Ringraziamo Tran Huynh, Andrew San Antonio, Jerry Lin per la loro assistenza tecnica. Questo lavoro è stato finanziato dal National Institutes of concede Salute DA023700 e DA023700-04S1 al XX

1. Cervello fetta preparazione <ol><li> Topi transgenici sono profondamente anestetizzati con sodio pentobarbital (&gt; 100 mg / kg, ip) e rapidamente decapitati, ei loro cervelli estratti in una soluzione di taglio congelato e ossigenato. </li><li> Occhiali GFP sono usati per lo screening visivo se il cervello di topo esprime davvero GFP. </li><li> Sezioni della corteccia somatosensoriale primaria di 400 micron di spessore vengono tagliate con un vibratome in saccarosio-contenente artificiale liquido cerebrospinale (ACSF). Fette vengono prima incubati in saccarosio-contenente ACSF per 30 minuti a 1 ora a 32 ° C, e dopo il periodo di incubazione iniziale, trasferito ACSF registrazione a temperatura ambiente. In tutta l&#39;incubazione e la registrazione, le fette sono continuamente bolle con il 95% O 2 -5% di CO 2. </li></ol> 2. Attrezzature di avvio L&#39;implementazione del sistema complessivo è illustrato nella figura 1. <ol><li> Il sistema di raffreddamento laser e alimentatore è acceso, ricevendo il laser pronto. </li><li> Tutto l&#39;hardware relative al controllo fotostimolazione (compreso il sistema specchio di scansione, un modulatore ottico, un otturatore elettronico e un amplificatore di ingresso fotodiodo) è acceso. </li><li> L&#39;attrezzatura di elettrofisiologia (tra cui un amplificatore Multiclamp 700B e micromanipolatori) è acceso. Le registrazioni elettrofisiologiche, fotostimolazione, e di imaging delle preparazioni fetta sono fatte in una camera di perfusione fetta montato sul palco motorizzato del microscopio. </li><li> La telecamera di imaging (Retiga 2000, Q-imaging, Austin, TX) è acceso. Fette sono visualizzate con il microscopio in posizione verticale (BW51X, Olympus) con un contrasto a infrarossi interferenza differenziale (DIC) e epi-fluorescenza ottica attraverso il sistema di imaging. </li><li> Il software basato su Matlab EPHUS e Q-capture software della fotocamera sono state create. Un&#39;usanza modificati versione del software Ephus (Ephus, disponibile a <a href="https://openwiki.janelia.org/">https://openwiki.janelia.org/</a> ) è utilizzato per controllare i protocolli fotostimolazione e acquisire i dati fotostimolazione. </li><li> Dopo che il sistema è acceso, si dovrebbe verificare se il sistema fotostimolazione laser è in uno stato di lavoro. Poiché l&#39;obiettivo 4x microscopio viene utilizzato per fornire i lampi di raggi UV uncaging glutammato, un pezzo di carta bianca può essere messo sotto per osservare il modello di scansione laser, mentre il sistema funziona. </li></ol> 3. La creazione di perfusione fetta <ol><li> Un sistema di perfusione pressione è acceso per alimentare il ACSF registrazione nella camera fetta. La cura è presa per assicurare un livello costante del liquido di 2,0 mm al di sopra della fetta nella camera. </li><li> Un&#39;aliquota della soluzione madre di MNI-gabbia-glutammato viene aggiunto a 25 ml di circolazione ACSF per una concentrazione di 0,2 mM glutammato in gabbia. Si prega di notare che dopo 5-6 ore di sperimentazione, la soluzione bagno e MNI-glutammato sarà aggiornata. </li><li> Una fetta cervello è spostato nella camera di registrazione. Si può eseguire il sistema di imaging per verificare la qualità e la fetta anatomicamente individuare l&#39;area somatosensoriale primaria. Poi la fetta è ancorato con una misura anello in platino a corda. Fare attenzione a non mettere l&#39;ancora sopra la regione del cervello destinata per le registrazioni. </li></ol> 4. Cellula intera patch-bloccaggio di registrazione <ol><li> Elettrodi di vetro (4-6 MΩ resistenza) sono tirati e riempito con una soluzione interna contenente 0,1% biocitina per l&#39;etichettatura e identificazione morfologica delle cellule. </li><li> Per eseguire la registrazione delle patch, le cellule vengono visualizzati in l&#39;obiettivo 60x. Tipi di cellule inibitorie sono prima individuati e selezionati sulla base di visualizzazione di espressione GFP sotto un microscopio DIC / a fluorescenza Olympus, le registrazioni vengono poi eseguiti sotto il controllo visivo aiutato dal monitoraggio video a infrarossi DIC. Si prega di notare che un paio di volte di passare tra le modalità DIC e fluorescenza è necessario per confermare la posizione della cella GFP mentre si avvicina l&#39;elettrodo alla cella di destinazione. </li><li> Tradizionali tecniche di patch-bloccaggio vengono applicati. L&#39;elettrodo viene riempito con pressione positiva, si è trasferito vicino alla superficie della cellula per stabilire una fossetta visibile sulla membrana delle cellule bersaglio, e poi la pressione negativa viene applicata rapidamente per formare un gigaseal e rottura durante il monitoraggio delle risposte iniezione di corrente sul monitor video. </li><li> Al momento di rottura in, le immagini della cellula a 60x in modalità DIC e fluorescenza sono presi per la verifica on-line. Prima raccolta di dati fotostimolazione, iperpolarizzante e impulsi di corrente depolarizzante vengono iniettate per esaminare le proprietà elettrofisiologiche di base di ogni cella. </li><li> Una volta che le registrazioni stabili cellula intera si ottengono con una buona resistenza di accesso (di solito &lt;20 MΩ), l&#39;obiettivo microscopio passa da 60x a 4x per fotostimolazione scansione laser. L&#39;immagine fetta a 4x è acquisito e sarà utilizzato per la guida e la registrazione di siti fotostimolazione. </li></ol> 5. Laser scanning fotostimolazione <ol><li> I parametri di acquisizione dati e fotostimolazione è fissato dal attivando il modulo switch di configurazione Ephus. Normalmente, 1 ms laser (20 mW), con un intervallo di stimolo di 1 secondo viene utilizzato per la mappatura fotostimolazione. Tracce di dati di 1 secondo campionato a 10 kHz vengono acquisiti. </li><li> L&#39;immagine fetta 4x viene caricata nel modulo mapper di Ephus. La posizione del soma cellulare è definito, e siti fotostimolazione di uno schema 16x16 (80 micron x 80 micron spaziatura) sono costituiti intorno alla posizione della cella, che copre tutti gli strati corticali. </li><li> Il profilo di eccitazione del neurone registrato è mappata esaminando le posizioni spiking in risposta alla fotostimolazione alla modalità morsetto corrente. Il nostro software user-friendly con l&#39;on-line funzioni di visualizzazione facilita gli esperimenti di mappatura. </li><li> Locali collegamenti del circuito eccitatorio sono mappati dal rilevamento di correnti post-sinaptici eccitatori (EPSC) dalla cella registrato mentre scansione laser in luoghi diversi. La cella è tenuto a -70 mV in modalità morsetto tensione verso l&#39;interno per rilevare le correnti eccitatorie. Le mappe EPSC si ripetono 2-3 volte con il modello fotostimolazione ruotato o capovolto. </li><li> Opzionale: Locale collegamenti del circuito inibitorio può anche mappati con il rilevamento delle correnti post-sinaptiche inibitorie (IPSC) dalla cella registrata presso vicino a 0 mV in modalità morsetto tensione verso l&#39;esterno per rilevare correnti inibitorie. Si noti che è meglio usare la soluzione interna elettrodo con potassio sostituito con cesio per la mappatura IPSC. </li><li> Dopo tutte le analisi fisiologiche sono state completate, l&#39;elettrodo viene delicatamente rimosso dalla cella registrati. La fetta cervello è portato fuori e fissate in 4% paraformaldeide notte. Le cellule registrato è macchiato contro biocitina. Morfologia cellulare viene esaminato con confocale o epi-microscopia a fluorescenza, che conferma anche che ogni cellula è infatti registrato il GFP che esprimono interneurone originariamente mirati. </li></ol> 6. Fotostimolazione analisi dei dati La nostra metodologia di nuova concezione e realizzazione di software 11 è applicato alla rilevazione e misura di fotostimolazione-sinaptici evocati eventi nelle mappe di dati grezzi. Come esemplificato nella figura 2, codice colore mappe sono costruite per illustrare il modello di ingresso sinaptico al neurone registrato. 7. Rappresentante dei risultati: Risultati Esempio di registrazione elettrofisiologica e la mappatura fotostimolazione sono illustrati nella Figura 2. Registrazioni mirata di specifici tipi di cellule inibitorie sono rese possibili utilizzando topi transgenici che esprimono GFP nel noto tipi di cellule inibitorie. Data la diversità di interneuroni inibitori, analisi di espressione GFP, intrinseche caratteristiche morfologiche e di elettrofisiologia (Figura 2A) si combinano per arrivare alla classifica finale tipo di cellula. Figura 2B-C mostrano che fotostimolazione scansione laser consente la mappatura completa di connessioni locali circuito corticale a singoli neuroni inibitori. La mappa di dati grezzi è mostrato in Figura 2C. Le risposte uncaging diretti sono esclusi dalle analisi dei dati (Figura 2C). Le mappe di input quantitativi sono color-coded, mostrato in Figura 2D-F. Il fast-spiking interneuroni esempio inibitori ricevuto un forte ingresso sinaptica eccitatoria (EPSCs) da livello 4 e strati più profondi. Mettendo in relazione l&#39;organizzazione sinaptica ingresso della cellula di definire percorsi corticali, siamo in grado di inferire il suo possibile ruolo (ad esempio, le risposte e l&#39;inibizione feedforward) in elaborazione delle informazioni corticale. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3109/3109fig1.jpg" /> Figura 1. Strumentazione sistema generale di fotostimolazione scansione laser. Il nostro sistema complessivo è costituito da controllo fotostimolazione, immagini video e sistemi di registrazione elettrofisiologica. Abbiamo adottato la progettazione del sistema LSP descritto in precedenza 7,17. Una unità laser è usato per generare laser UV 355 nm per uncaging glutammato. Il raggio laser viene indirizzato attraverso il percorso ottico del nostro sistema. Brevi periodi di lampi laser (per esempio, 1 - 3 ms) sono controllati tramite un modulatore elettro-ottico (ad esempio, la cella di Pockels) e un otturatore meccanico. Potenza del fascio laser è modulato da una ruota gradiente di densità neutrale e monitorato deviando una piccola frazione del fascio laser con un coprioggetto di vetro per un fotodiodo. Il sistema di scansione laser include una coppia XY di specchi di scansione, la lente di acquisizione, la lente del tubo, e la lente obiettiva. Gli specchi consegnare il raggio laser attraverso una lente di acquisizione, poi il raggio entra nel microscopio attraverso uno specchio dicroico e si concentra da una misura permeabile ai raggi UV lente del tubo. Il raggio underfill l&#39;apertura posteriore del microscopio obiettivo di fornire più un colonnare (al contrario di forma conica) fascio illuminante, mantenendo la mappatura bidimensionale come possibile riducendo la risoluzione assiale. Sotto l&#39;obiettivo 4x, il raggio laser forme punti uncaging, ogni approximating un profilo gaussiano con una larghezza di 153 micron lateralmente al piano focale (vedi inserto). Varie posizioni di stimolazione laser può essere raggiunto attraverso galvanometri-driven specchi di scansione XY, come gli specchi e l&#39;apertura posteriore dell&#39;obiettivo sono su piani coniugati, traducendo posizioni specchio in diverse posizioni di scansione sul piano focale lente dell&#39;obiettivo. Durante uncaging, un numero variabile di siti fantasia che copre tutto il campo vengono stimolati in modo sequenziale in una nonraster, la sequenza non casuale al fine di evitare rivisitazione prossimità di siti di recente stimolato. Si prega di fare riferimento a Xu et al. (2010) per informazioni più dettagliate. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3109/3109fig2.jpg" /> Figura 2. Mappatura locali collegamenti del circuito eccitatori ad un GFP che esprimono fast-spiking interneuroni nel livello 4 del topo corteccia sensoriale primaria. A1 e A2 mostrare le immagini DIC e fluorescente GFP della cellula bersaglio a titolo dell&#39;obiettivo 60x nella fetta cervello vivente, mentre la A3 mostra la morfologia delle cellule rivelato da colorazione biocitina nel post-registrazione, fetta fisso. A4 mostra i modelli di tiro della cellula GFP registrato, caratteristica di un fast-spiking interneurone inibitorio, in risposta alle iniezioni intrasomatica attuale dei punti di forza diversi. B mostrano l&#39;immagine fetta sovrapposti con i 16 siti fotostimolazione x16 (*). La posizione della cella è indicato dal cerchietto rosso. C mostra una serie di fotostimolazione evocati tracce risposta dalle posizioni stimolo mostrato in B, mentre la cella si è tenuta a -70 mV per rilevare le correnti verso l&#39;interno eccitatori. Le diverse forme di risposte fotostimolazione sono illustrati dalle tracce in luoghi di 1 e 2, che vengono espansi e distinto nel inserto. La traccia 1 è un esempio delle risposte dirette (indicato dalla frecce rosse) al glutammato uncaging sul corpo cellulare e dendriti promximal. Altre tracce in 2 sono tipici esempi di risposte ingresso sinaptica eccitatoria (blu). Risposte dirette e ingressi sinaptici si distinguono per le loro ampiezze e latenze di risposta. D, E e F sono i colori mappe (16x16 siti) EPSC di media ampiezza, i numeri EPSC, e il primo latenza rilevato EPSC per sito, rispettivamente, per i dati grezzi mappa mostrato in C. L&#39;ampiezza media di ingresso di ogni sito stimolazione è l&#39;ampiezza media delle EPSCs nella finestra di analisi, con la risposta di base spontanea sottratto dalla risposta fotostimolazione del sito stesso. Il numero di EPSCs e l&#39;orario di arrivo o di latenza della EPSC prima rilevazione per ogni sito sono inoltre misurati e tracciati. Si prega di fare riferimento a (Shi et al., 2010) per maggiori dettagli.

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	<li>Ascoli, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Petilla+terminology:+nomenclature+of+features+of+GABAergic+interneurons+of+the+cerebral+cortex.">Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex.</a> Nature. 9, 557-568 (2008).</li><li>Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interneurons+of+the+neocortical+inhibitory+system.">Interneurons of the neocortical inhibitory system.</a> Nature. 5, 793-807 (2004).</li><li>Xu, X., Callaway, E. 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S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).</li><li>Kuhlman, S. J., Huang, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+labeling+and+functional+manipulation+of+specific+neuron+types+in+mouse+brain+by+Cre-activated+viral+gene+expression.">High-resolution labeling and functional manipulation of specific neuron types in mouse brain by Cre-activated viral gene expression.</a> PLoS ONE. 3, e2005-e2005 (2008).</li><li>Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2-assisted+circuit+mapping+of+long-range+callosal+projections.">Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections.</a> Nat Neurosci. 10, 663-668 (2007).</li><li>Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+subcellular+organization+of+neocortical+excitatory+connections.">The subcellular organization of neocortical excitatory connections.</a> Nature. 457, 1142-1145 (2009).</li><li>Cardin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Driving+fast-spiking+cells+induces+gamma+rhythm+and+controls+sensory+responses.">Driving fast-spiking cells induces gamma rhythm and controls sensory responses.</a> Nature. 459, 663-667 (2009).</li><li>Shepherd, G. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminar+and+columnar+organization+of+ascending+excitatory+projections+to+layer+2/3+pyramidal+neurons+in+rat+barrel+cortex.">Laminar and columnar organization of ascending excitatory projections to layer 2/3 pyramidal neurons in rat barrel cortex.</a> J Neurosci. 25, 5670-5679 (2005).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Fotostimolazione a base di tecniche di mappatura sono state effettivamente applicate per l&#39;analisi dei circuiti corticali. Fotostimolazione scansione laser combinato con registrazione cellula intera consente la mappatura ad alta risoluzione della distribuzione laminare di sorgenti di ingresso presinaptico di singoli neuroni, in quanto la registrazione simultanea da un neurone postsinaptico with fotostimolazione di cluster di neuroni presinaptici in molti luoghi diversi fornisce misure quantitative della distribuzione spaziale di eccitatori o input inibitorio. Questa tecnica aiutati utilizzando topi transgenici che esprimono GFP nel noto tipi di cellule inibitorie ha notevolmente facilitato il nostro lavoro attuale verso chiarire le reti locali inibitori corticali. Nello studio, ad esempio, abbiamo usato il glutammato in gabbia per attivare i neuroni in modo limitare spazialmente su uncaging laser. Va notato che uncaging glutammato può essere sostituito con fotoattivazione tramite channelrhodopsin o altre molecole fotosensibili geneticamente codificate in tipi cellulari specifici 12,13. Così la tecnica fotostimolazione è possibile individuare non solo specifiche regioni corticali ma anche specifico sottoinsieme di neuroni nel loro circuiti di partecipanti 14-16. Inoltre, abbiamo recentemente sviluppato un nuovo fotostimolazione a base di tecnica di mappatura 9 che incorpora la precisione spaziale di attivazione che può essere raggiunto con il laser-scanning fotostimolazione con la valutazione rapida e ad alta risoluzione-temporale delle attività di rete evocata che possono essere raggiunti da tensione-sensibili tintura di imaging. A differenza di combinazione di registrazioni cellula intera con fotostimolazione per la mappatura ingressi del circuito locale di neuroni individuali registrate, questa innovazione può essere utilizzato per mappare uscita corticali circuiti e connessioni funzionali a livello di popolazioni neuronali.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> topo transgenico linee </td><td> Jackson laboratorio o altre fonti </td><td></td><td> Si prega di fare riferimento a Xu e Callaway (2009) </td></tr><tr><td> GFP occhiali </td><td> BLS Ltd., Ungheria </td><td></td><td></td></tr><tr><td> vibratome </td><td> Leica Sistemi </td><td> VT1200S </td><td></td></tr><tr><td> MNI glutammato in gabbia (4-metossi-7-nitroindolinyl gabbia-l-glutammato) </td><td> Bioscience Tocris, Ellisville, MO </td><td> Cat. No. 1490 </td><td></td></tr><tr><td> biocitina </td><td></td><td> B4261 </td><td></td></tr><tr><td> elettrodo estrattore </td><td> Sutter Instrument, Novato, CA </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> tubi di vetro per fare elettrodi </td><td></td><td> BF150-86-10 </td><td></td></tr><tr><td> Multiclamp amplificatore 700B </td><td> I dispositivi molecolari, Sunnyvale, CA </td><td> Multiclamp 700B </td><td></td></tr><tr><td> fotocamera digitale CCD </td><td> Q-imaging, Austin, TX </td><td> Retiga 2000 </td><td></td></tr><tr><td> Ricerca microscopio </td><td> Olympus, Tokyo, Giappone </td><td> BW51X </td><td></td></tr><tr><td> UV laser dell&#39;unità </td><td> I laser DPSS, Santa Clara, CA </td><td> modello 3501 </td><td></td></tr><tr><td> Altre attrezzature per phostimulation scansione laser </td><td></td><td></td><td> Si prega di fare riferimento a Xu et al (2010). </td></tr></tbody></table> Soluzioni: <ul><li> Saccarosio-contenente artificiale liquido cerebrospinale (ACSF) per il taglio fetta (in mm: 85 NaCl, 75 saccarosio, 2.5 KCl, 25 di glucosio, 1,25 NaH 2 PO 4, 4 MgCl 2, 0,5 CaCl 2, e 24 NaHCO 3). </li><li> Registrazione ACSF (in mm: 126 NaCl, 2.5 KCl, 26 NaHCO 3, 2 CaCl 2, 2 MgCl 2, 1,25 NaH 2 PO 4, e 10 di glucosio) </li><li> Elettrodo soluzione interna (in mm: 126 K-gluconato, 4 KCl, 10 HEPES, 4 ATP-Mg, 0.3 GTP-Na, e 10 fosfocreatina, pH 7,2, 300 mOsm). </li></ul>

mapping inhibitory neuronal circuits by laser scanning photostimulation

Neuroni inibitori sono cruciali per la funzione corticale. Essi comprendono circa il 20% dell&#39;intera popolazione neuronale corticale e può essere ulteriormente suddiviso in sottotipi diversi in base alle loro proprietà immunochimica, morfologiche, fisiologiche e 1-4. Sebbene precedenti ricerche hanno rivelato molto sulle proprietà intrinseche dei singoli tipi di neuroni inibitori, la conoscenza sulle loro connessioni circuito locale è ancora relativamente limitato 3,5,6. Dato che la funzione di ogni singolo neurone è plasmato da suo input eccitatori e inibitori sinaptica nei circuiti corticali, abbiamo usato scansione laser fotostimolazione (LSP) per le connessioni del circuito mappa locale a specifici tipi di cellule inibitorie. Rispetto alle tradizionali stimolazione elettrica o stimolazione sfoglia glutammato, LSP ha vantaggi unici consentendo la mappatura estesa e analisi quantitativa di locali funzionali alla ingressi individualmente registrato neuroni 3,7-9. Fotostimolazione laser tramite uncaging glutammato attiva selettivamente i neuroni perisomatically, senza attivare gli assoni di passaggio o dendriti distali, che assicura una risoluzione sub-laminare mappatura. La sensibilità e l&#39;efficienza di LSP per gli ingressi mappatura da molti siti di stimolazione su una regione di grandi dimensioni sono adatte per l&#39;analisi dei circuiti corticali. Qui vi presentiamo la tecnica di LSP combinato con whole-cell patch di bloccaggio per la mappatura dei locali del circuito inibitorio. Registrazioni mirata di specifici tipi di cellule inibitorie sono facilitate con l&#39;uso di topi transgenici che esprimono proteine ​​verde fluorescente (GFP) in popolazioni limitate neuroni inibitori nella corteccia 3,10, che consente di campionamento coerente del tipi di cellule bersaglio e una chiara identificazione dei tipi di cellule registrato . Per quanto riguarda la mappatura LSP, delineiamo la strumentazione del sistema, descrivere la procedura sperimentale e acquisizione dati, e presentare esempi di mappatura circuito corteccia somatosensoriale primaria del mouse. Come illustrato nei nostri esperimenti, glutammato in gabbia si attiva in una regione nello spazio ristretto della fetta cervello fotolisi laser UV; simultanea voltage-clamp registrazioni consentono di individuare fotostimolazione evocati risposte sinaptica. Mappe di ingresso sia sinaptica eccitatoria o inibitoria al neurone bersaglio sono generati dalla scansione del fascio laser di stimolare centinaia di potenziali siti presinaptici. Così, LSP consente la costruzione di mappe dettagliate di ingressi sinaptici che influiscono su particolari tipi di neuroni inibitori attraverso esperimenti ripetuti. Nel loro insieme, la fotostimolazione tecnica basata neuroscienziati offre un potente strumento per determinare l&#39;organizzazione funzionale dei locali dei circuiti corticali.

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Mapping Inhibitory Neuronal Circuits by Laser Scanning Photostimulation

Questo documento introduce un approccio di combinare fotostimolazione scansione laser con registrazioni cellula intera in topi transgenici che esprimono GFP in popolazioni limitate neuroni inibitori. La tecnica permette per la mappatura estesa e analisi quantitativa dei locali circuiti sinaptici di specifici neuroni inibitori corticali.

Mappatura dei circuiti neuronali inibitori da fotostimolazione scansione laser

Inhibitory neurons are crucial to cortical function. They comprise about 20% of the entire cortical neuronal population and can be further subdivided into ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.2K Views.  University of California, Irvine. Questo documento introduce un approccio di combinare fotostimolazione scansione laser con registrazioni cellula intera in topi transgenici che esprimono GFP in popolazioni limitate neuroni inibitori. La tecnica permette per la mappatura estesa e analisi quantitativa dei locali circuiti sinaptici di specifici neuroni inibitori corticali.

Video: Mapping Inhibitory Neuronal Circuits by Laser Scanning Photostimulation

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Veloce micro-ionoforesi di glutammato e GABA: un utile strumento per indagare l&#39;integrazione Synaptic

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

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Neuroscienze

Laser-scanning Photostimulation of Optogenetically Targeted Forebrain Circuits

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the interactions of these forebrain circuits has been aided recently by the development of optogenetic methods for light-mediated modulation of neuronal activity. Here, we describe a protocol for examining the functional organization of forebrain circuits&#160;in vitro using laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin, expressed optogenetically via viral-mediated transfection. This approach also exploits the utility of cre-lox recombination in transgenic mice to target expression in specific neuronal cell types. Following transfection, neurons are physiologically recorded in slice preparations using whole-cell patch clamp to measure their evoked responses to laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin expressing fibers. This approach enables an assessment of functional topography and synaptic properties. Morphological correlates can be obtained by imaging the neuroanatomical expression of channelrhodopsin expressing fibers using confocal microscopy of the live slice or post-fixed tissue. These methods enable functional investigations of forebrain circuits that expand upon more conventional approaches.

We describe a method for characterizing the functional topography and synaptic properties of forebrain circuits using an optogenetic approach to photostimulate neuronal populations&#160;in vitro.

Laser-scanning Fotostimolazione di circuiti prosencefalo Optogenetically mirati

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

Indurre Plasticità di astrociti recettori per manipolazione del neuronali di cottura Prezzi

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Design, Surface Treatment, Cellular Plating, and Culturing of Modular Neuronal Networks Composed of Functionally Inter-connected Circuits

The brain operates through the coordinated activation and the dynamic communication of neuronal assemblies. A major open question is how a vast repertoire of dynamical motifs, which underlie most diverse brain functions, can emerge out of a fixed topological and modular organization of brain circuits. Compared to in vivo studies of neuronal circuits which present intrinsic experimental difficulties, in vitro preparations offer a much larger possibility to manipulate and probe the structural, dynamical and chemical properties of experimental neuronal systems. This work describes an in vitro experimental methodology which allows growing of modular networks composed by spatially distinct, functionally interconnected neuronal assemblies. The protocol allows controlling the two-dimensional (2D) architecture of the neuronal network at different levels of topological complexity.
A desired network patterning can be achieved both on regular cover slips and substrate embedded micro electrode arrays. Micromachined structures are embossed on a silicon wafer and used to create biocompatible polymeric stencils, which incorporate the negative features of the desired network architecture. The stencils are placed on the culturing substrates during the surface coating procedure with a molecular layer for promoting cellular adhesion. After removal of the stencils, neurons are plated and they spontaneously redirected to the coated areas. By decreasing the inter-compartment distance, it is possible to obtain either isolated or interconnected neuronal circuits. To promote cell survival, cells are co-cultured with a supporting neuronal network which is located at the periphery of the culture dish. Electrophysiological and optical recordings of the activity of modular networks obtained respectively by using substrate embedded micro electrode arrays and calcium imaging are presented. While each module shows spontaneous global synchronizations, the occurrence of inter-module synchronization is regulated by the density of connection among the circuits.

This manuscript describes a protocol to grow in vitro modular networks consisting of spatially confined, functionally inter-connected neuronal circuits. A polymeric mask is used to pattern a protein layer to promote cellular adhesion over the culturing substrate. Plated neurons grow on coated areas establishing spontaneous connections and exhibiting electrophysiological activity.

Design, Trattamento delle superfici, Cellular placcatura, e Coltura di neuronali modulari reti composte di circuiti funzionalmente interconnessi

The brain operates through the coordinated activation and the dynamic communication of neuronal assemblies. A major open question is how a vast repertoire ...

Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake through electroporation in brain explants with targeted laser illumination and matching filter goggles during the procedure. The described technique of in vitro electroporation by itself yields relatively good visual control for targetting certain areas of the brain. By combining it with laser excitation of fluorescent genetic markers and their read-out through band-passing filter goggles, which can pick up the emissions of the genetically labeled cells/nuclei and the fluorescent tracing dye, a researcher can substantially increase the accuracy of injections by finding the area of interest and controlling for the dye-spread/uptake in the injection area much more efficiently. In addition, the laser illumination technique allows to study the functionality of a given neurocircuit by providing information about the type of neurons projecting to a certain area in cases where the GFP expression is linked to the type of transmitter expressed by a subpopulation of neurons.

We describe a technique to label neurons and their processes via anterograde or retrograde tracer injections into brain nuclei using an in vitro preparation. We modified an existing method of in vitro tracer electroporation by taking advantage of fluorescently labeled mouse mutants and basic optical equipment in order to increase labeling accuracy.

Neuronal Tracing negli espianti cerebrali a guida laser

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...

Rewiring Neuronal Circuits: A New Method for Fast Neurite Extension and Functional Neuronal Connection

Brain and spinal cord injury may lead to permanent disability and death because it is still not possible to regenerate neurons over long distances and accurately reconnect them with an appropriate target. Here a procedure is described to rapidly initiate, elongate, and precisely connect new functional neuronal circuits over long distances. The extension rates achieved reach over 1.2 mm/h, 30-60 times faster than the in vivo rates of the fastest growing axons from the peripheral nervous system (0.02 to 0.04 mm/h)28 and 10 times faster than previously reported for the same neuronal type at an earlier stage of development4. First, isolated populations of rat hippocampal neurons are grown for 2-3 weeks in microfluidic devices to precisely position the cells, enabling easy micromanipulation and experimental reproducibility. Next, beads coated with poly-D-lysine (PDL) are placed on neurites to form adhesive contacts and pipette micromanipulation is used to move the resulting bead-neurite complex. As the bead is moved, it pulls out a new neurite that can be extended over hundreds of micrometers and functionally connected to a target cell in less than 1 h. This process enables experimental reproducibility and ease of manipulation while bypassing slower chemical strategies to induce neurite growth. Preliminary measurements presented here demonstrate a neuronal growth rate far exceeding physiological ones. Combining these innovations allows for the precise establishment of neuronal networks in culture with an unprecedented degree of control. It is a novel method that opens the door to a plethora of information and insights into signal transmission and communication within the neuronal network as well as being a playground in which to explore the limits of neuronal growth. The potential applications and experiments are widespread with direct implications for therapies that aim to reconnect neuronal circuits after trauma or in neurodegenerative diseases.

This procedure describes how to rapidly initiate, extend and connect neurites organized in microfluidic chambers using poly-D-lysine-coated beads fixed to micropipettes that guide neurite elongation.

Circuiti neuronali riavvolgenti: un nuovo metodo per l&#39;estensione veloce del neurite e la connessione neuronale funzionale

Brain and spinal cord injury may lead to permanent disability and death because it is still not possible to regenerate neurons over long distances and ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a closed-loop event-triggered manner. Although many studies are focusing on the possible benefits and side-effects of TES in healthy and pathologic brains, there are still many fundamental open questions regarding the mechanism of action of the stimulation. Therefore, there is a clear need for a robust and reproducible method to test the acute and the chronic effects of TES in rodents. TES can be combined with regular behavioral, electrophysiological, and imaging techniques to investigate neuronal networks in vivo. The implantation of transcranial stimulation electrodes does not impose extra constraints on the experimental design while it offers a versatile, flexible tool to manipulate brain activity. Here we provide a detailed, step-by-step protocol to fabricate and implant transcranial stimulation electrodes to influence brain activity in a temporally constrained manner for months.

This detailed protocol describes transcranial stimulation electrode placement on the temporal bone in order to investigate the short- and long-term effects of transcranial electrical stimulation in freely moving rats.

Stimolazione elettrica transcranica cronica e registrazione intracorticale in ratti

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a workflow on how to combine artificial microRNA (miR)-mediated RNA interference with optogenetics to achieve selective stimulation of manipulated presynaptic boutons in acute brain slices. The experimental approach involves the use of a single viral construct and a single neuron-specific promoter to drive the expression of both an optogenetic probe and artificial miR(s) against presynaptic gene(s). When stereotactically injected in the brain region of interest, the expressed construct makes it possible to stimulate with light exclusively the neurons with reduced expression of the gene(s) under investigation. This strategy does not require the development and maintenance of genetically modified mouse lines and can in principle be applied to other organisms and to any neuronal gene of choice. We have recently applied it to investigate how the knockdown of alternative splice isoforms of presynaptic P/Q-type voltage-gated calcium channels (VGCCs) regulates short-term synaptic plasticity at CA3 to CA1 excitatory synapses in acute hippocampal slices. A similar approach could also be used to manipulate and probe the neuronal circuitry in vivo.

This protocol provides a workflow on how to combine artificial microRNA-mediated RNA interference with optogenetics to stimulate specifically presynaptic boutons with reduced expression of selective gene(s) within intact neuronal circuits.

Combinando optogenetica con microRNA artificiali per caratterizzare gli effetti del Gene atterramento su funzione presinaptica all'interno di circuiti neuronali intatto

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools to selectively manipulate brain rhythms. Here we describe an approach combining projection-specific optogenetics with extracellular electrophysiology for high-fidelity control of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The specificity of the optogenetic entrainment is achieved by targeting channelrhodopsin-2 (ChR2) to the GABAergic population of medial septal cells, crucially involved in the generation of hippocampal theta oscillations, and a local synchronized activation of a subset of inhibitory septal afferents in the hippocampus. The efficacy of the optogenetic rhythm control is verified by a simultaneous monitoring of the local field potential (LFP) across lamina of the CA1 area and/or of neuronal discharge. Using this readily implementable preparation we show efficacy of various optogenetic stimulation protocols for induction of theta oscillations and for the manipulation of their frequency and regularity. Finally, a combination of the theta rhythm control with projection-specific inhibition addresses the readout of particular aspects of the hippocampal synchronization by efferent regions.

We describe the use of optogenetics and electrophysiological recordings for selective manipulations of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The efficacy of the rhythm entrainment is monitored using local field potential. A combination of opto- and pharmacogenetic inhibition addresses the efferent readout of hippocampal synchronization.

Optogenetica trascinamenti di teta Hippocampal oscillazioni nel comportarsi topi

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively thin to properly visualize and access neurons for patch-clamping or imaging, and in vitro examination of brain circuitry is limited to only what is physically present in the acute slice. To maintain the benefits of in vitro slice experimentation while preserving a larger portion of presynaptic nuclei, we developed a novel slice preparation. This &#8220;wedge slice&#8221; was designed for patch-clamp electrophysiology recordings to characterize the diverse monaural, sound-driven inputs to medial olivocochlear (MOC) neurons in the brainstem. These neurons receive their primary afferent excitatory and inhibitory inputs from neurons activated by stimuli in the contralateral ear and corresponding cochlear nucleus (CN). An asymmetrical brain slice was designed which is thickest in the rostro-caudal domain at the lateral edge of one hemisphere and then thins towards the lateral edge of the opposite hemisphere. This slice contains, on the thick side, the auditory nerve root conveying information about auditory stimuli to the brain, the intrinsic CN circuitry, and both the disynaptic excitatory and trisynaptic inhibitory afferent pathways that converge on contralateral MOC neurons. Recording is performed from MOC neurons on the thin side of the slice, where they are visualized using DIC optics for typical patch-clamp experiments. Direct stimulation of the auditory nerve is performed as it enters the auditory brainstem, allowing for intrinsic CN circuit activity and synaptic plasticity to occur at synapses upstream of MOC neurons. With this technique, one can mimic in vivo circuit activation as closely as possible within the slice. This wedge slice preparation is applicable to other brain circuits where circuit analyses would benefit from preservation of upstream connectivity and long-range inputs, in combination with the technical advantages of in vitro slice physiology.

Integration of diverse synaptic inputs to neurons is best measured in a preparation that preserves all pre-synaptic nuclei for natural timing and circuit plasticity, but brain slices typically sever many connections. We developed a modified brain slice to mimic in vivo circuit activity while maintaining in vitro experimentation capability.

Preparazione della fetta di cuneo in vitro per imitare la connettività del circuito neuronale in vivo

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...

Mappatura dei circuiti neuronali inibitori da fotostimolazione scansione laser

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Veloce micro-ionoforesi di glutammato e GABA: un utile strumento per indagare l'integrazione Synaptic