Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande chiave nell'immunologia tumorale, tra cui se esiste un rifornimento di cellule immunitarie specifiche del tumore dai tessuti periferici, le transizioni tra cellule immunitarie appena infiltrate e già esistenti all'interno del microambiente tumorale e le loro risposte all'immunoterapia. Questa è una tecnica comoda e facile da seguire per distinguere le cellule derivate dalla periferia dalle cellule immunitarie infiltrate dal tumore e tracciare i cambiamenti dinamici, fenotipici e funzionali di queste cellule nei saggi longitudinali. Iniziare ritirando 100 microlitri della sospensione cellulare B16F10-OVA preparata in una siringa tubercolina da 1 mL.
Toccare la canna per spostare eventuali bolle verso l'alto e spingere delicatamente lo stantuffo per rimuovere le bolle d'aria. Trattenere il mouse per esporre il suo addome. Premere la zampa posteriore sinistra con il mignolo per stringere la pelle della regione inguinale sinistra.
Rimuovere i peli del topo dal suo basso addome sinistro con un rasoio elettrico. Utilizzare cotone imbevuto di etanolo al 75% per pulire il quadrante posteriore dell'addome sinistro. Tenere la siringa con un angolo poco profondo compreso tra 0 e 15 gradi e, con la smussatura dell'ago rivolta verso l'alto, inserirla sul lato della parte superiore sinistra della coscia.
Far avanzare l'ago da 0,5 a 1 centimetro attraverso il tessuto sottocutaneo nella regione inguinale. Tirare indietro lo stantuffo prima di iniettare. Se c'è una pressione negativa, premere completamente lo stantuffo e osservare la formazione di una piccola tasca fluida, o di un bolo, nel sottocute.
Rimuovere l'ago dopo l'iniezione. Rilascia e rimetti il mouse nella gabbia. Dal sesto all'ottavo giorno dopo l'impianto di B16F10-OVA, misurare le dimensioni del tumore con una scala vernier.
Selezionare i topi con un diametro di circa tre millimetri o un tumore delle dimensioni di un fagiolo mung e dividerli equamente e casualmente in due gruppi. Prelevare 200 microlitri di sospensione cellulare OT-1 in una siringa da insulina calibro 29 da 100 unità e rimuovere le bolle. Posizionare il mouse separatamente in una gabbia, con una lampada a infrarossi sopra la gabbia per 5-10 minuti per dilatare la vena della coda.
Immobilizzare il mouse con un dispositivo di ritenuta di dimensioni appropriate. Tenere la coda per raddrizzarla e spruzzare il 75% di etanolo per rendere visibile la vena. Tenere la siringa parallela alla vena e inserirla nella vena con un angolo compreso tra 0 e 15 gradi.
Tirare leggermente indietro lo stantuffo e, se il sangue entra nella canna, iniettare lentamente e costantemente la sospensione ad una velocità non superiore a un millilitro al minuto. Al termine dell'iniezione, rimuovere la siringa e premere delicatamente l'area di iniezione per tre-cinque secondi per fermare l'emorragia. Riportare il topo nella gabbia e osservarlo attentamente per alcuni minuti per le reazioni avverse.
Se ha una normale mobilità e secrezione nasale, rimettilo in compagnia degli altri topi. Da 8 a 10 giorni dopo il trasferimento adottivo, selezionare topi donatori con massa tumorale comparabile di circa cinque millimetri di diametro per la chirurgia del trapianto. Metti un piatto da 100 millimetri per 20 millilitri in un armadietto di biosicurezza e aggiungi 10 millilitri di PBS sterile e ghiacciato.
Dopo l'eutanasia del mouse, immergerlo nel 75% di etanolo per tre-cinque minuti. Posizionare il mouse in posizione supina su un pannello di dissezione coperto con carta assorbente pulita nell'armadio di biosicurezza. Trattenere gli arti del topo con aghi di dissezione.
Tagliare la pelle lungo la linea mediana da sopra l'orifizio uretrale allo xifoide con le forbici. Allungare la pelle verso il lato sinistro del corpo del topo con una pinzetta e trattenere la pelle con aghi di dissezione. Asportare il tumore, mantenendo la sua capsula il più intatta possibile.
Rimuovere con cura e delicatamente il tessuto connettivo vicino al tumore con le forbici chirurgiche, quindi posizionare il tessuto tumorale nel piatto contenente PBS sterile e ghiacciato per il successivo trapianto. Utilizzare unguento veterinario sugli occhi per evitare che si secchino. Rasare il fianco sinistro del mouse con un rasoio elettrico, quindi applicare una crema depilatoria per rimuovere i peli rimanenti.
Posizionare il mouse all'interno dell'armadio di biosicurezza in posizione prona su un pannello di dissezione coperto con carta assorbente pulita, con l'asse verticale del mouse parallelo e la testa sul lato destro dello sperimentatore. Strofinare la pelle dell'area rasata con cotone imbevuto di povidone-iodio. Sollevare la pelle nel punto medio tra le articolazioni dell'anca del topo con una pinzetta chirurgica.
Usa le forbici per fare un'escissione verticale lunga cinque millimetri ed estendere il taglio rostralmente lungo la linea mediana dorsale a circa 10-15 millimetri. Eseguire una dissezione acuta inserendo le punte chiuse delle forbici nell'incisione e quindi aprendo per separare il peritoneo del fianco sinistro dalla pelle e dai tessuti molli. Eseguire una dissezione acuta più volte per generare una tasca della pelle sul fianco sinistro.
Depositare la massa tumorale incapsulata, intatta, derivata dal donatore nella tasca. Chiudere l'incisione con una sutura interrotta, usando due o tre punti per ogni incisione. Disinfettare la pelle intorno al taglio con cotone imbevuto di povidone-iodio.
Posizionare il mouse in posizione laterale in una gabbia pulita e calda. Monitoralo continuamente fino a quando non ha riacquistato una coscienza sufficiente per mantenere la reclinazione sternale. Somministrare buprenorfina per via sottocutanea alla dose di 0,1 milligrammi per chilogrammo di peso corporeo ogni otto ore, per un totale di tre dosi.
Restituire il ricevente del trapianto alla compagnia di altri animali solo dopo che si è completamente ripreso. Utilizzando la citometria a flusso, due popolazioni di cellule T antigene-tumorale CD44-negative e CD8-positive sono state facilmente identificate nel microambiente tumorale, tra cui CD45.1-positive derivate da donatori e CD45.1-negative e CD45.2-positive cellule T CD8-infiltranti il tumore derivate dal ricevente. Al secondo giorno dopo il trapianto, c'erano circa l'83% delle cellule T CD8-positive antigene-specifiche derivate da donatori all'interno del tumore trapiantato, più predominanti rispetto alle loro controparti derivate dal ricevente.
La percentuale di cellule OT-1 derivate dal ricevente era elevata nella fase avanzata della tumorigenesi, superando le cellule OT-1 intrinseche al tumore derivate dal donatore. La cosa più importante da ricordare è che eseguire una dissezione delicata durante il trapianto di tumore sottocutaneo per evitare lesioni sui tessuti circostanti, specialmente nei linfonodi granulari.
