dopo l&#39;iniezione in trenta intervalli di un minuto per 3 ore. <img src="/files/ftp_upload/3479/3479fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Un semplice dispositivo di iniezione micro per l&#39;RNAi-mediato knockdown genica e test in vivo la diuresi. A. Gli aghi capillari di vetro utilizzato per l&#39;iniezione. Il triangolo grigio rappresenta gli incrementi millimetri disegnati sull&#39;ago per indicare la quantità di liquido iniettato nel zanzara. B. siringa da 1 ml utilizzato per costruire l&#39;iniettore micro. Il triangolo bianco rappresenta il mozzo dell&#39;ago e il triangolo nero rappresenta la testa dello stantuffo gomma attaccata allo stantuffo della siringa. C. Il tubo utilizzato per fissare il boccagliol&#39;iniettore. D. 1 ml punta di pipetta monouso (punta blu) che viene utilizzato come il boccaglio del dispositivo microiniezione. E. Il dispositivo microiniezione che incorpora parti di AD. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3479/3479fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img src="/files/ftp_upload/3479/3479fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Ottimale al sito di iniezione zanzara. A. Female zanzara Aedes aegypti iniettato con un ago capillare di vetro tra le grandi scale sul torace. La barra nera indica 1 mm per comparazione delle taglie. B. Un disegno del torace zanzara femmina e le macchie bianche rappresentano le squame bianche l&#39;esoscheletro zanzara. L&#39;ago di iniezione deve perforare la zanzara tra i punti per ridurre al minimo tasso di mortalità durante l&#39;iniezione. <img src="/files/ftp_upload/3479/3479fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Effetti della temperatura su Culex quinquefasciatus e Aedes aegypti diuresi. diuresi Il saggio è stato eseguito con due specie di zanzare, Aedes aegypti e Culex quinquefasciatus, a diverse temperature. Il tasso di escrezione durante la prima ora dopo l&#39;iniezione è data in percentuale. <table border="1"><tbody><tr><td> Gruppo </td><td> TARA (G) </td><td> non iniettato (G) </td><td> dopo l&#39;iniezione (G) </td><td> 1h iniezione POST (G) </td><td> peso medio (mg) </td><td> quantità iniettata (Pl) </td><td> quantità escreta (Pl) </td><td> % Viene escreto </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 7,5938 </td><td> 7,6057 </td><td> 7,6104 </td><td> 7,6096 </td><td> 2,38 </td><td> 0,94 </td><td> 0,16 </td><td> 17,0 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 7,8252 </td><td> 7,8349 </td><td> 7,8415 </td><td> 7,8403 </td><td> 1,94 </td><td> 1,32 </td><td> 0,24 </td><td> 18,2 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 7,8896 </td><td> 7,9026 </td><td> 7,9077 </td><td> 7,906 </td><td> 2,6 </td><td> 1,02 </td><td> 0,34 </td><td> 33,3 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Aedes aegypti nei risultati di test in vivo la diuresi. Dati grezzi dal test in vivo diuresi eseguito con le zanzare Aedes aegypti femmina a 4 ° C.

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	<li>Drake, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Aquaporin+gene+family+of+the+yellow+fever+mosquito,+Aedes+aegypti.">The Aquaporin gene family of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti.</a> PloS one. 5, e15578 (2010).</li><li>Shepard, A. R., Jacobson, N., Clark, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+quantitative+PCR+primer+location+for+short+interfering+RNA+efficacy+determination.">Importance of quantitative PCR primer location for short interfering RNA efficacy determination.</a> Analytical biochemistry. 344, 287-288 (2005).</li><li>Altschul, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gapped+BLAST+and+PSI-BLAST:+a+new+generation+of+protein+database+search+programs.">Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs.</a> Nucleic acids research. 25, 3389-3402 (1997).</li><li>Garver, L., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+RNAi+Assays+in+Adult+Mosquitoes+(A.+gambiae).">Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae).</a> J. Vis. Exp. (5), e230 (2007).</li><li>Clements, A. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+protein+produced+by+the+vitellogenic+fat+body+and+accumulated+in+mosquito+oocytes.">A novel protein produced by the vitellogenic fat body and accumulated in mosquito oocytes.</a> Development Genes and Evolution. 199, 114-121 (1990).</li></ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

Il protocollo utilizzato RNAi è stato sviluppato nel laboratorio di Alexander Raikhel presso la University of California Riverside 6,7 ed è simile a un protocollo pubblicato da Garver e Dimopoulos 4. L&#39;approccio sperimentale mostrato in questo protocollo video possono essere utilizzati per studiare i geni coinvolti nella diuresi insetto in un ambiente in vivo. Gli organi escretori di insetti, i tubuli malpighiani, hanno attirato l&#39;interesse di generazioni di ricercatori come un s...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente o attrezzature </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> MEGAscript T7 Kit High Yield </td><td> Ambion, Inc. </td><td> AM1334 </td><td></td></tr><tr><td> Tampone PBS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4417 </td><td></td></tr><tr><td> Tubi in plastica </td><td> Rivenditore locale </td><td></td><td> PVC </td></tr><tr><td> 1 ml di plastica della punta di pipetta </td><td> VWR </td><td> 83007-376 </td><td> Blu punta </td></tr><tr><td> 1 ml siringa </td><td> Becton, Dickinson and Company </td><td> 309602 </td><td></td></tr><tr><td> Forbici </td><td> Rivenditore locale </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Metallo ago </td><td> Carolina Biologicals </td><td> 654307 </td&gt; <td> Size 5 </td></tr><tr><td> Vola pad </td><td> Genesee Scientific </td><td> 789060 </td><td></td></tr><tr><td> Alimentato a batteria Aspiratore w / collezione vial </td><td> Upma Labs </td><td> IPMM 2000 </td><td></td></tr><tr><td> Pinza punta fine </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> 14095 </td><td></td></tr><tr><td> Aghi di vetro capillari </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> 1B200-6 </td><td></td></tr><tr><td> Dissezione microscopio stereo </td><td> Leica Microsystems </td><td> S6D </td><td></td></tr><tr><td> Bilancia analitica di precisione </td><td> Mettler Toledo </td><td> AB54S </td><td></td></tr><tr><td> Saccarosio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 84097 </td><td></td></tr><tr><td> Una pinta di cartone cerato tazze allineate </td><td> Rivenditore locale </td><td></td><td> Tazze di zuppa di Prodotto </td></tr><tr><td> Delle maglie delle reti </td><td> Rivenditore locale </td><td></td><td> fly garza di plastica </td></tr></tbody></table>

rnai-mediated gene knockdown and in vivo diuresis assay in adult female aedes aegypti mosquitoes

Questo protocollo video mostra una tecnica efficace per abbattere un particolare gene in un insetto e condurre un biotest romanzo per misurare il tasso di escrezione. Questo metodo può essere utilizzato per ottenere una migliore comprensione del processo di diuresi in insetti ed è particolarmente utile nello studio della diuresi nel sangue alimentazione artropodi in grado di raccogliere grandi quantità di liquido in un pasto di sangue singolo. Questo RNAi-mediato knockdown gene combinato con un test in vivo diuresi è stato sviluppato dal laboratorio di Hansen per studiare gli effetti di RNAi-mediato knockdown di geni acquaporina sulla diuresi zanzara Aedes aegypti 1. Il protocollo è configurato in due parti: la prima dimostrazione illustra come costruire un semplice dispositivo di iniezione zanzare e su come preparare ed iniettare dsRNA nel torace di zanzare per RNAi-mediato knockdown gene. La seconda dimostrazione illustra come determinaretassi di escrezione nelle zanzare utilizzando un saggio biologico in vivo.

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RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

In questo protocollo si combinano RNAi-mediato silenziamento genico con un<em&gt; In vivo</em&gt; Test diuresi per studiare il colpo degli effetti dei geni di interesse ha sulla escrezione di liquidi zanzara.

RNAi-mediato Knockdown Gene e<em&gt; In Vivo</em&gt; Saggio La diuresi in femmina adulta<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; Le zanzare

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion ...

rnai-mediated-gene-knockdown-vivo-diuresis-assay-adult-female-aedes

Research

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Biology

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

13.4K Views.  New Mexico State University. In questo protocollo si combinano RNAi-mediato silenziamento genico con un In vivo Test diuresi per studiare il colpo degli effetti dei geni di interesse ha sulla escrezione di liquidi zanzara.

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Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

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In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes (A. aegypti) and Infection Phenotype Determination

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of the virus in the mosquito tissues. This protocol is routinely used for studying mosquito-virus interactions, especially for identification of novel host factors that are able to determine vector competence. The entire experiment must be conducted in a BSL2 laboratory. Similar to Plasmodium falciparum infections, proper attire including gloves and lab coat must be worn at all times. After the experiment, all the materials that came in contact with the virus need to be treated with 75% ethanol and bleached before proceeding with normal washing. All other materials need to be autoclaved before discarding them.

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes A. aegypti and Infection Phenotype Determination

Once a gene is identified as potentially refractory for the dengue virus, it must be evaluated for it's role in preventing viral infections within the mosquito. This protocol illustrates how the extent of dengue infections of mosquitoes can be assayed. The techniques for growing up the virus in culture, membrane feeding mosquitoes human blood, and assaying viral titers in the mosquito midgut are demonstrated.

Protocollo per la dengue in Zanzare (A. aegypti) e Fenotipo Determinazione infezione

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of ...

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol demonstrates dissection techniques for removal of the midgut and salivary glands from Aedes aegypti mosquitoes. 



The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for vector pathogens like Plasmodium falciparum and the dengue virus. This video demonstrates the dissection techniques for removing the midgut and salivary glands from Aedes aegypti mosquitoes.

Dissezione delle ghiandole salivari e midgut da Ae. aegypti zanzare

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite.  The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes A. gambiae

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes. This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite. The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Protocollo per saggi RNAi in zanzare adulte (A. gambiae)

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression analyses by RNA interference and stable transgenesis remain limited in many species due to the particular anatomy and molecular cellular biology of the organism. For example, outside of the crown group Caenorhabditis that includes Caenorhabditis elegans3, stably transmitted transgenic lines in non-Caenorhabditis species have not been reported in this specious phylum (Nematoda), with the exception of Strongyloides stercoralis4 and Pristionchus pacificus5. To facilitate the expanding role of P. pacificus in the study of development, evolution, and behavior6-7, we describe here the current methods to use microinjection for making transgenic animals and gene knock down by RNAi. Like the gonads of C. elegans and most other nematodes, the gonads of P. pacificus is syncitial and capable of incorporating DNA and RNA into the oocytes when delivered by direct microinjection. Unlike C. elegans however, stable transgene inheritance and somatic expression in P. pacificus requires the addition of self genomic DNA digested with endonucleases complementary to the ends of target transgenes and coinjection markers5. The addition of carrier genomic DNA is similar to the requirement for transgene expression in Strongyloides stercoralis4 and in the germ cells of C. elegans. However, it is not clear if the specific requirement for the animals' own genomic DNA is because P. pacificus soma is very efficient at silencing non-complex multi-copy genes or that extrachromosomal arrays in P. pacificus require genomic sequences for proper kinetochore assembly during mitosis. The ventral migration of the two-armed (didelphic) gonads in hermaphrodites further complicates the ability to inject both gonads in individual worms8. We also demonstrate the use of microinjection to knockdown a dominant mutant (roller,tu92) by injecting double-stranded RNA (dsRNA) into the gonads to obtain non-rolling F1 progeny. Unlike C. elegans, but like most other nematodes, P. pacificus PS312 is not receptive to systemic RNAi via feeding and soaking and therefore dsRNA must be administered by microinjection into the syncitial gonads. In this current study, we hope to describe the microinjection process needed to transform a Ppa-egl-4 promoter::GFP fusion reporter and knockdown a dominant roller prl-1 (tu92) mutant in a visually informative protocol.

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

In model organisms, transgenesis can manipulate gene functions while RNAi can knockdown specific mRNA transcripts 1-2. This protocol aims to illustrate the techniques needed to introduce stably transmitted DNA and transient double stranded RNA into the necromenic nematode Pristionchus pacificus for studies in evolutionary, developmental, and behavioral biology.

RNAi mediata Knockdown Gene e Transgenesi dalla microiniezione nel nematode Necromenic Pristionchus pacificus</em

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression ...

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter implantation. The technical limitation of this surgical technique lies in the finesse of the hands. The injection is rapid, especially for a trained experimenter, and since tissue disruption with this technique is minimal, repeated injections are possible; moreover immune reaction to foreign tools (e.g. catheter) does not occur, thereby giving a better and more specific read out of spinal cord modulation. Since the application of the substance is largely limited to the target region of the spinal cord, drugs do not need to be applied in large dosages, and more importantly unwanted effects on other tissue, as observed with a systemic delivery, could be circumvented1,2. Moreover, we combine this technique with in vivo transfection of nucleic acid with the help of polyethylenimine (PEI) reagent3, which provides tremendous versatility for studying spinal functions via delivery of pharmacological agents as well as gene, RNA, and protein modulators.

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a simple and rapid technique of intrathecal needle puncture for a localized transfection of siRNA in the lumbar spinal cord in mouse under short lasting light anesthesia.

In Vivo trasfezione di siRNA e Gene Knockdown in Spinal Cord via rapida non invasiva lombare spinale iniezioni nei topi

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter ...

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

The insect fat body plays a central role in insect metabolism and nutrient storage, mirroring functions of the liver and fat tissue in vertebrates. Insect fat body tissue is usually distributed throughout the insect body. However, it is often concentrated in the abdomen and attached to the abdominal body wall.
The mosquito fat body is the sole source of yolk proteins, which are critical for egg production. Therefore, the in vitro culture of mosquito fat body tissues represents an important system for the study of mosquito physiology, metabolism, and, ultimately, egg production. The fat body culture process begins with the preparation of solutions and reagents, including amino acid stock solutions, Aedes physiological saline salt stock solution (APS), calcium stock solution, and fat body culture medium. The process continues with fat body dissection, followed by an experimental treatment. After treatment, a variety of different analyses can be performed, including RNA sequencing (RNA-Seq), qPCR, Western blots, proteomics, and metabolomics.
In our example experiment, we demonstrate the protocol through the excision and culture of fat bodies from the yellow fever mosquito, Aedes aegypti, a principal vector of arboviruses including dengue, chikungunya, and Zika. RNA from fat bodies cultured under a physiological condition known to upregulate yolk proteins versus the control were subject to RNA-Seq analysis to demonstrate the potential utility of this procedure for investigations of gene expression.

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

The fat body is the central metabolic organ in insects. We present a live organ culture system that enables the user to study the responses of isolated fat body tissue to various stimuli.

Sistema di coltura di organo del grasso corporeo in Aedes Aegypti, vettore di Virus di Zika

The insect fat body plays a central role in insect metabolism and nutrient storage, mirroring functions of the liver and fat tissue in vertebrates. Insect ...

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, chikungunya and Zika. Wolbachia-infected mosquitoes can be released into the field to either reduce population sizes through incompatible matings or to transform populations with mosquitoes that are refractory to virus transmission. For these strategies to succeed, the mosquitoes released into the field from the laboratory must be competitive with native mosquitoes. However, maintaining mosquitoes in the laboratory can result in inbreeding, genetic drift and laboratory adaptation which can reduce their fitness in the field and may confound the results of experiments. To test the suitability of different Wolbachia infections for deployment in the field, it is necessary to maintain mosquitoes in a controlled laboratory environment across multiple generations. We describe a simple protocol for maintaining Ae. aegypti mosquitoes in the laboratory, which is suitable for both Wolbachia-infected and wild-type mosquitoes. The methods minimize laboratory adaptation and implement outcrossing to increase the relevance of experiments to field mosquitoes. Additionally, colonies are maintained under optimal conditions to maximize their fitness for open field releases.

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes infected with Wolbachia are being released into natural populations to suppress the transmission of arboviruses. We describe methods to rear Ae. aegypti with Wolbachia infections in the laboratory for experiments and field release, taking precautions to minimize laboratory adaptation and selection.

Mantenimento di Aedes aegypti zanzare infettate con Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, ...

Improved Fecundity and Fertility Assay for Aedes aegypti using 24 Well Tissue Culture Plates (EAgaL Plates)

Mosquitoes represent a significant public health problem as vectors of various pathogens. For those studies that require an assessment of mosquito fitness parameters, in particular egg production and hatch rates at the individual level, conventional methods have put a substantial burden on investigators due to high labor intensity and laboratory space requirements. Described is a simple method using 24 well tissue culture plate with agarose in each well and digital imaging of each well to determine egg numbers and hatch rates at an individual level with substantially reduced time and space requirements.

Improved Fecundity and Fertility Assay for Aedes aegypti using 24 Well Tissue Culture Plates EAgaL Plates

Described is a time and space-saving method to count eggs and determine hatch rates of individual mosquitoes using 24 well tissue culture plates, which can substantially increase the scale and speed of fecundity and fertility assays.

Test migliorato di fecondità e fertilità per Aedes aegypti utilizzando 24 piastre di coltura dei tessuti dei pozzi (piastre EAgaL)

Mosquitoes represent a significant public health problem as vectors of various pathogens. For those studies that require an assessment of mosquito fitness ...