Questo metodo può aiutare ad affrontare le sfide chiave nel campo dell'immunoterapia oncologica facilitando lo sviluppo di vettori oncolittici per l'immunomodulazione mirata. Il principale vantaggio del sistema genetico inverso applicato è la sua versatilità;quindi, i vettori possono essere adattati per affrontare varie domande di ricerca e indirizzare tumori con diverse firme immunitarie. I passaggi di propagazione del virus, in particolare determinando il punto di tempo ottimale per raccogliere il virus, sono difficili da imparare da un protocollo di testo perché la formazione di sinctia deve essere valutata visivamente nel tempo.
Per iniziare a progettare e clonare vettori immunomodulatori ricombinanti come descritto nel manoscritto. Questo protocollo descrive passaggi specifici per lo sviluppo di un vettore oncolitico del vaccino contro il morbillo, codificando un engager a cellule T bispecifiche. Per salvare il virus del morbillo dal cDNA, 24 ore prima della piastra di trasfezione le cellule produttrici del virus del morbillo in modo uniforme su una piastra a parete 6.
Seme 200.000 cellule in 2 millilitri DMEM contenenti il 10% di FBS per pozzo per raggiungere la confluenza dal 65 al 75% al momento della trasfezione. Mescolare 5 microgrammi di DNA ricombinante che codificano l'antigenoma del virus del morbillo che verrà utilizzato per trasfetto le cellule. Plasmidi appropriati e un reporter fluorescente in un volume totale di 200 microlitri di DMEM.
Aggiungere 18,6 microlitri di reagente di trasfezione liposomiale alla miscela e far scorrere immediatamente il tubo per mescolare. Incubare questo mix di trasfezione per 25 minuti a temperatura ambiente. Per trasfetto le cellule produttrici di MV rimuovere il mezzo dalla piastra del pozzo 6 coltivata al 65-75% di confluenza e aggiungere 1,8 millilitri di DMEM con FBS 2% e 50 microgrammi per millilitro Kanamycin per pozzo.
Quindi aggiungere il mix di trasfezione dropwise ad ogni pozzo e ruotare con attenzione. Incubare le cellule durante la notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Il giorno seguente sostituire il mezzo con 2 millilitri di DMEM fresco con FBS al 2% e 50 microgrammi per millilitro Kanamycin e ripeterlo quando il mezzo diventa acido riconosciuto dal colore giallo.
Usa un microscopio per osservare quotidianamente le cellule per l'espressione genica del reporter e la formazione di sincitia. Quando la grande sincrezia composta da 20 o più cellule sono visibili o quando le cellule diventano troppo dense raccolgono il virus. 24 ore prima del seme di raccolto previsto circa 1,5 milioni di cellule produttrici di MV in 12 millilitri di DMEM con FBS al 10% su piatti da 10 centimetri per ottenere una confluenza dal 65 al 75% al momento dell'inoculazione del virus.
Per raccogliere la proginia virale utilizzare un raschietto cellulare per raschiare con cura le cellule di produzione aderenti dalla piastra a 6 pareti con cellule trasfette. Trasferire il mezzo contenente le celle raschiate in un tubo di centrifuga. Centrifugare per almeno 2500 volte G e 4 gradi Celsius per 5 minuti per rimuovere i detriti cellulari.
Dopo la centrifugazione mescolare il supernatante privo di cellule con mezzo privo di siero fino a un volume finale di 4 millilitri per preparare l'inoculo. Rimuovere il mezzo dal piatto di 10 centimetri con le cellule di produzione di MV e aggiungere l'inoculo alle cellule. Incubare per almeno 2 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.
Dopo l'incubazione aggiungere 6 millilitri di DMEM con FBS al 10% e incubare le cellule durante la notte. Quindi sostituire il mezzo con 12 millilitri di DMEM fresco con FBS al 10% e incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica fino alla raccolta. Osservare le cellule almeno due volte al giorno.
Prima dello scoppio della sinctia quando l'interruzione della membrana diventa visibile raccogliere il virus. Per raccogliere il primo passaggio rimuovere il supernatante dal piatto e aggiungere 600 microlitri di mezzo privo di siero. Quindi utilizzare un sollevatore di celle per raschiare le celle e trasferirlo in un tubo pulito.
Subito dopo congelare la sospensione del virus in azoto liquido e conservare a 80 gradi Celsius per almeno 24 ore per garantire un congelamento accurato. Per determinare i titoli delle scorte di virus in ottuplicati per aliquota utilizzando 96 piastre a parete. Per prima cosa estrarre le cellule produttrici dai contenitori di coltura cellulare T75 in un tubo conico da 50 millilitri.
Contare le celle e regolare la sospensione cellulare a 150.000 celle per millilitro in DMEM con FBS al 10%. Aggiungere 90 microlitri di DMEM con FBS al 10% per pozzo di una piastra a parete 96. Quindi aggiungere 10 microlitri da un'aliquota del patrimonio virale a tutti e 8 i pozzi nella prima colonna della piastra.
Mescolare accuratamente pipettando su e giù almeno 10 volte. Utilizzare una pipetta multicanale per trasferire 10 microlitri di ogni pozzo, dalla prima alla seconda colonna, e mescolare accuratamente convogliando su e giù. Ripetere questa procedura per ogni colonna per ottenere diluizioni seriali di dieci volte del virus utilizzando punte di pipetta fresche per ogni fase di diluizione.
Scartare 10 microlitri da ogni pozzo dell'ultima colonna. Aggiungere 100 microlitri di sospensione cellulare con 150.000 cellule per millilitro a ciascun pozzo assicurandosi che non ci siano grumi cellulari. Incubare a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica per 48 ore.
Verificare la presenza di sincizia utilizzando un microscopio a luce. Contare la sincizia in ogni pozzo della colonna con il fattore di diluizione più alto contenente la sincizia visibile. Per i virus che codificano un reporter fluorescente, la sinctia può essere conteggiata utilizzando la microscopia a fluorescenza.
Per l'analisi della cinetica di replicazione del virus del morbillo un giorno prima del seme di infezione 100.000 cellule vero in 1 millilitro di DMEM con FBS 10% per pozzo su 12 piastre a parete con almeno 2 pozzi per ogni punto di interesse. Per infettare le cellule sostituire il mezzo con 300 microlitri di mezzo privo di siero contenente la rispettiva quantità del virus. Incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per almeno 2 ore.
Rimuovere l'inoculo e aggiungere 1 millilitro di DMEM con FBS al 10% e continuare l'incubazione. Nei punti di tempo rilevanti dopo l'infezione raccogliere la proginia virale raschiando direttamente le cellule nel mezzo. Trasferire il contenuto da ogni pozzo a un singolo tubo.
Agganciare il congelamento in azoto liquido e conservare a 80 gradi Celsius fino alla titolazione e quindi procedere come descritto nel manoscritto. Per iniziare la valutazione della citotossicità mediata dalle cellule indotte da BTE mediante rilascio di LDH, isolare prima i prodotti transgeni secreti espressi dalle cellule bersaglio infettate dal virus e isolare le cellule dell'effettore immunitario come descritto nel manoscritto. Quindi semina le cellule bersaglio in una piastra da parete 96 inferiore a U e includi campioni come descritto nel manoscritto.
Aggiungere immunomodulatori precedentemente isolati alle concentrazioni desiderate ai rispettivi campioni. Aggiungere le cellule del disertore immunitario ai rapporti desiderati e aggiungere un volume medio-totale di 100 microlitri per pozzo. Incubare per i tempi precedentemente determinati desiderati a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.
45 minuti prima della raccolta del campione aggiungere 10 microlitri di soluzione di lisi 10X ai pozzi contenenti campioni T max e i corrispondenti controlli medi e continuare l'incubazione. Centrifugare le cellule a 250 volte G per 4 minuti. Trasferire 50 microlitri di supernatante da ogni pozzo a pozzi di una piastra a parete 96 inferiore piatta assicurandosi di non trasferire le celle.
Dopo aver preparato la soluzione del substrato secondo il produttore aggiungere 50 microlitri ad ogni pozzo. Incubare a temperatura ambiente al buio per 30 minuti o fino a quando i campioni T max diventano rosso intenso. Dopo l'incubazione aggiungere 50 microlitri di soluzione di arresto ad ogni pozzo.
Centrifugare per 1 minuto a 4000 volte G e quindi utilizzare un ago scavato per rimuovere le bolle d'aria. Misurare l'assorbanza ottica a 490 nanometri e calcolare come descritto nel manoscritto. Dopo l'inoculazione con virus del morbillo oncolitici non modificati e BTE, le curve di crescita dei vettori confrontati sulle cellule vero appaiono simili.
Le curve di vitalità cellulare sulle cellule del carcinoma colorettale murino mc38 che esprimono stabilmente l'antigene carcinoembrionale umano e i recettori MV CD46 dopo l'inoculazione mostrano che l'attività licale del virus della codifica transgena è in ritardo nella linea cellulare tumorale murina. La citometria a flusso dell'antigene bersaglio che esprime cellule incubate con BTE a cinque diverse diluizioni ha mostrato il legame BTE da parte delle cellule in modo dipendente dalla concentrazione. Nell'immunoblot dopo il pull down magnetico delle cellule associate al BTE è emerso che quando si utilizzavano BTE non mirati non c'erano quantità rilevabili di cellule;mentre quando si prendevano di mira i campioni di BTE erano presenti cellule legate nella frazione di eluizione.
La citotossicità bersaglio mediata da BTE specifica e dipendente dalla concentrazione delle cellule T murine è indicata da un saggio rappresentativo di rilascio di LDH e mostra che nel presente esempio l'abbattimento specifico di cellule del 15% è stato raggiunto ad una concentrazione di BTE relativamente elevata di 1 microgrammo per millilitro rispetto alle cellule di riferimento. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di monitorare regolarmente le cellule per controllare la progressione dell'infezione. Non dimenticare che i ceppi di vaccino contro il morbillo ricombinanti sebbene attenuati possono essere pericolosi soprattutto per gli individui immuno-soppressi.
Evitare l'esposizione seguendo le procedure di biosicurezza appropriate. Gli individui che maneggiano virus devono essere vaccinati prima di eseguire questi metodi. Seguendo questa procedura è possibile ottenere l'espressione virale di ulteriori transgeni al fine di analizzare le interazioni degli ospiti del virus e gli effetti terapeutici.
Lo sviluppo di queste tecniche ha spianato la strada ai ricercatori nel campo della bioterapia per esplorare gli effetti degli immunomodulatori espressi localmente in numerose entità tumorali;In Vitro, In Vivo e anche negli studi clinici.
