Antonio Renda è stata sostenuta da una Università di Victoria Graduate Fellowship Award. Questa ricerca è stata sostenuta da un scienze naturali e ingegneria Research Council of Canada Discovery Grant, uno NARSAD Young Investigator Award (per RN), una Fondazione Victoria - Myre e Winifred Sim Fund, una Fondazione canadese per l&#39;innovazione sovvenzione, un Fondo di conoscenza Columbia Britannica per lo sviluppo e scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada strumenti di ricerca e Grant Strumentazione. Ringraziamo Jillian McKay, Christina Barnes, Ariel Sullivan, Jennifer MacDonald e Daniel Morgado per l&#39;allevamento del mouse eccellente.

1. Pompa impianto <ol><li> Prima dell&#39;impianto della pompa, riempire e preparare le Alzet mini-pompe osmotiche (Alzet, Modello 2002, Cupertino, USA) facendo attenzione a non introdurre bolle d&#39;aria. Questo modello di mini-osmotica pompa eroga soluzione ad una velocità di 0,5 pl / h per 14 giorni. Garantire condizioni di sterilità. Pesare pompe di vuoti e pieni. Al termine dell&#39;esperimento (10 giorni dopo l&#39;impianto), il liquido rimanente nel pompa può essere rimosso con una siringa e pesato per calcolare il volume pompato. </li><li> Le pompe con soluzione di controllo contengono salina (0,9% w / v, Teknova, S5819, Hollister, USA). Per preparare la soluzione di nicotina, una soluzione stock 1 M di (-)-nicotina sale tartrato acido (Sigma, cat # N5260) viene diluito in soluzione salina (0,9% w / v) e sterilizzato per filtrazione attraverso una siringa 0,22 um-end filtro. Abbiamo precedentemente somministrato nicotina a 0,4 e 2 mg / kg / hr (calcolato in base libera di nicotina) per 10 giorni. </li><li> Preparare tre bagni salina (tre10 salina centimetri riempito capsule di Petri). Una volta che la pompa è stato riempito e sigillato, lavare accuratamente la pompa di ogni bagno successive soluzione fisiologica per rimuovere eventuali tracce del farmaco sul guscio esterno. Immergere riempito pompe in soluzione salina per lo stoccaggio fino a un intervento chirurgico, mantenendo il controllo e le pompe di nicotina in contenitori separati saline. </li><li> Per favorire una ripresa sana e ridurre il rischio di infezione post-chirurgica, hanno gabbie pulite preparati a lungo termine di recupero. </li><li> Per la ripresa a breve termine subito dopo l&#39;intervento, preparare una gabbia contenente un rilievo di riscaldamento e una lampada di calore. </li><li> Per esaminare gli effetti della nicotina cronici dobbiamo 5-6 α4YFP omozigote knock-in topi (2-3 mesi) in ciascun gruppo (di controllo o di nicotina). Il knock-in α4YFP linea di topi sono stati re-incrociata per 10 generazioni, al ceppo di topi C57BL/6J. Facciamo che l&#39;età e il sesso di tutti i topi sono uguali per lo studio e che tutti gli interventi chirurgici vengono eseguiti nello stesso giorno per ridurre al minimo la variabilità. Per impedire HYpothermia ai topi durante e dopo l&#39;intervento chirurgico, dotare tavolo operatorio con un tampone sterile riscaldante rivestito in telo chirurgico. </li><li> Indurre il α4YFP topo knock-in con 3 L / min di ossigeno e il 3% isoflurano e poi mantenere l&#39;anestesia a 2,5 L / min di ossigeno e 1% isoflurano. Noi preferiamo anestesia con isoflurano causa a completamento dell&#39;intervento isoflurano cancella il sistema rapido ed i topi sono consapevoli e mobile all&#39;interno ~ 2 min. Applicare collirio immediatamente (tear-Gel, Novartis) per evitare danni alla cornea. </li><li> Le pompe sono impiantato per via sottocutanea attraverso un&#39;incisione cutanea sul retro del collo e la pompa viene spinto caudalmente lungo il dorso della schiena. Pulire l&#39;area sul retro tra le zampe anteriori con 95% di etanolo al matte la pelliccia. Pizzicare la pelle con 0,8 mm pinza Graefe (strumenti per le scienze Belle 11050-10) e fare un cm 1 taglio centrale laterale che utilizza le forbici iris (strumenti per le scienze Belle, 14060-10). </li><li> Per creare uno spazio sottocutaneo per la pompa, inserire forbice modello standards (Strumenti Scienza Arti, 14101-14), nell&#39;incisione e spingere con la massima attenzione verso la fine caudale dell&#39;animale. </li><li> Utilizzando 1.0 mm pinze Graefe (strumenti per le scienze Belle, 11650-10), rimuovere la pompa dal salino. Tenere le pinze aperte mediante incisione e inserire la pompa nell&#39;incisione con il tappo pompa osmotica affacciata all&#39;estremità caudale dell&#39;animale e spingere la pompa al fine caudale. </li><li> Pinch ferita chiusa 0,8 mm con pinze e applicare una quantità adeguata di Vetbond (3M, cat # 1469SB) colla. Tenere premuto fino a quando ferita è sigillata. </li><li> Rimuovere l&#39;animale dalla maschera isoflurano, iniettare con l&#39;analgesico, meloxicam (0,1 mg / kg sc), e il luogo in un breve termine gabbia di recupero fino al cosciente e mobile. Quindi mettere in un lungo periodo di recupero con gabbia ad libitum cibo e acqua a disposizione. </li></ol> 2. α4YFP knock-in fissazione mouse perfusione intracardiaca <ol><li> Fai soluzioni un giorno prima procedura e lasciare a 4 ° C. Per minimizzare la variabilità tutti i topisaranno perfusi lo stesso giorno e con lo stesso lotto di soluzioni. </li><li> Eseguire fissazioni di perfusione in una zona ben ventilata. Linea Flush della pompa peristatic (Load Masterflex Easy, 7518-00; Masterflex Pump Controller, 60.648) con ddh 2 O. </li><li> Aggiungi ~ 0.0015g di eparina (Sigma, cat # H4784), un anticoagulante, a 20 ml di PBS pH 7,6 (Invitrogen, cat # 70011). </li><li> Anestetizzare α4YFP knock-in topo iniettando per via intramuscolare una miscela di ketamina (25 mg / kg, la salute degli animali Wyeth) e cloridrato medatomidine (0,25 mg / kg, Pfizer) nel muscolo della zampa posteriore e collocare immediatamente l&#39;animale di nuovo nella sua gabbia di casa. </li><li> Pin animale ad un coperchio di polistirolo inserito in un vassoio di metallo. Pulire torace con il 95% di etanolo. Pinch pelle con Adson pinza (strumenti per le scienze Belle 91106-12) e tagliare aprire la cassa toracica con le forbici iris. Fissare la cassa toracica con un emostatico ultra fine (strumenti per le scienze Belle 13021-12) ed esporre il cuore. </li><li> Iniziare a pompare PBS a 4 ml / min ed iNSERIRE un ago 23G farfalla (Becton Dickinson, 367.253) nel ventricolo sinistro dell&#39;animale. Immediatamente snip l&#39;atrio destro per permettere al sangue e perfusato a fuggire. </li><li> Perfondere 20 ml di PBS (pH 7,6), quindi 30 ml di paraformaldeide al 4% (pH 7,6, diluito con PBS da un archivio di PFA 16%, Sciences microscopia elettronica, cat # 15.710), quindi 20 ml di 5% di saccarosio (pH 7,6) . Abbiamo scoperto che più aumenta la fissazione autofluorescenza. Perfusione con 5% di saccarosio risciacqua residua PFA dal cervello, che abbassa autofluorescenza. </li><li> Togliere il cervello e conservare nel 30% di saccarosio per 3 giorni. </li><li> Per congelare il cervello per il sezionamento coronale, tagliare il cervelletto con una lametta e il cervello svolge in uno stampo in plastica embedding (VWR, cat # 18986-1) parte rostrale e immergerlo in Compound ottobre montaggio (Tissue-Tek, cat # 4583) . Congelare in ghiaccio secco e conservare a -20 ° C prima di affettarlo. </li><li> Sezione cervelli (30 micron di spessore) su un criostato e poi il trasferimento al vetrini rivestiti. Conservare le sezioni di cervello a -20 &amp;deg; C in scatole di diapositive contenenti una pietra solfato di calcio anidro. La casella di scorrimento dovrebbe essere in un sacchetto di chiusura lampo sigillato per evitare l&#39;umidità e la successiva masterizzazione freezer, se conservato a -20 ° C. </li></ol> 3. Imaging nAChRs fluorescenti a spettrale microscopia confocale <ol><li> Assicurarsi diapositive hanno una minima esposizione a qualsiasi fonte di luce per ridurre al minimo photobleaching. </li><li> Coprioggetti i vetrini cerebrali sezione con un mezzo di fissaggio che non inibisce la fluorescenza proteina fluorescente. Abbiamo un buon successo con Mowiol 4-88 (pH 8,5 in Tris-HCl e glicerolo, EMD-Calbiochem, cat # 475904), che indurisce dopo poche ore. Assicurarsi che il Mowiol equilibra a temperatura ambiente prima di scivolare coperchio in modo da evitare bolle d&#39;aria. Non usare lo smalto quando si coperchio scivolare come spegnerà fluorescenza YFP. </li><li> Le immagini vengono acquisite utilizzando una Nikon C1si sistema spettrale microscopio confocale. Dettagli per il calcolo delle spettrale confocale e unmixing lineari sono provvisted altrove 13-15. Il razionale per l&#39;utilizzo di un microscopio confocale spettrale è che il tessuto cerebrale fisso ha autofluorescenza intrinseca. Spectral confocale sul C1si Nikon utilizza un array di 32 rilevatori di tubi fotomoltiplicatori quel campione un determinato intervallo di lunghezze d&#39;onda della luce fluorescente emessa, rifratta spazialmente nelle sue diverse lunghezze d&#39;onda tramite un elemento dispersivo reticolo proprio come un prisma di rifrazione della luce bianca in un arcobaleno di colori 16. Che cosa è raccolto lambda è una pila di immagini - immagini raccolte in diverse lunghezze d&#39;onda della luce in modo che uno spettro di emissione sono raccolti per ogni pixel di una pila di immagini lambda. Poiché YFP autofluorescenza e tessuti hanno ciascuno caratteristici firme spettrali, la pila lambda possono essere deconvolved utilizzando un algoritmo lineare unmixing algebrica in YFP separato e segnali autofluorescenti (Fig. 2). Così, quantificazione molto accurata di YFP fluorescenza può essere determinato anche in tessuto con livelli significativi di autofluorescence. </li><li> Le diverse impostazioni possono essere regolate per ottimizzare la qualità dell&#39;immagine e l&#39;efficienza di raccolta fluorescenza. Ci riporterà le impostazioni che usano di solito, ma queste impostazioni possono essere regolate a seconda del campione e il microscopio confocale. Per quantificare con precisione i cambiamenti nell&#39;espressione subunità α4YFP con la nicotina cronica garantire che il livello di scala di grigio di intensità dei segnali di tutti i pixel sono al di sotto del valore di saturazione (&lt;4.095 per 12 bit scala di grigio). Inoltre, per accogliere potenziale aumento del segnale a causa della sovra-regolazione del recettore regolando le impostazioni confocale in modo che i pixel sono circa un terzo del valore di saturazione (~ 1300-1400) o meno. Una volta che le impostazioni sono ottimizzate, le impostazioni vengono mantenute identiche per tutte le sessioni di imaging e di campioni. </li><li> Usiamo le seguenti impostazioni per l&#39;imaging α4YFP utilizzando un olio di 60X CFI Plan Apo VC obiettivo (NA 1,40, 0,13 mm di distanza lavoro): 488 nm laser linea al 15% di trasmissione massima di 40 mW Argon laser, Guadagno rivelatore spettrale a 220, gamma spettrale ripreso da 496,5 a 656,5 nm nm a 5 risoluzione nm, 512 x 512 pixel su un um x 50 um zona 50, una dimensione media foro (60 diam um), un pixel 4,08 tempo di sosta, media di oltre due scansioni e 12 bit di scala di grigi. </li></ol> 4. Unmixing lineare di immagini spettrali confocale e analisi di immagine <ol><li> Per eseguire lineare unmixing spettrale su un&#39;immagine campione prelevato con un microscopio confocale spettrale, si deve prima acquisire uno spettro di riferimento per YFP e uno spettro di riferimento per autofluorescenza dei tessuti. </li><li> Un requisito importante per qualsiasi spettro di riferimento è quello di ottenere un segnale alto a spettro del rumore di fluorescenza ripreso con la linea laser stessa utilizzata per l&#39;imaging dei campioni. Sebbene la linea laser 514 nm di Argon ha una maggiore efficienza di eccitazione per eccitare YFP preferiamo YFP immagine con la linea 488 nm del laser perché vi è una migliore separazione dal picco di emissione della YFP e la linea 488 nm è meno likely di falsare la vetta e si può ottenere l&#39;intero spettro di emissione YFP tra cui l&#39;ascesa al picco. Abbiamo YFP immagine solubile transfettato in una linea cellulare in modo che un segnale YFP forte e si ottiene lo spettro YFP risultante viene memorizzato nella nostra libreria di spettri di riferimento. Α4YFP trasfettate sopra espressa in linee cellulari possono anche essere utilizzati in quanto fornirà un segnale alto alla spettro di fondo. </li><li> Per ottenere uno spettro di riferimento di autofluorescenza ci autofluorescenza immagine da una sezione di tipo selvatico cervello di topo dalle varie regioni del cervello che abbiamo intenzione di immagine dal mouse α4YFP e ottenere la loro spettri corrispondente. Usiamo la stessa linea laser, 488 nm, e l&#39;immagine con parametri quasi identici, anche se possono alterare il guadagno del rivelatore, l&#39;intensità del laser o eseguire l&#39;imaging media per massimizzare il segnale al rumore. </li><li> Dopo aver ottenuto una immagine confocale spettrale da una regione del cervello di topo α4YFP, l&#39;immagine viene poi deconvolved nella sua YFP e autofluorsegnali escence applicando un algoritmo lineare unmixing spettrale utilizzando lo spettro di riferimento della YFP e lo spettro di riferimento di autofluorescenza del mouse tipo selvatico della stessa regione cerebrale. </li><li> L&#39;immagine α4YFP miscelato può poi essere aperto in un software di analisi di immagine come ImageJ ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ) e quindi l&#39;intensità media dei pixel viene calcolato per la regione di interesse. Un plugin per ImageJ chiamato &quot;loci_tools.jar&quot; ( <a href="http://www.loci.wisc.edu/bio-formats/imagej" target="_blank">http://www.loci.wisc.edu/bio-formats/imagej</a> ) può essere utilizzato per importare Nikon ics / ids file confocale. </li><li> Si ripete la stessa unmixing lineare spettrale e analisi di tipo selvatico topi nella stessa regione cerebrale per ottenere un valore residuo di fondo. </li><li> Poi, si ottiene la corretta intensità α4YFP media sottraendo il valore residuo di fondo (4.6) dal valore medio non corretta α4YFP (4.5). </li></ol> 5. Risultati rappresentativi Abbiamo mostra una proiezione rappresentante vero colore di una pila lambda di immagini del habenula mediale da un topo omozigote α4YFP (Fig. 3A) preso con un microscopio confocale spettrale. Abbiamo inoltre mostra lo spettro di emissione da una regione di interesse contenente α4YFP neuroni positivi dalla stessa immagine pila lambda (fig. 3B). Un picco di emissione distinta è evidente a ~ 527 nm, che è il picco di emissione di fluorescenza di YFP. La regione confinante con lo habenula mediale presenta uno spettro di emissione manca un picco spettrale a 527 nm, che indica l&#39;assenza di α4YFP subunità nAChR. Dopo lineare unmixing spettrale utilizzando spettri di riferimento YFP e cervello autofluoresence topo con sovrapposizione significative di emissione (Fig. 4), la separazione dei segnali e YFP autofluorescente è possibile cedimento un&#39;immagine α4YFP mescolate, un&#39;immagine autofluorescente mescolate e un canale resto. La localizzazione di chiara influenza α4YFPorescence può essere identificato nel soma fitto del menisco mediale habenula (Fig. 4). Nel α4YFP ippocampo è localizzato principalmente nel percorso perforante mediale, la temporo-ammonico percorso e il alveus 12. Questi sono tutti innervazione glutamatergica dell&#39;ippocampo. Abbiamo esaminato gli effetti della nicotina cronica sull&#39;espressione α4YFP nel percorso perforante ippocampale (Fig. 5). La somministrazione cronica di nicotina (2 mg / kg / ora per 10 giorni) ha determinato un aumento significativo (69 ± 14%) in α4YFP fluorescenza da topi di controllo trattati con soluzione salina per topi alla nicotina cronici trattati (p = 0,001, test di Wilcoxon rank sum) ( Fig. 5). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3516/3516fig1.jpg" /> Figura 1. Diagramma di flusso che mostra procedura per l&#39;immagine cambia in subunità nAChR α4YFP con nicotina cronica. Mini-osmotici pompe sono riempita di soluzione fisiologica o nicotina e impiantato per via sottocutanea in &amp; alpha; 4YFP topi omozigoti. Dopo 10 giorni i topi sono perfusi e fissate con paraformaldeide al 4% e il cervello del mouse sono sezionate (30 micron di spessore) su vetrini. La sezione di cervello è ripreso su un microscopio confocale spettrale (Nikon C1si) e spettralmente puro nella YFP immagini e autofluorescente. Poi le immagini vengono analizzate α4YFP ulteriormente con il software ImageJ. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3516/3516fig2.jpg" /> Figura 2. Un diagramma schematico di una pila lambda ripreso da un microscopio confocale spettrale e linearmente puro nella sue componenti spettrali. (A) Una pila lambda di immagini viene raccolta. (B) Una pila lambda consiste di immagini raccolte a differenti lunghezze d&#39;onda in modo che uno spettro di emissione viene raccolto per ciascun pixel attraverso l&#39;intera pila. (C) Poiché YFP e autofluorescenza dei tessuti hanno ciascuno caratteristiche firme spettrali, lo stack lambda può essere deconvolved utilizzando un algoritmo lineare unmixing algebrica in sYFP eparate e segnali autofluorescenti. Così, quantificazione molto accurata di YFP fluorescenza può essere determinato anche in tessuto con elevati livelli di autofluorescenza. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3516/3516fig3.jpg" /> Figura 3. Confocale spettrale immagine di una regione del cervello che esprime nAChRs α4YFP. (A) A proiezione vero colore di una pila lambda di immagini del habenula mediale da un mouse α4YFP presa con un microscopio Nikon C1si spettrale confocale. (B) Piazzole di spettri di una regione di interesse, che comprende i neuroni contenenti α4YFP (verde), ed una regione di interesse al di fuori del habenula mediale (rosso). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3516/3516fig4.jpg" /> Figura 4. Lineare unmixing spettrale del habenula mediale. (A) Immagini di α4YFP non miscelati e (B) a seguito di autofluorescenza unmixing lineare spettrale. (C) spettri di riferimento YFP (verde triangoli) e autofluorescenza (cerchi gialli) utilizzato per unmixing spettrale. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3516/3516fig5.jpg" /> Figura 5. Upregulation di a4 nAChRs nell&#39;ippocampo di α4YFP knock-in topi esposti alla nicotina cronica. (A) Un montaggio di piastrelle α4YFP fluorescenza dall&#39;ippocampo. Le due aree di selezione sono tratteggiate le posizioni approssimative sulla parte inferiore del percorso perforante dell&#39;ippocampo in cui sono state eseguite analisi per ciascun topo. (B) α4YFP fluorescenza è stata significativamente maggiore nel percorso perforante di topi esposti alla nicotina cronica della soluzione salina cronica (*, p = 0,001, test di Wilcoxon rank sum). I risultati rappresentano la media ± SEM di n = 20 misure per topi alla nicotina sia saline e cronica trattati (5 topi per ogni gruppo di trattamento). <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/3516/3516fig6.jpg" /> Figura 6. Meglio despressione di epth α4YFP rispetto all&#39;etichettatura degli anticorpi. XZ viste ortogonali di α4YFP fluorescenza (A) e VGlut2 anticorpo con Cy5 come etichetta secondaria (B). (C) grafici che mostrano una maggiore intensità del segnale di fluorescenza degradazione della profondità di colorazione anticorpale (quadrati neri) rispetto al α4YFP (cerchi vuoti).

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nikon+C1si+combines+high+spectral+resolution,+high+sensitivity,+and+high+acquisition+speed.">The Nikon C1si combines high spectral resolution, high sensitivity, and high acquisition speed.</a> Cytometry A. 69, 825-8234 (2006).</li><li>Melvin, N. R., Sutherland, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+caveats+of+standard+immunohistochemical+procedures:+implications+for+optical+disector-based+designs.">Quantitative caveats of standard immunohistochemical procedures: implications for optical disector-based designs.</a> J. Histochem. Cytochem. 58, 577-5784 (2010).</li><li>Jones, I. W., Wonnacott, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+doesn't+nicotinic+ACh+receptor+immunoreactivity+knock+out.">Why doesn't nicotinic ACh receptor immunoreactivity knock out.</a> Trends Neurosci. 28, 343-345 (2005).</li><li>Moser, N., Mechawar, N., Jones, I., Gochberg-Sarver, A., Orr-Urtreger, A., Plomann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+suitability+of+nicotinic+acetylcholine+receptor+antibodies+for+standard+immunodetection+procedures.">Evaluating the suitability of nicotinic acetylcholine receptor antibodies for standard immunodetection procedures.</a> J. Neurochem. , (2007).</li><li>Whiteaker, P., Cooper, J. F., Salminen, O., Marks, M. J., McClure-Begley, T. D., Brown, R. W., Collins, A. C., Lindstrom, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolabeling+demonstrates+the+interdependence+of+mouse+brain+a4+and+b2+nicotinic+acetylcholine+receptor+subunit+expression.">Immunolabeling demonstrates the interdependence of mouse brain a4 and b2 nicotinic acetylcholine receptor subunit expression.</a> The Journal of Comparative Neurology. 499, 1016-1038 (2006).</li><li>Marks, M. J., McClure-Begley, T. D., Whiteaker, P., Salminen, O., Brown, R. W. B., Cooper, J., Collins, A. C., Lindstrom, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+nicotinic+acetylcholine+receptor+protein+underlies+chronic+nicotine-induced+up-regulation+of+nicotinic+agonist+binding+sites+in+mouse+brain.">Increased nicotinic acetylcholine receptor protein underlies chronic nicotine-induced up-regulation of nicotinic agonist binding sites in mouse brain.</a> The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. , 337-3187 (2011).</li><li>Marks, M. J., Rowell, P. P., Cao, J. Z., Grady, S. R., McCallum, S. E., Collins, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subsets+of+acetylcholine-stimulated+86[Rb]++efflux+and+125[I]-epibatidine+binding+sites+in+C57BL/6+mouse+brain+are+differentially+affected+by+chronic+nicotine+treatment.">Subsets of acetylcholine-stimulated 86[Rb]+ efflux and 125[I]-epibatidine binding sites in C57BL/6 mouse brain are differentially affected by chronic nicotine treatment.</a> Neuropharmacology. 46, 1141-1157 (2004).</li><li>King, S. L., Caldarone, B. J., Picciotto, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta2-subunit-containing+nicotinic+acetylcholine+receptors+are+critical+for+dopamine-dependent+locomotor+activation+following+repeated+nicotine+administration.">Beta2-subunit-containing nicotinic acetylcholine receptors are critical for dopamine-dependent locomotor activation following repeated nicotine administration.</a> Neuropharmacology. 47, 132-139 (2004).</li><li>Robinson, S. F., Marks, M. J., Collins, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inbred+mouse+strains+vary+in+oral+self-selection+of+nicotine.">Inbred mouse strains vary in oral self-selection of nicotine.</a> Psychopharmacology (Berl). 124, 332-339 (1996).</li><li>Sparks, J. A., Pauly, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+continuous+oral+nicotine+administration+on+brain+nicotinic+receptors+and+responsiveness+to+nicotine+in+C57Bl/6+mice.">Effects of continuous oral nicotine administration on brain nicotinic receptors and responsiveness to nicotine in C57Bl/6 mice.</a> Psychopharmacology (Berl). , 141-145 (1999).</li><li>Rahman, S., Zhang, J., Engleman, E. A., Corrigall, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroadaptive+changes+in+the+mesoaccumbens+dopamine+system+after+chronic+nicotine+self-administration:+a+microdialysis+study.">Neuroadaptive changes in the mesoaccumbens dopamine system after chronic nicotine self-administration: a microdialysis study.</a> Neuroscience. 129, 415-4124 (2004).</li><li>Picciotto, M. R., Zoli, M., Rimondini, R., Lena, C., Marubio, L. M., Pich, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylcholine+receptors+containing+the+Î²2+subunit+are+involved+in+the+reinforcing+properties+of+nicotine.">Acetylcholine receptors containing the Î²2 subunit are involved in the reinforcing properties of nicotine.</a> Nature. 391, 173-177 (1998).</li><li>Fowler, C. D., Lu, Q., Johnson, P. M., Marks, M. J., Kenny, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Habenular+&#945;5+nicotinic+receptor+subunit+signalling+controls+nicotine+intake.">Habenular &#945;5 nicotinic receptor subunit signalling controls nicotine intake.</a> Nature. 471, 597-601 (2011).</li><li>Maskos, U., Molles, B. E., Pons, S., Besson, M., Guiard, B. P., Guilloux, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+reinforcement+and+cognition+restored+by+targeted+expression+of+nicotinic+receptors.">Nicotine reinforcement and cognition restored by targeted expression of nicotinic receptors.</a> Nature. 436, 103-107 (2005).</li><li>Matta, S. G., Balfour, D. J., Benowitz, N. L., Boyd, R. T., Buccafusco, J. J., Caggiula, A. R., Craig, C. R., Collins, A. C., Damaj, M. I., Donny, E. C., Gardiner, P. S., Grady, S. R., Heberlein, U., Leonard, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+on+nicotine+dose+selection+for+in+vivo+research.">Guidelines on nicotine dose selection for in vivo research.</a> Psychopharmacology. 190, 269-319 (2007).</li><li>Lang, T., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+clusters+at+nanoscale+resolution:+more+than+pretty+pictures.">Membrane protein clusters at nanoscale resolution: more than pretty pictures.</a> Physiology (Bethesda). 25, 116-1124 (2010).</li></ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

<p class="jove_content"&gt; L&#39;uso di un recettore fluorescente in un knock-in modello di topo per determinare la quantità e la localizzazione di un canale ionico specifico fornisce un certo numero di vantaggi. In contrasto con proteine ​​come actina, che è ubiquitariamente espresso in tutte le cellule, canali ionici sono presenti in numero molto inferiore e la loro espressione varia tra sottotipi neuronali rendendo accurata analisi mediante tradizionali tecniche immunoistochimiche impegnativi. Il prodotto genico α4YFP è espressa a l...

<table border="1"><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> mini-pompe osmotiche </td><td> Alzet </td><td> modello 2002 </td><td></td></tr><tr><td> salino </td><td> Teknova </td><td> S5819 </td><td></td></tr><tr><td> (-)-Nicotina idrogeno sale tartrato </td><td> Sigma </td><td> N5260 </td><td></td></tr><tr><td> colliri </td><td> Novartis </td><td> Tear-Gel </td><td></td></tr><tr><td> Vetbond colla </td><td> 3M </td><td> 1469SB </td><td></td></tr><tr><td> sale di sodio eparina </td><td> Sigma </td><td> H4784 </td><td></td></tr><tr><td> 10x PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 70011 </td><td></td></tr><tr><td> ketamina </td><td> Wyeth Animal Health </td><td> 0856-4403-01 </td><td></td></tr><tr><td> medatomidine cloridrato </td><td> Pfizer </td><td> 1950673 </td><td></td></tr><tr><td> 23G farfalla ago </td><td> Becton Dickinson </td><td> 367253 </td><td></td></tr><tr><td> paraformaldeide </td><td> Scienze della microscopia elettronica </td><td> 15710 </td><td></td></tr><tr><td> embedding stampi in plastica </td><td> VWR </td><td> 18986-1 </td><td></td></tr><tr><td> Ottobre Compound di montaggio </td><td> Tissue-Tek </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Mowiol 4-88 </td><td> EMD-Calbiochem </td><td> 475904 </td><td> pH 8,5 </td></tr></table>

spectral confocal imaging of fluorescently tagged nicotinic receptors in knock-in mice with chronic nicotine administration

Ligand-canali ionici nel sistema nervoso centrale (CNS) sono coinvolti in numerose condizioni con gravi conseguenze mediche e sociali. Per esempio, la dipendenza da nicotina tramite il fumo di tabacco è la principale causa di morte prematura in tutto il mondo (World Health Organization) ed è probabilmente causato da un&#39;alterazione della distribuzione dei canali ionici nel cervello 1. L&#39;esposizione cronica alla nicotina sia nei roditori e nell&#39;uomo i risultati in aumento del numero di recettori nicotinici dell&#39;acetilcolina (nAChR) nei tessuti cerebrali 1-3. Allo stesso modo, alterazioni nei glutamatergici GluN1 o GluA1 canali sono stati implicati nello scatenare sensibilizzazione ad altre sostanze stupefacenti come la cocaina, anfetamine e oppiacei 4-6. Di conseguenza, la capacità di mappare e quantificare i modelli di distribuzione e di espressione di specifici canali ionici è di fondamentale importanza per comprendere i meccanismi della dipendenza. Lo studio del cervello specifica di un&#39;area efGli effetti di singoli farmaci è stata avanzata con l&#39;avvento di tecniche come ligandi radioattivi. Tuttavia, la bassa risoluzione spaziale di legame ligando radioattivo impedisce la possibilità di quantificare ligando canali ionici in specifici sottotipi di neuroni. Geneticamente codificati reporter fluorescenti, come ad esempio la proteina fluorescente verde (GFP) e le sue molte varianti di colore, hanno rivoluzionato il campo della biologia 7. Con tagging geneticamente un reporter fluorescente ad una proteina endogena è possibile visualizzare le proteine ​​in vivo 7-10. Un vantaggio di proteine ​​fluorescenti etichettatura con una sonda è l&#39;eliminazione dell&#39;uso di anticorpo, che hanno il problema della aspecificità e accessibilità alla proteina bersaglio. Abbiamo usato questa strategia per fluorescente nAChRs etichette, che hanno permesso lo studio di montaggio del recettore con Förster Resonance Energy Transfer (FRET) trasfettate in cellule in coltura 11. Più recentemente, abbiamo usato il Knock-in approccio alla topi ingegnere con giallo proteina fluorescente con tag a4 subunità nAChR (α4YFP), che consente una precisa quantificazione del recettore ex vivo a risoluzione submicrometer nei neuroni del SNC attraverso la microscopia confocale spettrale 12. Il mirata fluorescente knock-in mutazione è incorporato nel locus endogeno e sotto il controllo del suo promotore nativo, producendo normali livelli di espressione e regolazione del recettore rispetto ai recettori untagged nei topi di tipo selvatico. Il knock-in approccio può essere esteso per codificare fluorescente altri canali ionici e offre un approccio efficace di visualizzazione e quantificare i recettori nel SNC. In questo articolo descriviamo una metodologia per quantificare i cambiamenti nell&#39;espressione nAChR in specifici neuroni del sistema nervoso centrale dopo l&#39;esposizione cronica alla nicotina. I nostri metodi includono mini-pompa osmotica l&#39;impianto, la fissazione perfusione intracardiaca, imaging e analisi di fluorescenza tagged rec nicotinicosubunità eptor da α4YFP topi knock-in (Fig. 1). Abbiamo ottimizzato la tecnica di fissazione per minimizzare autofluorescenza da tissue.We cervello fisso descrivere in dettaglio la metodologia di immagini utilizzando un microscopio confocale spettrale in combinazione con un algoritmo lineare unmixing spettrale per sottrarre il segnale autofluoresent per ottenere con precisione α4YFP segnale di fluorescenza. Infine, mostrare i risultati di nicotina cronica indotta upregulation dei recettori α4YFP nel percorso perforante mediale dell&#39;ippocampo.

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Spectral Confocal Imaging of Fluorescently tagged Nicotinic Receptors in Knock-in Mice with Chronic Nicotine Administration

Abbiamo sviluppato una nuova tecnica di quantificazione dei recettori nicotinici dell&#39;acetilcolina cambiamenti all&#39;interno delle regioni subcellulari di sottotipi specifici di neuroni del sistema nervoso centrale per comprendere meglio i meccanismi della dipendenza da nicotina utilizzando una combinazione di approcci tra tagging proteina fluorescente del recettore con il knock-in approccio e spettrale confocale.

Spectral Imaging di fluorescenza confocale tag recettori nicotinici a Knock-in topi con la somministrazione cronica alla nicotina

Ligand-gated ion channels in the central nervous system (CNS) are implicated in numerous conditions with serious medical and social consequences.  For ...

spectral-confocal-imaging-fluorescently-tagged-nicotinic-receptors

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.4K Views.  University of Victoria. Abbiamo sviluppato una nuova tecnica di quantificazione dei recettori nicotinici dell'acetilcolina cambiamenti all'interno delle regioni subcellulari di sottotipi specifici di neuroni del sistema nervoso centrale per comprendere meglio i meccanismi della dipendenza da nicotina utilizzando una combinazione di approcci tra tagging proteina fluorescente del recettore con il knock-in approccio e spettrale confocale.

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Subcutaneous Administration of Muscarinic Antagonists and Triple-Immunostaining of the Levator Auris Longus Muscle in Mice

Hind limb muscles of rodents, such as gastrocnemius and tibialis anterior, are frequently used for in vivo pharmacological studies of the signals essential for the formation and maintenance of mammalian NMJs. However, drug penetration into these muscles after subcutaneous or intramuscular administration is often incomplete or uneven and many NMJs can remain unaffected. Although systemic administration with devices such as mini-pumps can improve the spatiotemporal effects, the invasive nature of this approach can cause confounding inflammatory responses and/or direct muscle damage. Moreover, complete analysis of the NMJs in a hind limb muscle is challenging because it requires time-consuming serial sectioning and extensive immunostaining. 
The mouse LAL is a thin, flat sheet of muscle located superficially on the dorsum of the neck. It is a fast-twitch muscle that functions to move the pinna. It contains rostral and caudal portions that originate from the midline of the cranium and extend laterally to the cartilaginous portion of each pinna. The muscle is supplied by a branch of the facial nerve that projects caudally as it exits the stylomastoid foramen. We and others have found LAL to be a convenient preparation that offers advantages for the investigation of both short and long-term in vivo effects of drugs on NMJs and muscles. First, its superficial location facilitates multiple local applications of drugs under light anesthesia. Second, its thinness (2-3 layers of muscle fibers) permits visualization and analysis of almost all the NMJs within the muscle. Third, the ease of dissecting it with its nerve intact together with the pattern of its innervation permits supplementary electrophysiological analysis in vitro9,5. Last, and perhaps most importantly, a small applied volume (&tilde;50&mu;l) easily covers the entire muscle surface, provides a uniform and prolonged exposure of all its NMJs to the drug and eliminates the need for a systemic approach1,8.

We describe procedures for repeated administration of inhibitors of muscarinic signaling to the levator auris longus (LAL) muscle of young adult mice and for subsequent immunostaining of its neuromuscular junctions (NMJs) in wholemounts. The LAL muscle has unique advantages for revealing in vivo pharmacological effects on NMJs.

Somministrazione sottocutanea di antagonisti muscarinici e Triple-immunocolorazione del lungo muscolo elevatore Auris in topi

Hind limb muscles of rodents, such as gastrocnemius and tibialis anterior, are frequently used for in vivo  pharmacological studies of the signals ...

Ricerca

Neuroscienze

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the precise molecular steps as well as the activity of specific neurons in multi-functional nuclei of brain areas such as the hypothalamus remain. This problem includes identification of the molecular components involved in the regulation of various neurohormone signal transduction cascades. Elevations of intracellular Ca2+ play an important role in regulating the sensitivity of neurons, both at the level of signal transduction and at synaptic sites.
New tools have emerged to help identify neurons in the myriad of brain neurons by expressing green fluorescent protein (GFP) under the control of a particular promoter. To monitor both spatially and temporally stimulus-induced Ca2+ responses in GFP-tagged neurons, a non-green fluorescent Ca2+ indicator dye needs to be used. In addition, confocal microscopy is a favorite method of imaging individual neurons in tissue slices due to its ability to visualize neurons in distinct planes of depth within the tissue and to limit out-of-focus fluorescence. The ratiometric Ca2+ indicator fura-2 has been used in combination with GFP-tagged neurons1. However, the dye is excited by ultraviolet (UV) light. The cost of the laser and the limited optical penetration depth of UV light hindered its use in many laboratories. Moreover, GFP fluorescence may interfere with the fura-2 signals2. Therefore, we decided to use a red fluorescent Ca2+ indicator dye. The huge Stokes shift of fura-red permits multicolor analysis of the red fluorescence in combination with GFP using a single excitation wavelength. We had previously good results using fura-red in combination with GFP-tagged olfactory neurons3. The protocols for olfactory tissue slices seemed to work equally well in hypothalamic neurons4. Fura-red based Ca2+ imaging was also successfully combined with GFP-tagged pancreatic &beta;-cells and GFP-tagged receptors expressed in HEK cells5,6. A little quirk of fura-red is that its fluorescence intensity at 650 nm decreases once the indicator binds calcium7. Therefore, the fluorescence of resting neurons with low Ca2+ concentration has relatively high intensity. It should be noted, that other red Ca2+-indicator dyes exist or are currently being developed, that might give better or improved results in different neurons and brain areas.

In this protocol, we update recent progress in imaging Ca2+ signals of GFP-tagged neurons in brain tissue slices using a red fluorescent Ca2+ indicator dye.

Calcio Risposte imaging in neuroni GFP-tagged fette di cervello di topo ipotalamici

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) is an important mechanism for neuromodulation by acetylcholine (ACh). The difficulty with access to probing the signaling mechanisms within intact axons and at nerve terminals both in vitro and in vivo has limited progress in the study of the pre-synaptic components of synaptic plasticity. Here we introduce a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal (vHipp)&#8211;accumbens (nAcc) circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze both the pre- and post-synaptic components of transmission while selectively varying the genetic profile of the pre- vs post-synaptic neurons. We demonstrate that projections from vHipp microslices, as pre-synaptic axonal input, form multiple, reliable glutamatergic synapses with post-synaptic targets, the dispersed neurons from nAcc. The pre-synaptic localization of various subtypes of nAChRs are detected and the pre-synaptic nicotinic signaling mediated synaptic transmission are monitored by concurrent electrophysiological recording and live cell imaging. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of glutamatergic synaptic plasticity in vitro.

We developed a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal &#8211; accumbens circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze presynaptic mechanisms of nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) mediated synaptic transmission. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of synaptic plasticity.

Immagini dal vivo di nicotina indotta segnalazione Calcio e neurotrasmettitori uscita Lungo ventrali Hippocampal assoni

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA receptors (NMDARs) and AMPA receptors (AMPARs). Physiological data have indicated that glutamate receptors at RGCs are expressed not only in postsynaptic but also in perisynaptic or extrasynaptic membrane compartments. However, precise anatomical locations for glutamate receptors at RGC synapses have not been determined. Although a high-resolution quantitative analysis of glutamate receptors at central synapses is widely employed, this approach has had only limited success in the retina. We developed a postembedding immunogold method for analysis of membrane receptors, making it possible to estimate the number, density and variability of these receptors at retinal ribbon synapses. Here we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of retinal fixation, 2) freeze-substitution, 3) postembedding immunogold electron microscope (EM) immunocytochemistry and, 4) quantitative visualization of glutamate receptors at ribbon synapses.

The postembedding immunogold method is one of the most effective ways to provide high-resolution analyses of the subcellular localization of specific molecules. Here we describe a protocol to quantitatively analyze glutamate receptors at retinal ribbon synapses.

Risoluzione alta analisi quantitativa Immunogold di Recettori di membrana a retina nastro Sinapsi

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Quantifying Infra-slow Dynamics of Spectral Power and Heart Rate in Sleeping Mice

Three vigilance states dominate mammalian life: wakefulness, non-rapid eye movement (non-REM) sleep, and REM sleep. As more neural correlates of behavior are identified in freely moving animals, this three-fold subdivision becomes too simplistic. During wakefulness, ensembles of global and local cortical activities, together with peripheral parameters such as pupillary diameter and sympathovagal balance, define various degrees of arousal. It remains unclear the extent to which sleep also forms a continuum of brain states-within which the degree of resilience to sensory stimuli and arousability, and perhaps other sleep functions, vary gradually-and how peripheral physiological states co-vary. Research advancing the methods to monitor multiple parameters during sleep, as well as attributing to constellations of these functional attributes, is central to refining our understanding of sleep as a multifunctional process during which many beneficial effects must be executed. Identifying novel parameters characterizing sleep states will open opportunities for novel diagnostic avenues in sleep disorders.
We present a procedure to describe dynamic variations of mouse non-REM sleep states via the combined monitoring and analysis of electroencephalogram (EEG)/electrocorticogram (ECoG), electromyogram (EMG), and electrocardiogram (ECG) signals using standard polysomnographic recording techniques. Using this approach, we found that mouse non-REM sleep is organized into cycles of coordinated neural and cardiac oscillations that generate successive 25-s intervals of high and low fragility to external stimuli. Therefore, central and autonomic nervous systems are coordinated to form behaviorally distinct sleep states during consolidated non-REM sleep. We present surgical manipulations for polysomnographic (i.e., EEG/EMG combined with ECG) monitoring to track these cycles in the freely sleeping mouse, the analysis to quantify their dynamics, and the acoustic stimulation protocols to assess their role in the likelihood of waking up. Our approach has already been extended to human sleep and promises to unravel common organizing principles of non-REM sleep states in mammals.

Here, we present experimental and analytical procedures to describe the temporal dynamics of the neural and cardiac variables of non-REM sleep in mice, which modulate sleep responsiveness to acoustic stimuli.

Quantificare la dinamica infrarosso del potere spettrale e della frequenza cardiaca nei topi addormentati

Three vigilance states dominate mammalian life: wakefulness, non-rapid eye movement (non-REM) sleep, and REM sleep. As more neural correlates of behavior ...

Automated Gait Analysis in Mice with Chronic Constriction Injury

The von Frey test is a classical method that has been widely used to examine the sensory function of neuropathic pain animals. However, it has some disadvantages such as subjective data and the requirement of a skilled, experienced experimenter. To date, a variety of modifications have improved the von Frey method, but it still has a few limitations. Recent reports have suggested that gait analysis produces more accurate and objective data from the neuropathic animals. This protocol demonstrates how to perform the automated gait analysis to determine the degree of neuropathic pain in mice. After several days of acclimation, the mice were allowed to walk freely on the glass floor to illuminate footprints. Then, quantification of the footprints and gait were performed through video clips with automatic analysis of various walking parameters, such as area of paw print, swing time, angle of paw, etc.
The main purpose of this study is to describe the methodology of automated gait analysis and briefly compare it with data from the classical sensory test using von Frey filament.

The precise assessment of pain response in a neuropathic animal model is critical to investigate the pathophysiology of pain diseases and develop new analgesics. We present a sensitive and objective method to determine the sensory function of the rodent hind paw by an automated gait analysis system.

Analisi automatizzata di andatura in topi con lesione da costrizione cronica

The von Frey test is a classical method that has been widely used to examine the sensory function of neuropathic pain animals. However, it has some ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains brain homeostasis. The principal sites of the barrier are endothelial cells of the brain capillaries whose barrier function results from tight intercellular junctions and efflux transporters expressed on the plasma membrane. This function is regulated by pericytes and astrocytes that together form the neurovascular unit (NVU). Several neurological diseases such as stroke, Alzheimer&#39;s disease (AD), brain tumors are associated with an impaired BBB function. Assessment of the BBB permeability is therefore crucial in evaluating the severity of the neurological disease and the success of the treatment strategies employed.
We present here a simple yet robust permeability assay that have been successfully applied to several mouse models both, genetic and experimental. The method is highly quantitative and objective in comparison to the tracer fluorescence analysis by microscopy that is commonly applied. In this method, mice are injected intraperitoneally with a mix of aqueous inert fluorescent tracers followed by anesthetizing the mice. Cardiac perfusion of the animals is performed prior to harvesting brain, kidneys or other organs. Organs are homogenized and centrifuged followed by fluorescence measurement from the supernatant. Blood drawn from the cardiac puncture just before perfusion serves for normalization purpose to the vascular compartment. The tissue fluorescence is normalized to the wet weight and serum fluorescence to obtain a quantitative tracer permeability index. For additional confirmation, the contralateral hemi-brain preserved for immunohistochemistry can be utilized for tracer fluorescence visualization purposes.

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Here we present a mouse brain vascular permeability assay using intraperitoneal injection of fluorescent tracers followed by perfusion that is applicable to animal models of blood-brain barrier dysfunction. One hemi-brain is used for assessing permeability quantitatively and the other for tracer visualization/immunostaining. The procedure takes 5 - 6 h for 10 mice.

In Vivo barriera emato - encefalica permeabilità saggio nei topi utilizzando fluorescente etichettati traccianti

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

In a mammalian nervous system, myelin provides an electrical insulation by enwrapping the axon fibers in a multilayered spiral. Inspired by its highly-organized subcellular architecture, we recently developed a new imaging modality, named spectral reflectometry (SpeRe), which enables unprecedented label-free nanoscale imaging of the live myelinated axons in situ. The underlying principle is to obtain nanostructural information by analyzing the reflectance spectrum of the multilayered subcellular structure. In this article, we describe a detailed step-by-step protocol for performing a basic SpeRe imaging of the nervous tissues using a commercial confocal microscopic system, equipped with a white-light laser and a tunable filter. We cover the procedures of sample preparation, acquisition of spectral data, and image processing for obtaining nanostructural information.

Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

Here, we present a step-by-step protocol for imaging myelinated axons in a fixed brain slice using a label-free nanoscale imaging technique based on spectral reflectometry.

Microscopia spettrale riflettometrica su assoni Myelinated In Situ

In a mammalian nervous system, myelin provides an electrical insulation by enwrapping the axon fibers in a multilayered spiral. Inspired by its ...

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal dysfunction and loss. Fluorescence-based imaging tools and technologies enable unprecedented analysis of subcellular neurobiological processes, yet there is still a need for unbiased, reproducible, and accessible approaches for extracting quantifiable data from imaging studies. We have developed a simple and adaptable workflow to extract quantitative data from fluorescence-based imaging studies using Drosophila models of neurodegeneration. Specifically, we describe an easy-to-follow, semi-automated approach using Fiji/ImageJ to analyze two cellular processes: first, we quantify protein aggregate content and profile in the Drosophila optic lobe using fluorescent-tagged mutant huntingtin proteins; and second, we assess autophagy-lysosome flux in the Drosophila visual system with ratiometric-based quantification of a tandem fluorescent reporter of autophagy. Importantly, the protocol outlined here includes a semi-automated segmentation step to ensure all fluorescent structures are analyzed to minimize selection bias and to increase resolution of subtle comparisons. This approach can be extended for the analysis of other cell biological structures and processes implicated in neurodegeneration, such as proteinaceous puncta (stress granules and synaptic complexes), as well as membrane-bound compartments (mitochondria and membrane trafficking vesicles). This method provides a standardized, yet adaptable reference point for image analysis and quantification, and could facilitate reliability and reproducibility across the field, and ultimately enhance mechanistic understanding of neurodegeneration.

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

We have developed a simple and adaptable workflow to extract quantitative data from fluorescence-imaging-based cell biological studies of protein aggregation and autophagic flux in the central nervous system of Drosophila models of neurodegeneration.

Biologia cellulare quantitativa della neurodegenerazione in Drosophila attraverso analisi imparziale delle proteine fluorescente contrassegnate usando ImageJ

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal ...

Probing Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices via Laser Flash Photolysis of Photoactivatable Nicotine

Acetylcholine (ACh) acts through receptors to modulate a variety of neuronal processes, but it has been challenging to link ACh receptor function with subcellular location within cells where this function is carried out. To study the subcellular location of nicotinic ACh receptors (nAChRs) in native brain tissue, an optical method was developed for precise release of nicotine at discrete locations near neuronal membranes during electrophysiological recordings. Patch-clamped neurons in brain slices are filled with dye to visualize their morphology during 2-photon laser scanning microscopy, and nicotine uncaging is executed with a light flash by focusing a 405 nm laser beam near one or more cellular membranes. Cellular current deflections are measured, and a high-resolution three-dimensional (3D) image of the recorded neuron is made to allow reconciliation of nAChR responses with cellular morphology. This method allows for detailed analysis of nAChR functional distribution in complex tissue preparations, promising to enhance the understanding of cholinergic neurotransmission.

This article presents a method for studying nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) in mouse brain slices by nicotine uncaging. When coupled with simultaneous patch clamp recording and 2-photon laser scanning microscopy, nicotine uncaging connects nicotinic receptor function with cellular morphology, providing a deeper understanding of cholinergic neurobiology.

Funzione del recettore nicotinico dell'acetilcolina in fettine di cervello del Mouse tramite Laser fotolisi di nicotina fuse di sondaggio

Acetylcholine (ACh) acts through receptors to modulate a variety of neuronal processes, but it has been challenging to link ACh receptor function with ...