Questa tecnica sfrutta la microscopia a scansione laser multi-fotone in combinazione con la fotolisi laser-flash di una molecola di nicotina fotoattivabile. Consentire l'attivazione precisa dei recettori colinergici nicotinici. Questa tecnica consente un controllo spatiotemporale fine sull'applicazione agonista del recettore nicotinico, fornendo un potente strumento per lo studio dei modelli di espressione funzionale del recettore e della trasmissione sinaptica o volumecolinergica.
Prima di iniziare la procedura, utilizzare un estrattore di pipetta programmabile per tirare una micropipetta di vetro con un diametro di apertura da 20 a 40 micrometri. Filtrare circa un millilitro di soluzione di registrazione attraverso un filtro da 0,22 micron. E resospendare abbastanza nicotina fotoattivabile lyophilizzata nella soluzione di registrazione filtrata per produrre una concentrazione finale di due millimolari.
Riempire la micropipetta di applicazione locale tirata con 50 microlitri del farmaco fotoattivabile e fissare la pipetta in un supporto per pipette montato su un micromanipolatore. Collegare il supporto della pipetta tramite un'adeguata lunghezza del tubo a un sistema di espulsione della pressione in grado di applicazione sostenuta a bassa pressione. E utilizzare il micromanipolatore per manovrare la pipetta di applicazione locale nella soluzione di registrazione extracellulare.
Posizionare la punta della pipetta leggermente sopra un campione di tessuto cerebrale del topo, a circa 50 micrometri dalla cellula di interesse. E applicare brevemente da uno a due libbre per pollice quadrato di pressione alla pipetta. Ci dovrebbe essere minimo o nessun spostamento della cellula di interesse.
Dopo aver ottenuto un morsetto stabile per patch a celle intere, accendere l'applicazione bassa sul dispositivo di espulsione della pressione e saturare il tessuto che circonda la cellula con nicotina fotoattivabile per uno o due minuti. L'applicazione locale introduce ulteriore complessità all'esperimento. Ma risparmia il composto e consente di utilizzare concentrazioni più elevate di PA-Nic.
Per l'applicazione a bagno della nicotina fotoattivabile, sciogliere prima abbastanza del farmaco liofilizzato in un volume di soluzione di registrazione appropriato per il ricircolo continuo a una concentrazione finale di 100 micromolari. E caricare la miscela risultante in un sistema di perfusione. Quindi iniziare il ricircolo della soluzione di nicotina fotoattivabile a una velocità da 1,5 a 2 millimetri al minuto, utilizzando tubi con un diametro interno minimo e una lunghezza complessiva per ridurre al minimo il volume di ricircolo richiesto.
Durante il ricircolo, bollare continuamente la soluzione con carbogeno e mantenere la temperatura del bagno a 32 gradi Celsius in condizioni di scarsa illuminazione. L'applicazione del bagno beneficia della semplicità e dell'uniformità della permeazione PA-Nic del tessuto. Ma utilizza necessariamente concentrazioni di PA-Nic micromolare più basse e spende quantità totali più elevate di composto.
Per la visualizzazione dal vivo di un neurone di habenula mediale, utilizzare ottiche a contrasto di interferenza differenziale della luce trasmessa o infrarossa e una videocamera per stabilire una registrazione stabile del morsetto patch a celle intere. Dopo aver stabilito la configurazione collegata alle celle ad alta resistenza, ma prima dell'e-in, passare dalla configurazione e dal software alla modalità di scansione laser. Dopo l'es-in, utilizzare la scansione laser per verificare che il colorante di imaging di interesse riempia passivamente il neurone per diffusione.
Lasciare che il colorante riempia i compartimenti cellulari per almeno 20-30 minuti prima di utilizzare la funzione di scansione dal vivo per visualizzare il neurone e il compartimento subcellulare di interesse. Selezionare i parametri di imaging che consentono una visualizzazione dal vivo accurata delle caratteristiche neuronali, manipolando le impostazioni appropriate per influenzare o modificare la visualizzazione dello schermo, la risoluzione, il rapporto segnale-rumore e il tempo di acquisizione del fotogramma dell'immagine, se necessario. Per migliorare il contrasto del segnale, aprire la finestra della tabella di ricerca e regolare le impostazioni del pavimento e del soffitto del tavolo di ricerca.
Per individuare un'area di interesse all'interno del tessuto, selezionare lo zoom ottico 1X e utilizzare i controlli di panoramica. Utilizzare lo strumento Serie Z per selezionare una posizione iniziale e di arresto contenente la cella di interesse. Impostare una dimensione del passaggio di un micrometro e selezionare una dimensione dell'immagine che produca un'immagine con la risoluzione più alta.
Spesso 1.024 per 1.024 pixel per linea. Quindi immagini consecutivamente il neurone in ogni piano Z che contiene la cellula. Per calibrare la stimolazione laser, avviare la scansione del sistema con una potenza laser di imaging superiore al minimo e ottimizzare la messa a fuoco oggettiva sul sottile strato di fluorescenza del marcatore rosso.
Selezionare un'area all'interno del campo di fluorescenza libera dai detriti e patinata uniformemente con marcatore e aprire il menu strumenti, calibrazione e allineamento per selezionare la funzione di ricalibrazione galvocalibrazione. Segui il tutorial sui punti di combustione per la calibrazione spaziale della seconda coppia di specchi galvanometrici, selezionando il laser da 405 nanometri, una potenza di stimolazione laser di 400 e una durata di stimolazione di 20 millisecondi. Per produrre fori di diametro da uno a cinque micrometri nel marcatore rosso.
Selezionate aggiorna (Update) per stimolare e aggiornare l'immagine dopo la masterizzazione del punto centrale e spostate l'indicatore rosso rotondo nella posizione effettiva del punto centrale, destro e centro inferiore per ottenere una griglia di nove punti. Per testare la calibrazione, aprire la finestra dei punti di contrassegno e attivare manualmente i parametri di stimolazione dei punti definiti in una nuova area del campione, facendo attenzione che il file di calibrazione più recente corretto sia caricato nella finestra dei punti di contrassegno. Quindi applicare un impulso di prova per verificare la calibrazione corretta.
Per visualizzare brevemente e individuare l'area subcellulare di interesse, selezionare la scansione dal vivo e utilizzare aumenta lo zoom ottico per visualizzare eventuali piccole strutture in base alle esigenze. Posizionare il mirino a punto singolo del punto di marcatura immediatamente adiacente alla membrana cellulare e impostare i parametri di fotostimolazione su una durata da uno a 50 millisecondi, una potenza laser da uno a quattro milliwatt e almeno una prova. Quindi selezionare i punti di selezione per avviare il protocollo dei punti di riferimento e osservare l'acquisizione dei dati di elettrofisiologia in tempo reale.
La fluorescenza fotoattivabile a nicotina 2PE di PA-Nic millimolare viene facilmente rilevata durante l'espulsione di pressione da una pipetta di applicazione locale, come dimostrato. Mentre la consegna dei principali prodotti fotochimici della reazione fotolisi fotoattivabile alla nicotina non genera alcun segnale fluorescente alla stessa concentrazione e potenza di eccitazione e lunghezza d'onda. Dimostrare la specificità dei risultati della nicotina fotoattivabile.
L'imaging della nicotina fotoattivabile applicata al tessuto cerebrale come dimostrato rivela la presenza del farmaco entro 100-200 micrometri dalla pipetta di applicazione locale. Confermando che la nicotina fotoattivabile può essere efficacemente consegnata al tessuto cerebrale tramite applicazione locale. Qui, vengono mostrate immagini di alta qualità all'interno delle quali la morfologia neuronale sembra essere completa, il rumore è ridotto al minimo e i detriti non interferiscono con l'interpretazione della morfologia cellulare.
Queste immagini, tuttavia, sono di qualità inferiore. A causa di un minore rapporto segnale-sfondo e detriti sostanziali. L'associazione della microscopia a scansione laser a due fotoni dei neuroni dell'habenula mediale nelle fette cerebrali con la fotolisi flash laser di PA-Nic come dimostrato, consente la riconciliazione delle risposte elettrofisiopatiche con la morfologia cellulare.
La fotolisi a punto singolo eseguita a intervalli di 10 secondi consente un tempo di recupero sufficiente per la corrente di tenuta di base. Mentre un intervallo di un secondo più breve porta a un graduale aumento della corrente di partecipazione man mano che il protocollo procede. Suggerendo che la nicotina non ha abbastanza tempo per diffondersi lontano dal sistema con gli intervalli più brevi.
Nella progettazione di esperimenti che utilizzano molecole fotoattivabili, è importante ricordare di selezionare indicatori fluorescenti e segnalare fluorofori con spettri di emissione di eccitazione compatibili. PA-Nic è compatibile con i fluorofori più comuni grazie al suo picco di fotolisi a lunghezza d'onda corta. Quando si sceglie la tecnica di applicazione PA-Nic più appropriata, è importante considerare attentamente l'espressione funzionale, l'attività fisiologica dei recettori nicotinici nei neuroni di interesse.
L'uso qualificato di questa tecnica consente un controllo spatiotemporale fine dell'applicazione della nicotina, che consente nuove entusiasmanti possibilità per studiare la cinetica dell'impegno nativo del recettore nicotinico, la localizzazione subcellulare e la modulazione dell'attività neuronale mediante attivazione del recettore nicotinico.
